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문제 정의
- 이에 위내시경 조직 검체를 대상으로 hematoxylin과 eosin(H&E) 염색과 조직화학염색(Giemsa 염색, WarthinStarry 염색), 및 면역조직화학염색을 시행하여 보다 효과적이고 활용가치가 높은 H. pylori 염색법을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
제안 방법
- 0 citrate 완충액에 슬라이드를 넣고 cooker를 사용하여 microwave에 100℃에서 15분간 가열하였다. 내인성과산화 효소 억제방법으로 Hydrogen Peroxide Block®(LAB VISION, USA) 용액을 사용하여 45℃에서 5분간 반응 시킨 후 Tris 완충액으로 4회 세정하였다. 비특이 반응을 줄이기 위하여 Ultra V Block®(LAB VISION, USA) 용액으로 45℃에서 3분간 반응시킨 후 Tris 완충액에 4회세정하였다.
- 4% 함유된 마스크폼 2A®(Danakorea, korea)에 24시간 고정한 후 자동침투기를 이용하여 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 후 파라핀으로 포매 한 다음 4 μm 두께의 연속절편을 제작하여 유리 슬라이드에 부착 시킨 후 각각의 염색을 시행하였다. 단, 면역조직화학염색에서는 전 처리 과정에서의 조직표본의 탈락을 방지하기 위해 ProbeOnTM Plus Microscope slide®(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 조직 절편을 부착시켰다.
- 모든 환자에서 생검 조직을 formaldehyde가 7.4% 함유된 마스크폼 2A®(Danakorea, korea)에 24시간 고정한 후 자동침투기를 이용하여 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 후 파라핀으로 포매 한 다음 4 μm 두께의 연속절편을 제작하여 유리 슬라이드에 부착 시킨 후 각각의 염색을 시행하였다. 단, 면역조직화학염색에서는 전 처리 과정에서의 조직표본의 탈락을 방지하기 위해 ProbeOnTM Plus Microscope slide®(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 조직 절편을 부착시켰다.
- 위점막에서의 H. pylori 검출은 광학현미경 고배율 (×400)시야에서 Genta 분류법에 따라 H. pylori 검출률을 0에서 5까지 등급화 하였고(Table 1), 위염의 염증정도와 H. pylori 검출률과의 관계를 알아보기 위하여 위염의 조직학적 소견을 Sydney system에 의거하여 염증정도를 경도(mild), 중등도(moderate), 고도(severe)의 3등급으로 구분하였다.
- 일차항체인 Helicobacter Ab-1(LAB VISION, USA; 1:100)를 45℃에서 40분 반응시키고 Tris 완충액에 4회 세정한 후 1차 항체의 역가를 증가 시켜주고 Polymer-HRP®(LAB VISION, USA)가 1차 항체에 잘 침투 할 수 있도록 Primary Antibody Enhancer®(LAB VISION, USA) 용액을 45℃에서 15분 반응 시킨 후 Tris 완충액에 4회 세정하였다. 이차항체 반응으로 F(AB)2 fragment 에 HRP가 표지되어 있는 mouse IgG와 rabbit IgG antibody를 검출 할 수 있는 Polymer-HRP®(LAB VISION, USA) 용액을 이용하여 45℃에서 17분 반응 시킨 후 Tris 완충액으로 4회 세정한 다음 AEC 용액으로 실온에서 발색시킨 후 Tris 완충액으로 4회 세정하고 Gill's hematoxylin으로 1분간 대조염색하여 봉입하였으며, 면역조직화학염색에서는 위점막 상피 표면에 갈색으로 염색된 나선형 간균의 H. pylori 균체를 볼 수 있었다 (Fig. 4).
- 비특이 반응을 줄이기 위하여 Ultra V Block®(LAB VISION, USA) 용액으로 45℃에서 3분간 반응시킨 후 Tris 완충액에 4회세정하였다. 일차항체인 Helicobacter Ab-1(LAB VISION, USA; 1:100)를 45℃에서 40분 반응시키고 Tris 완충액에 4회 세정한 후 1차 항체의 역가를 증가 시켜주고 Polymer-HRP®(LAB VISION, USA)가 1차 항체에 잘 침투 할 수 있도록 Primary Antibody Enhancer®(LAB VISION, USA) 용액을 45℃에서 15분 반응 시킨 후 Tris 완충액에 4회 세정하였다. 이차항체 반응으로 F(AB)2 fragment 에 HRP가 표지되어 있는 mouse IgG와 rabbit IgG antibody를 검출 할 수 있는 Polymer-HRP®(LAB VISION, USA) 용액을 이용하여 45℃에서 17분 반응 시킨 후 Tris 완충액으로 4회 세정한 다음 AEC 용액으로 실온에서 발색시킨 후 Tris 완충액으로 4회 세정하고 Gill's hematoxylin으로 1분간 대조염색하여 봉입하였으며, 면역조직화학염색에서는 위점막 상피 표면에 갈색으로 염색된 나선형 간균의 H.
- 조직 절편을 xylene에서 탈파라핀하여 저농도의 알코올 과정을 거쳐 함수 한 후 헤마톡실린 용액(5분), 분별 및 청색화 과정을 거쳐 에오신 염색(1분)을 한 다음 탈수, 투명과정을 거쳐 봉입하였으며, H&E 염색에서는 위점막 상피 표면에 분홍색으로 염색된 나선형 간균의 H. pylori 균체를 볼 수 있었다(Fig. 1).
대상 데이터
- 본 연구는 2005년 10월부터 2006년 9월까지 전라북도 군산의료원에서 위내시경 검사를 시행하여 신속요소분해효소검사법에서 양성을 보이면서 조직검사에서 만성위염으로 진단받은 58 예를 대상으로 하였다.
- 본 연구에서도 위내시경을 통하여 얻은 위점막 조직에 대하여 H. pylori가 가지고 있는 다량의 요소분해효소의 성질을 이용한 신속요소분해효소검사법에서 양성을 보이면서 조직검사에서 만성위염으로 진단받은 58 예를 대상으로 하였다. 단, 신속요소분해효소검사법에 있어서 항생제나 비스무스제제와 같은 약물을 복용한 환자에서 균이 사멸할 수 있는 경우와 신속요소분해효소검사의 조작과정에서 검사자가 조직을 잘못 다룰 경우에 나타날 수 있는 위음성과 위양성, 그리고 동일 내시경 생검 검체의 연속절편을 제작하는 과정에서 H.
데이터처리
- 위염 정도에 따른 Warthin-Starry 염색상에서의 H. pylori 검출률과 균밀도와의 관계를 알아 보기위한 통계분석 (Ver. 12.0, SPSS INC., Chicago)으로 Chi-Square Test를 사용하였다.
이론/모형
- H. pylori에 대한 면역조직화학염색은 효소표지 중합체법을 이용하여 UltraVision LP Detection System®(LAB VISION, USA)에 따라 염색하였다. 조직절편을 부착시킨 슬라이드를 58℃ 건열멸균기에서 2시간 가열 처리 한 후 탈파라핀, 함수 과정을 실시 한 후 항원성 부활화를 위해 pH 6.
성능/효과
- Genta 분류법에 따라 H. pylori의 균밀도를 조사하여 검출률을 나타낸 결과 58 예의 염색표본 상에서 H. pylori 가 검출되지 않은 0등급은 5 예(8.6%)였으며, 검출된 1등급은 11 예(19.0%), 2등급은 22 예(37.9%), 3등급은 12 예 (20.7%)였다. 높은 균밀도의 4, 5등급에서는 각각 4 예 (6.
- Genta 분류법에 따라 H. pylori의 균밀도를 조사하여 검출률을 나타낸 결과 58 예의 염색표본 상에서 H. pylori 가 검출되지 않은 0등급은 7 예(12.1%)였으며, 검출된 1등급은 9 예(15.5%), 2등급은 18 예(31.0%), 3등급은 12예(20.7%)였다. 높은 균밀도의 4등급은 8 예(13.
- Genta 분류법에 따라 H. pylori의 균밀도를 조사하여 검출률을 나타낸 결과 58 예의 염색표본 상에서 H. pylori 가 검출되지 않은 음성군은 17 예였으며, 검출된 양성군은 41 예로 1등급은 17 예(29.3%), 2등급은 14 예(24.1%), 3등급은 7 예(12.1%)였다. 높은 균밀도의 4등급은 3 예 (5.
- Genta 분류법에 따라 H. pylori의 균밀도를 조사하여 검출률을 나타낸 결과 58 예의 염색표본 상에서 H. pylori 가 검출되지 않은 음성군은 23 예였으며, 검출된 양성군은 35 예로 1등급은 17 예(29.3%), 2등급은 14(24.1%), 3등급은 4(6.9%)였다. 그러나 높은 균밀도의 4, 5등급에서는 균체가 관찰되지 않았다.
- 그러나 본 연구에서는 이전 보고자들과 다르게 면역조직화학염색에 비해 조직화학염색인 Warthin-Starry와 Giemsa 염색에서 H. pylori의 검출률이 높게 나타났다. 이러한 결과는 면역조직화학염색의 경우 표본 상에서 H.
- 7%)였다. 높은 균밀도의 4등급은 8 예(13.8%), 5등급은 4 예(6.9%)를 나타냈으며, 이에 따른 H. pylori의 평균 균밀도는 2.29이었다(Table 2).
- 05). 또한 염증의 정도와 H. pylori의 균밀도와의 관계를 분석한 결과 Table4에서 보는 바와 같이 염증이 심할수록 H. pylori의 균밀도가 높아지는 경향을 나타내었다(p<0.05).
- 위염의 염증정도를 Sydney system에 따라 경도(mild), 중등도(moderate), 고도(severe)의 3등급으로 분류하여 Warthin-Starry 염색에 의한 H. pylori의 검출률과 비교한 결과 Table 3에서 보는바와 같이 경도 염증군(n=13)에서 61.5%, 중등도 염증군(n=21)에서 90.4%, 고도 염증군 (n=24)에서 100%로 염증의 정도가 높아질 수록 H. pylori 의 검출률이 높은 것으로 나타났다(p<0.05). 또한 염증의 정도와 H.
- 위의 염증 정도와 Warthin-Starry 염색법에 의한 H. pylori의 검출률 및 출현 균밀도를 조사한 결과 염증의 정도가 심할수록 H. pylori의 검출률 및 출현 균밀도가 증가하는 것을 알 수 있었고, 이는 다른 연구결과(Tazawa 등, 1998; 제갈 등, 1999)들과 일치하였다.
- 15% hydroquinone, 5% gelatin)에서 발색시켰다. 이때 절편이 옅은 황색이 될 때까지 방치한 후 증류수에 수세 후 탈수, 투명, 봉입하였으며, Warthin-Starry 염색에서는 위점막 상피 표면에 흑색으로 염색된 나선형 간균의 H. pylori 균체를 볼 수 있었다(Fig. 3).
- 이상의 내용을 요약하면 조직 내 H. pylori 검출을 위한 염색법으로는 도은법을 이용한 Warthin-Starry 염색법이 임상에서 가장 쉽게 이용 할 수 있을 것으로 생각되었다
- 탈파라핀 과정을 거쳐 함수 한 후 Wright-Giemsa 염색액으로 실온에서 20분간 염색 한 후, xylene으로 투명화한 다음 봉입하였으며, Giemsa 염색에서는 위점막 상피 표면에 청색으로 염색된 나선형 간균의 H. pylori 균체를 볼 수 있었다(Fig. 2).
후속연구
- pylori가 가지고 있는 다량의 요소분해효소의 성질을 이용한 신속요소분해효소검사법에서 양성을 보이면서 조직검사에서 만성위염으로 진단받은 58 예를 대상으로 하였다. 단, 신속요소분해효소검사법에 있어서 항생제나 비스무스제제와 같은 약물을 복용한 환자에서 균이 사멸할 수 있는 경우와 신속요소분해효소검사의 조작과정에서 검사자가 조직을 잘못 다룰 경우에 나타날 수 있는 위음성과 위양성, 그리고 동일 내시경 생검 검체의 연속절편을 제작하는 과정에서 H. pylori의 균체가 적을 경우에는 일부 절편에서 균체가 발견되지 않을 수 있다는 점을 감안하고 연구에 임하였다. 이러한 58 예를 대상으로 H&E 염색과 조직화학염색(Giemsa 염색, WarthinStarry염색), 그리고 면역조직화학염색을 시행하여 Genta 분류법에 따라 H.
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