음나무의 새로운 용도 개발을 위하여 다양한 항산화 측정법을 이용하여 생리활성을 측정하였다. 즉, 음나무 수피 및 근피의 온수 추출물과 메탄올 추출물에 대한 세포 내 활성산소 농도를 측정하여 세포수준에서의 산화 스트레스 억제효과를 측정하였으며, DPPH법 및 NBT법을 이용하여 각 추출물의 화학적인 측면에서의 항산화력을 측정하여 이들 간의 차이를 비교하였다. NR assay와 MTT assay에 의해 측정한 세포독성 실험결과, 음나무 근피의 메탄올 추출물의 세포독성이 가장 강했으며, 50%의 세포 생존율을 나타내는 NR50과 MTT50은 각각 0.0018%와 0.0029%였다. 산화 스트레스 억제효과는 근피의 불용성 온수 추출물이 15분 처리에서 57.9%로 가장 우수하였다. DPPH법과 NBT법을 이용한 음나무 추출물에 대한 항산화 활성 측정결과, 각각 수피의 메탄올 추출물이 96% (0.1% 농도)이고, 수피의 불용성 온수 추출물이 95% (0.5% 농도)를 나타내어 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
음나무의 새로운 용도 개발을 위하여 다양한 항산화 측정법을 이용하여 생리활성을 측정하였다. 즉, 음나무 수피 및 근피의 온수 추출물과 메탄올 추출물에 대한 세포 내 활성산소 농도를 측정하여 세포수준에서의 산화 스트레스 억제효과를 측정하였으며, DPPH법 및 NBT법을 이용하여 각 추출물의 화학적인 측면에서의 항산화력을 측정하여 이들 간의 차이를 비교하였다. NR assay와 MTT assay에 의해 측정한 세포독성 실험결과, 음나무 근피의 메탄올 추출물의 세포독성이 가장 강했으며, 50%의 세포 생존율을 나타내는 NR50과 MTT50은 각각 0.0018%와 0.0029%였다. 산화 스트레스 억제효과는 근피의 불용성 온수 추출물이 15분 처리에서 57.9%로 가장 우수하였다. DPPH법과 NBT법을 이용한 음나무 추출물에 대한 항산화 활성 측정결과, 각각 수피의 메탄올 추출물이 96% (0.1% 농도)이고, 수피의 불용성 온수 추출물이 95% (0.5% 농도)를 나타내어 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
This study reviewed the application of an extract from Kalopanax pictus stem bark and root bark as natural antioxidants. To investigate the effect on cell toxic level against transformed mouse fibroblast L929 in formula added with various extracts from Kalopanax pictus stem bark and root bark, this ...
This study reviewed the application of an extract from Kalopanax pictus stem bark and root bark as natural antioxidants. To investigate the effect on cell toxic level against transformed mouse fibroblast L929 in formula added with various extracts from Kalopanax pictus stem bark and root bark, this experiment was carried out by in vitro cytotoxicity method. Using DCFA-DA method, oxidative stress in cell was measured with other antioxidant activity methods including DPPH assay and NBT assay. Active oxygen inhibition rate for root bark insoluble hot water extracts showed the highest with 57.9% for 15 min treatment. In DPPH and NBT test, antioxidant activities of methanol extract from stem bark and insoluble hot water extract from stem bark were 96% (at 0.1%) and 95% (at 0.5%), respectively.
This study reviewed the application of an extract from Kalopanax pictus stem bark and root bark as natural antioxidants. To investigate the effect on cell toxic level against transformed mouse fibroblast L929 in formula added with various extracts from Kalopanax pictus stem bark and root bark, this experiment was carried out by in vitro cytotoxicity method. Using DCFA-DA method, oxidative stress in cell was measured with other antioxidant activity methods including DPPH assay and NBT assay. Active oxygen inhibition rate for root bark insoluble hot water extracts showed the highest with 57.9% for 15 min treatment. In DPPH and NBT test, antioxidant activities of methanol extract from stem bark and insoluble hot water extract from stem bark were 96% (at 0.1%) and 95% (at 0.5%), respectively.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 음나무 추출물에 대한 다양한 항산화 활성을 측정하여 비교하였다. 세포독성은 RM이 가장 높았으며 , 반면에 , SWI와 SM의 세포독성이 낮았다’ 세포 내 활성산소를 가장 잘 제거하는 추출물은 RWI이였으며 화학적 측면에서 측정한 항산화 활성의 경우, DPPH법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 RM의 활성이 우수한 반면, NBT 법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 SWS가 우수한 활성을 나타내었다.
본 연구에서는 생리활성이 우수한 수목으로 알려진 음나무의 새로운 용도 개발을 위하여 다양한 항산화 측정법을 이용하여 생리활성을 측정하였다.즉, 음나무 수피와 근피 의 온수 추출물과 메탄올 추출물에 대한 세포 내 활성산소 농도를 측정하여 세포 수준에서의 산화 스트레스 억제효과를 측정하였으며, DPPH법 및 NBT법을 이용하여 각 추출물에 대한 화학적인 측면에서의 항산화력을 측정하여 이들 간의 차이를 비교하였다.
따라서 이러한 항산화 활성 측정법은 세포 내부에서 발생되는 활성산소 노출과정을 감소시키는 물질을 탐색하는데 있어 유용하다. 본 연구에서는 세포 내 형성된활성산소의 억제율을 측정하는 방법을 도입하였다. 즉, 활성산소 억제율은 비형광성의 DCF (2', 7'-di- chlorofluorescin)가 세포 내의 활성산소에 의해 산화되면 형광성의 DCF로 전환되며 이것을 fluoro- meter로 측정하여 계산하였다(Kumar, 2004).
있다. 이 중 산림자원으로부터 유용한 기능을 가진 물질을 분리하여 구조를 밝히거나 다양한 효과를 탐색하여 기능성 식품이나 천연물 신약으로 사용하려는 방안은 산림자원을 고차원적으로 이용하고자 하는 것이다.
제안 방법
1 ng를 각 well에 첨가한 후 3시간 동안 반응시키고 배지를 제거하였다. Microplate 내에 있는 cell의 부착력을 촉진시키기 위해 1% formalin-1% CaCh로 고정시킨 후 생세포에 축적되어있는 neutral red를 1% 초산-50% 에탄올로 추출한 다음 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
다양한 수목 중에서 전통적으로 약용하게 이용되어 온 음나무의 수피 (stem bark)와 근피 (root bark) 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하였다. 음나무 (Kalopanax pictus Nakai = Kalopanax septemlo- bus)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 낙엽성 수목으로 동아시아에 분포한다(정 등, 2004).
각각의 시간별로 배양한 후 각각의 well에 10 μlv의 DCFH-DA를 첨가하여 15분간 배양하였다. 반응 액의 fluorescence를 측정하여 산화 스트레스를 측정하였다(Rosenkranz 등, 1992).
항산화 활성 측정법 중의 하나인 NBT asaay는 이러한 superoxide anion의 소거능을 알 수 있는 실험법이다. 본 실험에서는 음나무 수피와 근피의 추출물 0.5%를 사용하여 측정하였다. Fig.
수피와 근피 분말을 메탄올(MeOH)과 온수 (hot-water)로 추출하여 농축하였다. 온수 추출물은 다시 메탄올에 녹여 가용부와 불용부로 나누어서 온수 가용부와 온수 불용부로 나누었다. 따라서 본 실험에 사용된 시료는 Fig.
음나무 수피와 근피를 메탄올과 온수로 추출하여 추출물 농도를 0.01%로 조절하여 시간대별(15, 30, 45, 60분)로 DCFH-DA (2, , 7, -dichlorofluorescin diacetate)를 이용하여 세포 내의 산화스트레스 억제 효과를 측정하였다(Fig. 3).
음나무의 수피 와 근피를 구분하여 음건한 후 분쇄하였다. 수피와 근피 분말을 메탄올(MeOH)과 온수 (hot-water)로 추출하여 농축하였다.
음나무의 용도 개발을 위하여 음나무 수피와 근피 온수 추출물 및 메탄올 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하였다.
측정법을 이용하여 생리활성을 측정하였다.즉, 음나무 수피와 근피 의 온수 추출물과 메탄올 추출물에 대한 세포 내 활성산소 농도를 측정하여 세포 수준에서의 산화 스트레스 억제효과를 측정하였으며, DPPH법 및 NBT법을 이용하여 각 추출물에 대한 화학적인 측면에서의 항산화력을 측정하여 이들 간의 차이를 비교하였다.
본 연구에서는 세포 내 형성된활성산소의 억제율을 측정하는 방법을 도입하였다. 즉, 활성산소 억제율은 비형광성의 DCF (2', 7'-di- chlorofluorescin)가 세포 내의 활성산소에 의해 산화되면 형광성의 DCF로 전환되며 이것을 fluoro- meter로 측정하여 계산하였다(Kumar, 2004).
화학물질이나 천연물의 안전성 평가를 위해 실시되는 동물실험은 비용이 많이 드는 등 여러가지 문제점이 있어 본 연구에서는 배양세포를 이용한 독성 시험법을 이용하였다. 현재 여러가지 분석 assay가 사용되기는 하지만 그중 neutral red (NR) assay와 MTT assay가 흔히 사용되고 있다.
대상 데이터
1. 공시재료
공시수종으로는 2004년 9월 흥정산(강원도 홍천군)에서 채취한 음나무(수령: 15년, 흉고직경: 10 cm)를 사용하였다
.
) 2 ml를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시 킨 후 513 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 메탄올만을 사용하여 측정하였다. 항산화 활성인 자유 라디칼 소거능은 다음의 식에 의해서 구하였다(유 등, 2004).
온수 추출물은 다시 메탄올에 녹여 가용부와 불용부로 나누어서 온수 가용부와 온수 불용부로 나누었다. 따라서 본 실험에 사용된 시료는 Fig. 1과 같이 6개 (SWS. SWI, SM. RWS, RWI, RM)로 구분하였다.
세포독성 실험에 사용된 transformed mouse fibroblast L929는 5% bovine calf serum이 함유된 Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 에 5% CO2 및 37℃ 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 80% confluent 시 에 DMEM으로 세 척 한 후 trysini- zation (0.
이론/모형
본 연구에서는 세포 내 활성산소의 양을 측정하는 대표적인 평가방법인 DCFH-DA (2, , 7, -dichloro- fluorescin-diacetate)> 이용한 fluorimetric assay 를 사용하여 음나무 추출물의 항산화 활성을 평가하였다. DCFH-DA는 비극성분자로 세포 내로 쉽게 침투할 수 있으며 세포 내의 esterase에 의해 비 형광성 극성분자인 DCFH로 분리되고 세포 내에 존재하는 활성산소에 의해 산화되면 형광성 DCF (2, , 7, - dichlorofluorescin)로 전환되는데, 이때 형성된 형광물질을 fluorometer로 측정하는 방법이다(Tray- ner 등, 1995).
성능/효과
9%로 가장 우수하였다. DPPH법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 1% 추출물에 대해 RM이 96%, SM이 92%, 그리고 RWI가 76%로 활성이 우수한 반면, NBT법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 SWS가 95%, RWS가 93%. 그리고 RM이 75%로 우수한 활성을 나타내었다.
4에서는 음나무 수피와 근피 추출물의 각 농도별에 따른 자유라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 계산하였다. Fig. 4의 결과에서 나타낸 것과 같이 수피의 메탄올 추출물인 SM의 항산화 활성이 가장 우수하였으며, 수피의 불용성 온수 추출물인 SWI의 항산화 활성이 가장 저조하게 나타났다.
이상의 결과로 보아 음나무 수피와 근피의 다양한 주줄물 중에서 수피의 온수 주줄물 중 메탄올 불용성 추출물인 SWS를 제외하고 나머지 추출물 모두는 활성산소 억 제호과를 보였다(Fig. 그 중 음나무 근피 온수 주줄물 메탄올 불용성 주줄물인 RWI의 활성산소 억제효과가 57.9%로 가장 높았다. 이상에서 세포수준에서의 산화스트레스 억제 효과를 DCFH-DA를 이용하여 측정한 결과 수피 추출물 보다는 근피 추출물의 활성산소 억 제효과가 우수함을 알 수 있었다.
DPPH법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 1% 추출물에 대해 RM이 96%, SM이 92%, 그리고 RWI가 76%로 활성이 우수한 반면, NBT법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 SWS가 95%, RWS가 93%. 그리고 RM이 75%로 우수한 활성을 나타내었다. 즉, 음나무의 여러 추출물 중에서 음나무 근피 불용성 온수추출물 RWI가 여러 항산화 활성 측정법으로 검정한 결과 천연의 항산화제로 이용하기 가장 적절한 추출물이라 여겨진다.
9%의 활성산소 저해율을 보여 주었다. 또한 음나무 근피의 온수 추출물 RWS와 RWI는 30분 동안 각각 30.5%와 54.8%의 활성산소 저해율을 나타내었다. 근피의 메탄올 추출물인 RM의 활성산소 저해율은 30분이 지난 후에 41.
보일 때의 농도를 나타낸 것이다. 사용된 여러 시료 중에서 NR assay의 경우는 RM의 NR50 값이 0.0018%로 가장 적었으며. MTT assay에서는 RM의 MTT50 값이 0.
0018%와 0X)029%였다. 산화 스트레스 억제효과는 근피의 불용성 온수 추출물인 RWI의 15분 처리에서 57.9%로 가장 우수하였다. DPPH법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 1% 추출물에 대해 RM이 96%, SM이 92%, 그리고 RWI가 76%로 활성이 우수한 반면, NBT법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 SWS가 95%, RWS가 93%.
따라서 본 연구에서는 음나무 추출물에 대한 다양한 항산화 활성을 측정하여 비교하였다. 세포독성은 RM이 가장 높았으며 , 반면에 , SWI와 SM의 세포독성이 낮았다’ 세포 내 활성산소를 가장 잘 제거하는 추출물은 RWI이였으며 화학적 측면에서 측정한 항산화 활성의 경우, DPPH법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 RM의 활성이 우수한 반면, NBT 법에 의한 항산화 활성의 측정에서는 SWS가 우수한 활성을 나타내었다. 따라서 앞으로는 이러한 활성을 나타내는 각 성분에 대한 자세한 연구가 필요하다.
음나무 수피 와 근피 의 온수 추출물과 메탄올 추출물을 각 농도(0.01 ~1%)별로 처리하여 120분이 경과된 후의 세포 생존율을 측정한 결과 NR assay에 의한 측정결과 근피 메탄올 추출물인 RM을 제외한 모든 시료가 0.001%에서 100%의 세포 생존율을 보여주었으며, MTT assy에 의한 결과도 동일하였다. 하지만 각각의 추출물을 1%로 처리한 결과에서는 NR assay에서는 SW[를 제외한 모든 시료가 10% 미만의 생존율을 나타내었고, MTT saay의 경우에는 SWI와 SWS를 제외하고는 모두 10% 이하의 생존율을 나타내었다.
음나무 수피의 온수추출물인 swS와 SWI는 30분 동안 각각 4.5%와 35.9%의 활성산소 저해율을 보여 주었으며. 메탄올 추출물인 SMe 35.
9%로 가장 높았다. 이상에서 세포수준에서의 산화스트레스 억제 효과를 DCFH-DA를 이용하여 측정한 결과 수피 추출물 보다는 근피 추출물의 활성산소 억 제효과가 우수함을 알 수 있었다.
추출물들의 시간별 활성산소 저해율은 대체로 시간이 경과함에 따라 감소하는 경향을 보였지만 SWI는 시간이 지나도 변화가 거의 없었다. 이상의 결과로 보아 음나무 수피와 근피의 다양한 주줄물 중에서 수피의 온수 주줄물 중 메탄올 불용성 추출물인 SWS를 제외하고 나머지 추출물 모두는 활성산소 억 제호과를 보였다(Fig. 그 중 음나무 근피 온수 주줄물 메탄올 불용성 주줄물인 RWI의 활성산소 억제효과가 57.
0029%로 가장 적은 값을 나타내었다. 즉, NR assay와 MTT assay에 의한 세포 독성 실험결과, RM의 세포독성이 가장 강하였으며, SWI 와 SM에 대한 세포독성이 적게 나타났다.
그리고 RM이 75%로 우수한 활성을 나타내었다. 즉, 음나무의 여러 추출물 중에서 음나무 근피 불용성 온수추출물 RWI가 여러 항산화 활성 측정법으로 검정한 결과 천연의 항산화제로 이용하기 가장 적절한 추출물이라 여겨진다.
측정한 세포독성 실험결과, 음나무 근피의 메탄올 추출물의 세포독성이 가장 강했는데, 50%의 세포 생존율을 나타내는 NR50과 MTT50은 각각 0.0018%와 0X)029%였다. 산화 스트레스 억제효과는 근피의 불용성 온수 추출물인 RWI의 15분 처리에서 57.
001%에서 100%의 세포 생존율을 보여주었으며, MTT assy에 의한 결과도 동일하였다. 하지만 각각의 추출물을 1%로 처리한 결과에서는 NR assay에서는 SW[를 제외한 모든 시료가 10% 미만의 생존율을 나타내었고, MTT saay의 경우에는 SWI와 SWS를 제외하고는 모두 10% 이하의 생존율을 나타내었다.
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