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문제 정의
- 무기게르마늄의 선택적 특성분석과 이를 위한 정성, 정량 분석법에 대한 기준은 국내외를 통해 전 무한상태 이다. 따라서 본 연구에서는 효모 내에서 발효 초기에 이용되는 원료물질인 무기게르마늄(Ge。, 이 생합 성과정을 통해 인체에 유익한 유기게르마늄으로 전환됨을 확인하고 이를 정성적으로 검증하기 위한 분석 프로토콜을 제시하고자 하였으며, 게르마늄강화효모 내에 유해한 무기 게르마늄은 존재하지 않거나 실질적으로 “검출 불가(n.d: non- detectable)" 수준임을 확인하기 위한 목적으로 수행하였다.
- 본 연구는 효모 내에서 생합성된 유기게르마늄을 함유한 게르마늄 강화 효모 Geranti Bio Ge-Yeast 내의 무기 게르마늄의 잔존 여부를 GeOz의 정성 정량 프로토콜에 의한 실험을 통해 확인하기 위하여 수행하였다. 대조군으로는 99.
- 물론 'H NMR 스펙트럼을 얻지 못할 정도의 미량이 존재할 경우 ICP 로 정량분석 할 수 있다. 본 연구의 목적은 GeOz의 정성분석이며 Geranti Bio Ge-Yeast 내에 GeCb가 존재할 경우의 분석법으로 이용될 수 있다.
- 541A)를 사용하여 2。= 10-70° 범위에서 측정하였다. 침전 시료들의 성분조성분석을 위한 ICP-AES 분석은 한국기초과학지원연구원 광주센터에 의뢰해 얻었다 .
제안 방법
- Ge。?의 정성분석은 알콕시 (Rb) 또는 아세톡시 [CH3C (=0)0의 음이온을 Ge02와 반응시켜 Ge(0R)4 또는 Ge (OAc)로 변환시키는 방법도 가능할 것으로 생각되나, 여기에서는 NaBH와 GeCh를 반응시켜 불용성 갈홍색 (또는 진한 갈색; 가해주는 NaBH4 농도에 따라 색이 약간씩 다름) 물질의 침출을 보는 방법을 택하여 정성분석 프로토콜을 수립하였다. Geranti Bio Ge-Yeast 내의 GeO2 잔존 여부를 확인하기 위한 대조군으로서 독일 PPM 사에서 구입한 99.
- 99% GeC)2(control), Ge-amino acid 화합물, Geranti Bio Ge-Yeast 및 기타 대조 물질들을 각각 600 MHz NMR(Brunker Advance 600 spectrometer with 5 mm TXI PFG inverse prove head, Germany)에서 *H NMR 스펙트라 라이브러리를 얻음으로써 게르마늄 강화 효모 내에 존재하는 게르마늄의 유기태 여부를 확인하였다. GeC)2 정성분석 실험 시 나타나는 발색 침전반응의 분광학적 데이터는 고체 UV-VIS 스펙트럼을 찍은 결과를 통해 얻었으며, Biorad사(USA)의 FTS-3000(Golden Gate single reflection diamond ATR) 모델의 FT-IR spectrometer를 이용하여 그 차이를 비교하였다. 결정구조를 알아보기 위한 XRD 분석은 Bruker 사 (Germany)의 D4 Endeavor 모델의 XRD(Cu Ka, 人 =1.
- 64 g) 에 2차 증류수(10 ml)를 가한 후에 강하게 교반하여 녹였다. Geranti Bio Ge-Ycast 서스펜션에 NaBH4 용액을 가한 후 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하여 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등을 관찰하였다. 또한 MWCO 1, 200 dalton 의 투석막을 통과한 상등액에 대해서도 NaBH4로 실험한 결과 마찬가지로 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하여 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등을 관찰하였다.
- 확인하기 위하여 수행하였다. 대조군으로는 99.99%의 GeCMPPM사, 독알>)를 사용하여 이를 NaBH와 반응시켜 발색 침 전반응을 관찰하였고, 게 르마늄강화효모와 MWCO 1, 200 dalton의 투석막을 통과한 여과액을 각각 NaBHq와 반응 시켜 발색과 및 침전물 형성을 비교 관찰하였다. 또한 GeCb와 아미노산(히스티딘과 글리신)을 반응시켜 합성한 O=Ge(아미노산)2에 대해서도 같은 실험을 수행하였으며 그 결과는 다음과 같다.
- 99%의 GeCMPPM사, 독알>)를 사용하여 이를 NaBH와 반응시켜 발색 침 전반응을 관찰하였고, 게 르마늄강화효모와 MWCO 1, 200 dalton의 투석막을 통과한 여과액을 각각 NaBHq와 반응 시켜 발색과 및 침전물 형성을 비교 관찰하였다. 또한 GeCb와 아미노산(히스티딘과 글리신)을 반응시켜 합성한 O=Ge(아미노산)2에 대해서도 같은 실험을 수행하였으며 그 결과는 다음과 같다.
- Geranti Bio Ge-Ycast 서스펜션에 NaBH4 용액을 가한 후 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하여 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등을 관찰하였다. 또한 MWCO 1, 200 dalton 의 투석막을 통과한 상등액에 대해서도 NaBH4로 실험한 결과 마찬가지로 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하여 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등을 관찰하였다.
- . 또한 추가로 1시간가량 초음파를 가하여 기포 발생, 색 변화 및 새로운 침전 생성 등이 일어나는지를 관찰하였다.
- 게르마늄의 유.무기 여부를 확인하기 위해 게르마늄 강화효모 2.0 g을 몰타르에서 갈아 분말로 만들어 100 ml 플라스크에 넣은 후 THF(HPLC-g-) 20 ml를 가하고 24 시간 정도 강하게 교반하여 추출하였다. 이 시료를 한국기초과학지원연구원 광주센터에 의뢰하여 ICP-AES로 분석하여 Ge 총량 89.
- 건조 후 이들 시료들의 용해도와 녹는점을 측정할 수 없었는데 그 이유는 시료들이 용매에 녹거나 용융되지 않았기 때문이다. 생성 물의 결정상 확인을 위하여 XRD 분석을 하였고(Fig. 2, 4) IR (Fig. 5, 6)로도 분석을 시행하였다.
- 둘째, 이 화합물에 기지 농도의 기준물질을 첨가한 후 'H NMR 스펙트럼을 찍는다. 셋째, 이 스펙트럼에서 인테그랄(적분)비를 비교하여 GeO의 정확한 존재량을 정량적으로 분석한다. 물론 'H NMR 스펙트럼을 얻지 못할 정도의 미량이 존재할 경우 ICP 로 정량분석 할 수 있다.
- 생각된다. 아래에 따로 기술한 것처럼 투석막 외부에 존재하는 게르마늄의 유기태 (organic form) 여부를 확인하기 위 해 99.99% GeC)2(control), Ge-amino acid 화합물, Geranti Bio Ge-Yeast 및 기타 대조 물질들을 각각 600 MHz NMR(Brunker Advance 600 spectrometer with 5 mm TXI PFG inverse prove head, Germany)에서 *H NMR 스펙트라 라이브러리를 얻음으로써 게르마늄 강화 효모 내에 존재하는 게르마늄의 유기태 여부를 확인하였다. GeC)2 정성분석 실험 시 나타나는 발색 침전반응의 분광학적 데이터는 고체 UV-VIS 스펙트럼을 찍은 결과를 통해 얻었으며, Biorad사(USA)의 FTS-3000(Golden Gate single reflection diamond ATR) 모델의 FT-IR spectrometer를 이용하여 그 차이를 비교하였다.
- 투석막의 분자량의 투석범위 (MWC0, 1, 200 dalton)내에서 투석막 내부에 존재하는 게르마늄은 당연히 고분자 폴리펩타이드 수준의 단백질과 결합한 유기게르마늄이 확실한 것으로 생각된다. 유기 게르마늄은 안전하고 약리효과가 탁월하지만 무기 게르마늄은 독성을 나타낸다는 보고가 있으므로[10] 투석막을 통과한 비교적 작은 크기의 게르마늄 화합물에 대하여 유기태 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 투석막을 통과한 게르마늄은 무기 Ge。?로 존재하기 보다는 저분자량의 아미노산이나 올리고 펩타이드와 결합된 유기게르마늄의 형태로 존재하고 있을 것으로 생각된다.
- 99%의 GeO2 분말을 사용하였다. 참고로, GeCh와 NaBHr의 반응에서 일어나는 발색 및 침전과 관련된 GeO2 의 검출한계 (LOD: Limit of Detection)를 알아보기 위 해 NaBH4와 반응하는 GeOz의 양과 용매의 양을 조절하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. 즉, GeO2 0.
- 초음파 활성을 위해 초음파 세척기(Branson 5510 또는 Daihan D250H)에 물을 전파 매질로 사용하여 시행하였다.
- 침전반응이 GeG)2의 존재와 관계가 있는지의 여부를 알아보기 위해 1당량의 Na2CO3와 1당량의 GeCh와 2당량의 NaBHc를 반응시켜 보았으며, 이때 반응 5분 후부터 노랑색으로의 색 변화와 함께 기포 발생이 관찰되었다. 계속되는 기포 발생과 함께 점차 노랑색이 갈홍색, 진한 갈색 그리고 최종적으로 혹갈색으로 1시간 이내에 변하였다.
- 5℃의 항온 조에서 2시간 반응시킨 후 산 가수분해의 반응종결을 위해 50 mM NaOH를 가하여 중화시켰다. 투석막(Sigma, MWCO 1, 200 dalton) 내부에는 분자량이 1, 200 dalton 보다 큰 폴리펩타이드 수준의 단백질과 게르마늄이 결합된 형태의 유기게르마늄으로 간주하였으며 투석막 외부로 흘러나온 게르마늄을 분석한 결과 무기게르마늄이 아니라 분자량이 작은 소중합체 수준의 올리고 펩타이드와 게르마늄이 결합된 유기게르마늄으로 간주하였다.
- 투석실험을 위해 NaCl 2.0 g과 35~37%의 HC1 8.2 ml을 혼합한 후 증류수 1,000 ml를 채워 인공위액 (SGF, Simulated Gastric Fluids)을 제조하였&며, 37 ± 0.5℃의 항온 조에서 2시간 반응시킨 후 산 가수분해의 반응종결을 위해 50 mM NaOH를 가하여 중화시켰다. 투석막(Sigma, MWCO 1, 200 dalton) 내부에는 분자량이 1, 200 dalton 보다 큰 폴리펩타이드 수준의 단백질과 게르마늄이 결합된 형태의 유기게르마늄으로 간주하였으며 투석막 외부로 흘러나온 게르마늄을 분석한 결과 무기게르마늄이 아니라 분자량이 작은 소중합체 수준의 올리고 펩타이드와 게르마늄이 결합된 유기게르마늄으로 간주하였다.
대상 데이터
- Geranti Bio Ge-Yeast 내의 GeO2 잔존 여부를 확인하기 위한 대조군으로서 독일 PPM 사에서 구입한 99.99%의 GeO2 분말을 사용하였다. 참고로, GeCh와 NaBHr의 반응에서 일어나는 발색 및 침전과 관련된 GeO2 의 검출한계 (LOD: Limit of Detection)를 알아보기 위 해 NaBH4와 반응하는 GeOz의 양과 용매의 양을 조절하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
- 32 g)에 2 차 증류수(10 ml)를 가한 후에 강하게 교반하여 녹였다. 글리신 수용액에 Na3H4 용액을 가하였다.
- 본 연구에 사용된 효모는 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행 (KCTC)에서 분양 받은 Saccharomyces cerevisiae (KCTC-7904) 균주를 사용하였다. 배지는 펩톤 0.
- 원심분리기는 한일과학 MF 300 모델을 사용하였다. 초음파 활성을 위해 초음파 세척기(Branson 5510 또는 Daihan D250H)에 물을 전파 매질로 사용하여 시행하였다.
- 유기게르마늄을 함유한 효모는 게란티제약隋에서 생산한 Geranti Bio Ge-Yeast 제품을 사용하였고, 효모 내의 게르마늄 함량측정을 위한 대조군으로 사용한 99.99%의 GeO2 powder는 독일 PPM사로부터, 게르마늄 표준액 (Ge standard solution), 탄산칼슘, NaBH4, D2O, CDCI3 등은 Sigma Aldrich로부터 각각 구입하여 정제 없이 즉시 사용호} 였다. Bis-histidino germanate와 bis-glycino german ate는 문헌에 보고된 방법에 의해 합성하였다[3].
이론/모형
- 99%의 GeO2 powder는 독일 PPM사로부터, 게르마늄 표준액 (Ge standard solution), 탄산칼슘, NaBH4, D2O, CDCI3 등은 Sigma Aldrich로부터 각각 구입하여 정제 없이 즉시 사용호} 였다. Bis-histidino germanate와 bis-glycino german ate는 문헌에 보고된 방법에 의해 합성하였다[3].
성능/효과
- 결국 불용성 침전 고체 시료의 XRD, UV-VIS 및 IR 분석으로부터 갈홍색 침전물에 GeCb는 없음이 확인되었고, ICP-AES 분석을 통해 침전들은 GeCh와 NaBI%의 반응에 의해 NaGeBOx昌 형태를 가진다는 것을 알 수 있었다. SiO2 와의 반응 시 색 변화가 일어나지 않는 것으로 보아 색은 Ge-O와 B간의 결합에 의해 생기는 특수한 전자전이 때문일 것으로 생각된다.
- 1 mg)로 줄여도 미세한 침전과 색변을 관찰할 수 있었다. 결론적으로 용매를 줄일 경우 본 프로토콜에 의해 GeC)2를 0.1 mg까지도 검출할 수 있으므로(LOD: Limit of Detection 0.1 mg) 미국 FDA 기준치 1.5 mg를 고려할 때 매우 만족스러운 결과를 확보할 수 있었다. 1당량의 N* aBI 를 Ge6에 가하면 1분 후부터 노랑색으로의 색 변화와 함께 수소 기포 발생이 관찰되었으며, 1시간 이내에 계속되는 기포 발생과 함께 갈 홍색 침전이 생성되었다.
- 그러므로 투석막을 통과하여 외부에 존재하는 게르마늄도 역시 GeO身 형태가 아닌 유기게르마늄일 것C로 시료된다. 둘째, 유기용매 (acetone, methylene chloride, chloroform, ethanol, THF)를 사용하여 유기게르마늄 성분의 추출을 시도하였고, 이때 얻어진 *H NMR 스펙트럼들은 모든 용매에 대해 비슷하였으며 물의 경우[6] 보다 훨씬 더 간단한 스펙트럼이 얻어졌다. 여기에서 얻어진 결과들 중 acetone과 ether를 사용하여 추출한 E NMR 스펙트럼을 Fig.
- 또한 MWC0 1, 200 dalton西 투석막을 통과한 상등액에 대해서도 NaBH4로 실험한 결과 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하였으나 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등이 관찰되지 않아 Geranti Bio Ge-Yeast 내에 GeO)} 존재하지 않음을 정성적으로 확인할 수 있었다.
- 01 g으로 실험한 결과에서도 미세한 노랑색으로의 발색이 관찰되었고, 물을 날린 후 미세한 침전을 얻었다. 용매의 양을 0.1 ml까지 줄여서 실험한 결과, GeOz의 스케일을 0.0001 g(0.1 mg)로 줄여도 미세한 침전과 색변을 관찰할 수 있었다. 결론적으로 용매를 줄일 경우 본 프로토콜에 의해 GeC)2를 0.
- 1당량의 N* aBI 를 Ge6에 가하면 1분 후부터 노랑색으로의 색 변화와 함께 수소 기포 발생이 관찰되었으며, 1시간 이내에 계속되는 기포 발생과 함께 갈 홍색 침전이 생성되었다. 이 반응은 초음파를 가하면 더 빨리 진행되었으며 12시간 후 여과, 세척 및 건조하여 ~98% 수율로 얻어진 갈홍색 침전을 Fig. 1과 같이 고체 UV-VIS 를 찍었을 때 200-300 nm에서 매우 큰 흡수 띠가 보이고 300-550 nn까지 tailing이 관찰되었으며 (Fig. 1), XRD를 찍었을 때 10 도 부근에 결정성 분리띠가 확인되었다(Fig. 2).
- 이를 뒷받침하기 위해 첫째, 투석막 외부의 상등액을 취하여 상기 GeO2 정성분석 프로토콜에 따라 NaBH4와의 반응을 시도한 결과 GeCh와 NaBH4와의 반응에서 나타나는 특이한 색 변화와 갈홍색 침전이 관찰되지 않았다. 그러므로 투석막을 통과하여 외부에 존재하는 게르마늄도 역시 GeO身 형태가 아닌 유기게르마늄일 것C로 시료된다.
- 이를 토대로 Geranti Bio Ge-Yeast와 과량의 NaB& 를반응시켜 보았으며 Geranti Bio Ge-Yeast 서스펜션에 NaBH4 용액을 가한 후 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반 하였으나 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등이 관찰되지 않았다. 또한 MWC0 1, 200 dalton西 투석막을 통과한 상등액에 대해서도 NaBH4로 실험한 결과 24시간 동안 상온에서 맹렬하게 교반하였으나 기포 발생, 색 변화, 침전 생성 등이 관찰되지 않아 Geranti Bio Ge-Yeast 내에 GeO)} 존재하지 않음을 정성적으로 확인할 수 있었다.
- 참고로, GeCh와 NaBHr의 반응에서 일어나는 발색 및 침전과 관련된 GeO2 의 검출한계 (LOD: Limit of Detection)를 알아보기 위 해 NaBH4와 반응하는 GeOz의 양과 용매의 양을 조절하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. 즉, GeO2 0.1 당량 서스펜션 용액 (GeCh 0.05 g, D.W 10 ml)에 NaBH4 용액 (NaBF% 0.19 g, D.W 10 ml)을 가한 후 12시간 동안 상온에서 강하게 교반한 결과 노랑색으로의 발색은 관찰되었으나 침전이 관찰되지 않았으므로 이를 과량의 용매에 의한 것으로 보고 용매의 양을 20 ml에서 1 ml로 줄여 GeO2 : NaBH4 = 1 : 2의 비율로 실험을 진행해 본 결과, 예상대로 침전과 발색을 확인할 수 있었다.
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