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문제 정의
- 특히 TCP는 생체적합성이 매우 우수하여 골 충진제의 주성분으로 활용되어 왔으며'58) PMMA의 첨가량에 따른 다공질 소결체를 제조하였다. 본연구에서는 골 충진제로서의 PMMA의 첨가량에 따른 미세조직과 이들 다공질 p-TCP 소결체의 생체적합성을 평가하기 위하여 MTT 법 및 MG-63 뼈모세포와 Raw 264.7 파골세포를 사용하여 미세조직 유착과 성장 거동을 관찰하였다.
제안 방법
- 기공률이 증가함에 따른 용이한 다공질 소결체를 제조함에 앞서 HAp 분말과 성형보조제인 polyethylene glycol(PEG, Dusan Chemi, Korea)를 5 wt.% 사용하여 밀폐용기 내에 알콜을 첨가하여 24시간동안 알루미나 볼을 이용하여 습식볼밀을 수행한 후 건조단계를 거쳤다. 다공질 기지 체로 사용되는 상기의 HAp 혼합분말과 기공형성제인 PMMA 분말을 각각 30, 40, 50, 60 vol.
- 3일 동안 배양된 MG-63 뼈모세포의 배양액에 100의 MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma) 용액 (5 mg/ml in PBS, Sigma M2128)을 첨 가시 켜 4시 간 동안 배 양한 후 2001 의 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 넣어 반응을 억제시켜 MTT 법에 의해 살아있는 세포수를 측정하였다. 또한 다공질 p-TCP 소결체에서의 MG-63 뼈모세포와 Raw 264.
- 6은 1500℃에서 소결한 다공질 P-TCP 소결체 용출액을 희석하여 배양한 MG-63 뼈모세포의 세포수를 측정한 그래프이다. MG-63 뼈모세포를 다공질 P-TCP 추출액을 희석한 배양배지에 첨가하여 3일 동안 배양한 후 MTT 법을 사용하여 살아있는 세포 수를 측정하였고, 단층 배양된 세포는 트립신-EDTA를 처리한 후 tryphan blueS. 염색하여 haemocytometer를 이용하여 생존하고 있는 세포수를 측정하여 MTT 법에 의해 측정된 세포 수와 비교하여 보정하였다.
- 7 파골세포들을 24-well 배양 용기에 5 x 103 세포를 넣어 24시간 동안 배양하였다. 그리고 0.1 M PBS 완충용액(pH 7.2)으로 세 차례 수세한 후 배양배지로 103-106 배로 희석된 다공질 p-TCP 소결체를 첨가 한 후 10 일 동안 10% 우혈청 (FBS, #SH30088, Hyclone)과 항생제 (antibiotic-antimycotic solution, #15240-062, Gibco) 가포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양시켰다. 상기의 대조군으로는 다공질 p-TCP 소결체가 첨가되지 않은 배양배지에서 자란 뼈모세포와 파골세포를 금 코팅을 한 후 주사전자현미경(SEM, JSM-541-LV, Jeol)으로 비교 관찰하였다.
- 소결 시 조건은 1500℃ (heating rate = 6℃/min)로 공기 중의 전기로에서 2시간 동안 수행되었다. 기공형성제인 PMMA에 따른 소결체의 미세조직 변화와 파단면 및 소결 온도에 따른 결정상 분석은 주사전자현미경 (FE-SEM, JSM-635F, Jeol, Japan) 과 X-선 회절분석기(XRD, D/MAX-250, Rigaku, Japan) 을 이용하여 분석하였다. 또한 상대밀도는 아르키메데스 법을 이용하여 측정하였다.
- % 사용하여 밀폐용기 내에 알콜을 첨가하여 24시간동안 알루미나 볼을 이용하여 습식볼밀을 수행한 후 건조단계를 거쳤다. 다공질 기지 체로 사용되는 상기의 HAp 혼합분말과 기공형성제인 PMMA 분말을 각각 30, 40, 50, 60 vol.%로 알루미나 볼을 사용하여 24시간동안 밀폐용기 내에서 건식볼밀로 균일하게 혼합하였다.
- 3일 동안 배양된 MG-63 뼈모세포의 배양액에 100의 MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma) 용액 (5 mg/ml in PBS, Sigma M2128)을 첨 가시 켜 4시 간 동안 배 양한 후 2001 의 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 넣어 반응을 억제시켜 MTT 법에 의해 살아있는 세포수를 측정하였다. 또한 다공질 p-TCP 소결체에서의 MG-63 뼈모세포와 Raw 264.7 파골세포의 성장 거동 및 형태학적 소견 관찰을 위해 0.025% trypsin-EDTA(pH 7.2) 용액을 처리한 MG-63 뼈모세포와 Raw 264.7 파골세포들을 24-well 배양 용기에 5 x 103 세포를 넣어 24시간 동안 배양하였다. 그리고 0.
- 본 연구에서는 초기 원료 분말로 HAp 분말과 기공 형성제인 PMMA를 사용하여 탈지 후 소결온도변수에 따라 다공질 소결체를 제조하였다. 볼밀에 의해서 기지체 HAp 분말에 PMMA 입자가 잘 분산된 성형체를 제조할 수 있었으며 탈지와 소결 처리 후 PMMA가 완전하게 제거됨을 알 수 있었다.
- 2)으로 세 차례 수세한 후 배양배지로 103-106 배로 희석된 다공질 p-TCP 소결체를 첨가 한 후 10 일 동안 10% 우혈청 (FBS, #SH30088, Hyclone)과 항생제 (antibiotic-antimycotic solution, #15240-062, Gibco) 가포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양시켰다. 상기의 대조군으로는 다공질 p-TCP 소결체가 첨가되지 않은 배양배지에서 자란 뼈모세포와 파골세포를 금 코팅을 한 후 주사전자현미경(SEM, JSM-541-LV, Jeol)으로 비교 관찰하였다.
- 세포독성을 확인하기 위한 세포의 성장 거동 및 형태학적 변화는 PMMA를 이용하여 제작된 다공성 P-TCP 골충진제를 1 g/ml의 비율로 세포 배양 배지로 첨가하여 37에서 72시간 용출하여 얻은 용출액을 희석하여 사용하였다. 3일 동안 배양된 MG-63 뼈모세포의 배양액에 100의 MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma) 용액 (5 mg/ml in PBS, Sigma M2128)을 첨 가시 켜 4시 간 동안 배 양한 후 2001 의 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 넣어 반응을 억제시켜 MTT 법에 의해 살아있는 세포수를 측정하였다.
- MG-63 뼈모세포를 다공질 P-TCP 추출액을 희석한 배양배지에 첨가하여 3일 동안 배양한 후 MTT 법을 사용하여 살아있는 세포 수를 측정하였고, 단층 배양된 세포는 트립신-EDTA를 처리한 후 tryphan blueS. 염색하여 haemocytometer를 이용하여 생존하고 있는 세포수를 측정하여 MTT 법에 의해 측정된 세포 수와 비교하여 보정하였다. 저농도(25%)의 다공질 P-TCP 용출액을 첨가한 배지에서는 정상 배양배지에서 자란 뼈 모세포와 유사한 세포성장 거동을 나타내었다.
대상 데이터
- 따라서 본 연구에서는 다공질 P-TCP 소결체를 제조하기 위하여 골 시멘트에 사용되고 있는 PMMA 생체고분자를 탈지 및 소결 공정 간에 인체 무해한 기공 형성제로 사용하였다. 특히 TCP는 생체적합성이 매우 우수하여 골 충진제의 주성분으로 활용되어 왔으며'58) PMMA의 첨가량에 따른 다공질 소결체를 제조하였다.
- 본 연구에는 다공질 P-TCP 소결체를 제조하기 위하여 평균 입자크기가 10-15 pm의 상용 HAp 분말(Stream Chemical, USA)과 기공형성제로 약 200-250의 입자크기를 갖는 polymethyl methaciylate(PMMA, LG MMA, Korea) 분말을 초기 재료로 사용하였다. 기공률이 증가함에 따른 용이한 다공질 소결체를 제조함에 앞서 HAp 분말과 성형보조제인 polyethylene glycol(PEG, Dusan Chemi, Korea)를 5 wt.
- %로 알루미나 볼을 사용하여 24시간동안 밀폐용기 내에서 건식볼밀로 균일하게 혼합하였다. 이 균일한 혼합물을 일축압축기에 장입시켜서 디스크형태(15x5 mm)의 성형체를 제작하였다. 이들 성형체는 튜브로에서 700℃(heating rate = 6℃/min) 의온도 범위로 공기 중에 2시간 동안 탈지처리를 하여 유기 결합제인 PMMA를 제거하였다.
이론/모형
- 또한 상대밀도는 아르키메데스 법을 이용하여 측정하였다. 그리고 탄성계수 및 굽힘 강도는 탄성계수측정, 만능시험기 (UnitechTM, R&B, Korea) 를 이용하여 4점 곡강도 법으로 측정하였으며 소결체의 경도는 비커스경도계 (Akashi. HV-112, Japan)를 이용하여 1.0 Kg의 하중에 의해 측정하였다.
- 기공형성제인 PMMA에 따른 소결체의 미세조직 변화와 파단면 및 소결 온도에 따른 결정상 분석은 주사전자현미경 (FE-SEM, JSM-635F, Jeol, Japan) 과 X-선 회절분석기(XRD, D/MAX-250, Rigaku, Japan) 을 이용하여 분석하였다. 또한 상대밀도는 아르키메데스 법을 이용하여 측정하였다. 그리고 탄성계수 및 굽힘 강도는 탄성계수측정, 만능시험기 (UnitechTM, R&B, Korea) 를 이용하여 4점 곡강도 법으로 측정하였으며 소결체의 경도는 비커스경도계 (Akashi.
성능/효과
- 60 vol.% PMMA를 사용한 소결체 의밀도, 탄성계수, 굽힘 강도 및 경도는 각각 44.5%, 22.2 GPa, 5.1 MPa, 182Hv을 나타내었다.
- 7 파골세포의 SEM 이미지이다. Fig. 7의 실험방법과 동일한 방법으로 Raw 264.7 파골세포를 10일 동안 배양한 결과로 타원형의 돌기를 가진 파골세포들이 기공 내부로 활발히 증식되어 들어가는 것을 관찰할 수 있었고 이들 세포들은 MG-63 뼈모세포와는 다르게 서로 돌기로 연결되어 다층의 세포 구조를 형성하면서 기공을 채워 들어가고 있었다. 이상의 결과를 볼 때 PMMA를 사용하여 제작된 다공질 p-TCP 소결체가 뼈와 관련된 세포의 부착 및 성장에 적합한 생체친화성의 골충진제임을 확인하였다.
- 따라서 다공질 B-TCP 용출액의 농도가 증가함에 따라 뼈모세포의 성장거동이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그러나 일반적인 생체재료에 대한 세포 독성 평가에서 세포의 생존율이 대조군에 비해 70% 이상일 경우에 생체적합성이 우수하다고 평가되어지고 있 80%의 세포 생존률을 보여 본 연구에 이용된 p-TCP 소결체가 세포독성이 없는 생체소재로 확인되었다.
- 반면, 고농도(100%)의 다공질 P-TCP 용출액이 첨가된 배양 배지에서 성장한 세포는 대조군에 비해 약간 낮은 세포 성장을 나타내었다. 따라서 다공질 B-TCP 용출액의 농도가 증가함에 따라 뼈모세포의 성장거동이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그러나 일반적인 생체재료에 대한 세포 독성 평가에서 세포의 생존율이 대조군에 비해 70% 이상일 경우에 생체적합성이 우수하다고 평가되어지고 있 80%의 세포 생존률을 보여 본 연구에 이용된 p-TCP 소결체가 세포독성이 없는 생체소재로 확인되었다.
- 탈지 처리 후 다공질 HAp 성형체는 1500℃ 의 소결 처리에 의해 P-TCP 소결체로 완전히 상전이 되었다. 또한 PMMA의 첨가량이 증가함에 따라 기공 형성제의 necking 현상이 증가하여 폐기공과 개기공이 현저하게 증가되었다. 60 vol.
- 이는 기공형성제인 PMMA 가 탈지와 소결과정을 거쳐 osteoconductibity에 영향을 미치는 개기공과 폐기공의 증가로 인한 것으로 판단된다. 또한 상대밀도의 감소로 인하여 탄성계수의 값은 PMMA 의 첨가량에 따라 48.7 GPa에서 최소 22.2 GPa의 값으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 이와 같은 상대 밀도와 탄성계수는 높은 기공률에 기인하여 생체세라믹에서 고려해야 할 중요한 인자인 저탄성계수를 나타내며 본연구의 결과는 천연뼈의 탄성계수값(10-30 GPa)과 유사한 범위임을 알 수 있다.
- 소결체를 제조하였다. 볼밀에 의해서 기지체 HAp 분말에 PMMA 입자가 잘 분산된 성형체를 제조할 수 있었으며 탈지와 소결 처리 후 PMMA가 완전하게 제거됨을 알 수 있었다. 제조된 다공질체의 평균 기공 크기는 생체활성 특성에 유용한 크기인 200-250 |im 임이 관찰되었다.
- 7 파골세포를 10일 동안 배양한 결과로 타원형의 돌기를 가진 파골세포들이 기공 내부로 활발히 증식되어 들어가는 것을 관찰할 수 있었고 이들 세포들은 MG-63 뼈모세포와는 다르게 서로 돌기로 연결되어 다층의 세포 구조를 형성하면서 기공을 채워 들어가고 있었다. 이상의 결과를 볼 때 PMMA를 사용하여 제작된 다공질 p-TCP 소결체가 뼈와 관련된 세포의 부착 및 성장에 적합한 생체친화성의 골충진제임을 확인하였다.
- 2 GPa의 값으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 이와 같은 상대 밀도와 탄성계수는 높은 기공률에 기인하여 생체세라믹에서 고려해야 할 중요한 인자인 저탄성계수를 나타내며 본연구의 결과는 천연뼈의 탄성계수값(10-30 GPa)과 유사한 범위임을 알 수 있다.
- 볼밀에 의해서 기지체 HAp 분말에 PMMA 입자가 잘 분산된 성형체를 제조할 수 있었으며 탈지와 소결 처리 후 PMMA가 완전하게 제거됨을 알 수 있었다. 제조된 다공질체의 평균 기공 크기는 생체활성 특성에 유용한 크기인 200-250 |im 임이 관찰되었다. 탈지 처리 후 다공질 HAp 성형체는 1500℃ 의 소결 처리에 의해 P-TCP 소결체로 완전히 상전이 되었다.
후속연구
- 또 한다. 공질 p-TCP 소결체에 직접 배양된 MG-63 뼈모세포와 Raw 264.7 파골세포는 우수한 세포 부착 및 성장 거동을 보였고 세포 돌기를 이용하여 다공질 소결체 내부로 활발히 증식해 들어가는 것으로 보아 PMMA를 이용하여 제작된 다공성 p-TCP 소결체가 인체의 골 결손에 사용되는 골충제로의 응용 가능성을 보여주고 있다.
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