지렁이 중장에서 발현되는 endo-β-1,4-glucanase 유전자들의 클로닝과 특성에 관한 연구 Cloning and Characterization of endo-β-1,4-glucanase genes from the Midgut of the Earthworm, Eisenia andrei원문보기
셀룰로오스가수분해효소의 하나인 endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase의 유전자를 지렁이 Eisenia anderi의 중장으로부터 클로닝하여 EaEG2와 EaEG3로 명명하였다. 두 유전자의 염기는 1368bp이며, 개시코돈을 포함하여 456개의 아미노산을 코딩한다. N-말단 지역의 20개 잔기들은 signal peptide이다. 두 유전자의 전체 아미노산 염기서열은 glycosyl hydrolase family 9에 속하며, 같은 종류의 셀룰로오스 가수분해효소를 분비하는 흰개미, 바퀴벌레, 가재 그리고 연체동물과 51-55%의 높은 상동성을 보였다. 지렁이의 EaEG2와 EaEG3는 가수분해활성에 중요한 세 부분이 잘 보존되어 있다. 아미노산 염기서열을 이용한 계통수 분석에서 GHF9 그룹은 절지동물, 박테리아, 식물, 환형동물 및 연체동물의 5개 그룹으로 분석되었다.
셀룰로오스 가수분해효소의 하나인 endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase의 유전자를 지렁이 Eisenia anderi의 중장으로부터 클로닝하여 EaEG2와 EaEG3로 명명하였다. 두 유전자의 염기는 1368bp이며, 개시코돈을 포함하여 456개의 아미노산을 코딩한다. N-말단 지역의 20개 잔기들은 signal peptide이다. 두 유전자의 전체 아미노산 염기서열은 glycosyl hydrolase family 9에 속하며, 같은 종류의 셀룰로오스 가수분해효소를 분비하는 흰개미, 바퀴벌레, 가재 그리고 연체동물과 51-55%의 높은 상동성을 보였다. 지렁이의 EaEG2와 EaEG3는 가수분해활성에 중요한 세 부분이 잘 보존되어 있다. 아미노산 염기서열을 이용한 계통수 분석에서 GHF9 그룹은 절지동물, 박테리아, 식물, 환형동물 및 연체동물의 5개 그룹으로 분석되었다.
Two endogenous endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase (EGase, EC 3.2.1.4) cDNAs were cloned from the midgut of the earthworm Eisenia anderi, and named EaEG2 and EaEG3, respectively. A sequence of 1,368 bp was determined and the coding region is composed of 456 amino acid residues including the in...
Two endogenous endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase (EGase, EC 3.2.1.4) cDNAs were cloned from the midgut of the earthworm Eisenia anderi, and named EaEG2 and EaEG3, respectively. A sequence of 1,368 bp was determined and the coding region is composed of 456 amino acid residues including the initiation methionine. The N-terminal region of 20 residues in the deduced sequence was regarded as the signal peptide. These EGases belong to glycosyl hydrolase family 9 (GHF9) and showed high levels of identity(51-55%) with selected termite, cockroache, crayfish and mollusc EGases. The EGases of earthworm consist of three consensus catalytic domains found in most microbial cellulases. A phylogenetic tree was constructed using the deduced amino acid sequence data matched through the BLASTX program and showed that GHF9 families could be divided into five groups of arthropoda, bacteria, plant, annelida and mollusc.
Two endogenous endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase (EGase, EC 3.2.1.4) cDNAs were cloned from the midgut of the earthworm Eisenia anderi, and named EaEG2 and EaEG3, respectively. A sequence of 1,368 bp was determined and the coding region is composed of 456 amino acid residues including the initiation methionine. The N-terminal region of 20 residues in the deduced sequence was regarded as the signal peptide. These EGases belong to glycosyl hydrolase family 9 (GHF9) and showed high levels of identity(51-55%) with selected termite, cockroache, crayfish and mollusc EGases. The EGases of earthworm consist of three consensus catalytic domains found in most microbial cellulases. A phylogenetic tree was constructed using the deduced amino acid sequence data matched through the BLASTX program and showed that GHF9 families could be divided into five groups of arthropoda, bacteria, plant, annelida and mollusc.
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문제 정의
Eisenia andrei) 의 중장에 분포하는 셀룰로오스가수분해효소의 유전자들을 주가 동정하여 분자생물학적인 특성을 분석함으로서 국 . 내외 셀룰로오스 가수분해효소를 활용하는 산업에서 현장 적응 가능성에 대한 기초 자료를 제공하고자 한다.
AY914054) 를 확보한 바 있으나, 흰개미26), 바퀴벌레27)등의 절지동물에서의 연구에서는 여러 종류의 셀룰로오스가수분해효소 유전자가 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 환형동물인 줄지렁이 (.Eisenia andrei) 의 중장에 분포하는 셀룰로오스가수분해효소의 유전자들을 주가 동정하여 분자생물학적인 특성을 분석함으로서 국 . 내외 셀룰로오스 가수분해효소를 활용하는 산업에서 현장 적응 가능성에 대한 기초 자료를 제공하고자 한다.
가설 설정
흡수하는 것으로 알려져 있었다. 그러나 미생물이 없는 무척추동물 장에서의 셀룰로오스 가수분해효소의 정저와 식물—기생의 포낭 선충류(plant—parasitic cyst nematode)8), 9), 흰개미 (termite)1가재(crayfish)에서 셀룰로오스가수분해효소의 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝은 동물이 내생의 셀룰로오스 가수분해효소를 가지고 있지 않다는 가설을 바꾸어 놓았다.
제안 방법
NCBI 에 등재된 지렁이 6T, 4- endoglucanase (.EaEGl) 유전자의 개시코돈 (start codon) 과 종결코돈 (stop codon) 포함된 유전자-특이적 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응물에는 이 ycosyl hydrolase family 9에 속흐}는 두 개의 새로운 유전자 (EaEG2와 EaEG3) 가 포함되어 있다.
배양된 박테리아로부터 플라스미드 DNA의 분리는 QIAprep spin miniprep kit (Qiagen) 를 이용하여 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 분리된 플라스미드는 제한효소인 EcoR I (10 U/fd, Roche) 1 , buffer H (Roche) 1 , plasmid 8 를 혼합하여 37 ℃ 항온 조에서 1시간 30분 배양 후 1.2% agarose gel 로 cDNA의 삽입 여부를 확인하였다. 염기서열 결정을 위한 반응은 AmpliTaq DNA polymerase가 포함된 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 이용하여 MJ research Gradient Cycler에서 수행하였으며, 형광표지된 (fluorescent-labeled) 절편은 에탄올 침전에 의해 정제하였다.
2% agarose gel 로 cDNA의 삽입 여부를 확인하였다. 염기서열 결정을 위한 반응은 AmpliTaq DNA polymerase가 포함된 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 이용하여 MJ research Gradient Cycler에서 수행하였으며, 형광표지된 (fluorescent-labeled) 절편은 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 정제된 표본은 증류수로 용해한 후 ABI 3700 sequencer를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
염기서열 결정을 위한 반응은 AmpliTaq DNA polymerase가 포함된 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 이용하여 MJ research Gradient Cycler에서 수행하였으며, 형광표지된 (fluorescent-labeled) 절편은 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 정제된 표본은 증류수로 용해한 후 ABI 3700 sequencer를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열의 분석은 National Center of Biotechnology Information (NCBI; http://www.
이용하였다. 첫 번째 cDNA 가닥은 cDNA synthesis Kit(Promega)를 이용하여 제작하였으며, 유전자 특이적인 primer 5'- ATGGCGACACGATTGATGATGCTGCT-3 과 5' -TCACTTGCCGTCTCTCAGCTGAATG-3' 을 사용하여 PCR을 수행하였다. 최종 PCR 반응물을 T/A cloning vector (Invitrogen) °1] 접합시킨 후, One shot TOP 10 E.
coli (Invitrogen) °1] 형질전환 시켰다. 형질전환된 박테리아는 1.4 mM 5—Bromo — 4 — chloro — 3 — indolyl B —D—galactopyranoside (X—gal), 50 /zg/m£ ampicillin0] 포함된 LB 배지 (5 g of Bacto Yeast Extract, 10 g of Bacto Tryptone, 14g of Bacto Agar, 10g of NaCl/1 i) 에 접종하였다.
대상 데이터
낚시 미끼용으로 사용되고 있는 줄지렁이 (Eisenia andrei) 중에서 환대가 잘 발달된 성숙한 개체만을 선택하여 증류수로 세척한 후 배양토와 자연비료를 1:1로 혼합한 토양을 지렁이 성장에 해로운 선충류의 성장을 최소화하기 위하여 6 5 ℃ 건조용 전기 오븐에서 12시간 이상 건조시켰다. 15 X20 7cm 크기의 플라스틱 용기에 지렁이를 약 60마리씩과 토양을 넣어 23±1℃를 유지하며 암소에서 배양하였다.
성숙한 지렁이 중장으로부터 total RNA는 Tri-reagent (Sigma) 를 이 용하였으며 , total RNA로부터 mRNA 의 추출은 dynabeads (DYNALX 이용하였다. 첫 번째 cDNA 가닥은 cDNA synthesis Kit(Promega)를 이용하여 제작하였으며, 유전자 특이적인 primer 5'- ATGGCGACACGATTGATGATGCTGCT-3 과 5' -TCACTTGCCGTCTCTCAGCTGAATG-3' 을 사용하여 PCR을 수행하였다.
배양 시 습도는 주기적으로 증류수를 공급하여 80% 이상을 유지하도록 하였으며, 먹이원으로 우분을 매일 토양 위에 공급하였다. 중장 내용물의 배출을 위하여 지렁이 생리식염수 (25 mM NaCl, 2.5 mM K2SO4, 67.5 mM Na2SO4, 0.5 mM MgSQ, 13.25 mM CaCU, 5 mM Tris, 2.7 mM 이ucose) 으로 적신 filter paper에서 최소 48시간 이상 배양한 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
NCBI의 BLASTX 프로그램을 이용하여 염기서열을 분석하고 유사도가 높고 전체염기서열이 밝혀진 유전자들을 분류군별로 선택하여 CLUSTALX 프로그램을 이용하여 다중 정렬하였다. 계통수 분석에는 Megan 프로그램을 사용하였으며, NJ (Neighbor—Joining) 알고리즘에 의해 유연관계 분석을 수행하였다.
계통수 분석에는 Megan 프로그램을 사용하였으며, NJ (Neighbor—Joining) 알고리즘에 의해 유연관계 분석을 수행하였다.
정제된 표본은 증류수로 용해한 후 ABI 3700 sequencer를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열의 분석은 National Center of Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 에서 BLASTX 프로그램을 이용하여 단백질 자료 (nonredundant) 와 다중배열 (multiple alignment) 분석을 수행하였다.
이론/모형
동안 교반 배양하였다. 배양된 박테리아로부터 플라스미드 DNA의 분리는 QIAprep spin miniprep kit (Qiagen) 를 이용하여 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 분리된 플라스미드는 제한효소인 EcoR I (10 U/fd, Roche) 1 , buffer H (Roche) 1 , plasmid 8 를 혼합하여 37 ℃ 항온 조에서 1시간 30분 배양 후 1.
성능/효과
1). PSORT II Prediction 프로그램에 의해 분석된 단백질의 최종 목적지는 모두 extracellular이며 PeptideMass 프-루-7램*"에 의해 예상되어진 이론적인 pl값은 EaEG2가 4.49, EaEG3가 4.33, 이론적인 분자량은 EaEG2가 48.4kDa, EaEG3가 48.7kDa이다. Signal peptide%% 두 개의 단백질 모두 21개로서 EaEGl 과 같다.
2) (A). 다른 종에서 동정되어진 glycosyl hydrolase family 9에 속하는 단백질과의 상동성을 살펴보면, EaEG2는 흰개미 (Nasutitermes takasagoensis) 의 endo— B —1, 4~glucanase, 흰개미 (Nasutitermese) 의 NwEG와 54%, 바퀴벌레 z cribrata) beta—1, 4—endogkicanase외 52%, EaEG3는 흰개미 (Maseszes darwiniensis) 의 beta—1, 4—endoglucanase와" 54%, 연체동물 (Haliotis discus) cellulase오* 53%, 가재 (Cherax quadricarinatus) 의 beta—1, 4—endoglucanase와 52%의 상동성을 나타낸다 (Table 1].
0 program and the shaded columns represent complete coincidence of amino acid residues in the column. (B) Consensus signatures of 이ycoside hydrolase family 9- NwEG (AB013273) from Nasutitermes walkeri, NtEG (AB013272) from Nasutitermes takasagoensis, RsEG (AB019095) from Reticulitermes speratus, RfEG (AY572862) from Reticulitermes flavipes, CfEG (AB058670) from Coptotermes from Mastotermes, MdEG (AJ511343) from Mastotermes darwiensis, PcEG (AF220596) from Panesthia cribrata, CqEG (AF148497) from Cherax quadricarinatus, HdEG (AB092978) from Haliotis discus. The catalytically important residues in GHF9 are indicated by black circles.
전체 ORF의 길이는 1, 368 bp이며, 456개의 아미노산을 코딩한다. BLASTX를 통한 분석 결과 GHF9 그룹에 속하며, NCBI 에 등록된 다른 종들의 GHF9의 단백질과 51-55%의 상동성을 나타내었다. 계통수 분석에서는 다른 동물 분류군에서 밝혀진 GHF9 그룹의 셀룰로오스 가수분해 효소와 근연관계가 없음이 확인되었다.
BLASTX를 통한 분석 결과 GHF9 그룹에 속하며, NCBI 에 등록된 다른 종들의 GHF9의 단백질과 51-55%의 상동성을 나타내었다. 계통수 분석에서는 다른 동물 분류군에서 밝혀진 GHF9 그룹의 셀룰로오스 가수분해 효소와 근연관계가 없음이 확인되었다. 셀룰로오스의 가수분해에 중요한 활성부위가 잘 보존되어 있어 미생물 등에서 얻어진 셀룰로오스 가수분해효소와 같이 대량 생산과 효소활성학적인 결과가 얻어진다면 산업 전반에 이용되어 질 수 있을 것으로 생각된다.
지렁이 (Eisenia andrei) -2] 중장에서 기존에 NCBI 에 보고된 것과는 다른 형태의 endoglucanase 유전자 두 개를 클로닝하여 지렁이가 흰개미, 바퀴벌레와 같이 여러 형태의 셀룰로오스 가수분해효소를 가지고 있음을 확인하였다. 전체 ORF의 길이는 1, 368 bp이며, 456개의 아미노산을 코딩한다.
지렁이 EaEG2와 EaEG3는 EaEGl과 99%와 86%, EaEG2와 EaEG3는 87%의 상동성을 보이는 것으로 나타났다〔Fig. 2) (A).
후속연구
세포벽의 주요 구성 요소이다. 다수의 미생물에 의해 생산되는 셀룰로오스 가수분해 효소 또는셀룰로오솜 (cellulosome) 에 의한 셀룰로오스의가수분해는 고정된 탄소를 대기 중의 이산화탄소로 바꾸어 주는 중요한 탄소흐름 (carbon flow) 의일례이며, 장래 농업 분야에서 셀룰로오스의 효율적인 이용은 생산력 증대효과뿐만 아니라 식량 대체효과에 중요한 관심의 대상이 될 것이다. 또한 쓰레기 처리과정에 있어서 중요한 역할을 하고 분해 산물은 화석연료의 고갈을 대체할 수 있는 에너지원으로 주목받고 있으며, 처리 비용이 비싼 농업 또는 임업 산물을 당으로 전환시키는 기술의 발전은 국가의 이익에 도움을 주는 잠재적인 요소가 될 것이다
계통수 분석에서는 다른 동물 분류군에서 밝혀진 GHF9 그룹의 셀룰로오스 가수분해 효소와 근연관계가 없음이 확인되었다. 셀룰로오스의 가수분해에 중요한 활성부위가 잘 보존되어 있어 미생물 등에서 얻어진 셀룰로오스 가수분해효소와 같이 대량 생산과 효소활성학적인 결과가 얻어진다면 산업 전반에 이용되어 질 수 있을 것으로 생각된다.
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