[논문]호흡기질환에서 줄기세포

장안수

doi:10.4046/trd.2007.63.2.121

문제 정의

논문분석: 배아줄기세포가 기도상피세포로 분화하는 것으로 확인되어 기도상피질환의 세포치료제로의 가능성을 제시하였다.
논문분석: 이 논문은 동물 실험이지만 중간엽 줄기세포가 손상된 폐에서 더 많이 모이고 폐포 상피세포 type 1, type 2와 fibroblasts, myofibroblasts로 분화하며, 또한 세포 분화에 주위 환경(microenvironment)이 영향을 주어 폐손상을 억제함을 보여주는 논문으로 줄기세포치료가 폐에서 세포손상, 폐섬유화의 억제에 치료제로 사용될 수 있음을 보여주는 논문으로 생각된다. 그러나 분화된 세포가 fibroblasts, myofibroblasts로 분화하여 만성폐쇄성폐질환이나, 중증 천식에서 이러한 세포들이 위해한 영향을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있어 더 많은 연구가 필요할 것이다.
배아줄기세포의 다양한 세포로의 분화는 세포치료제의 가능성을 제시한다. 따라서 이 연구에서는 배아줄기세포로부터 기도상피세포로의 분화가능성을 알아보고자하였다.
골수나 제대혈 등 에서 얻어지는 조혈줄기세포 및 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)는 다양한 분화능력으로 치료에 응용되고 있는 세포이다. 따라서 최근 발표된 줄기세포 관련 논문을 분석하고 향후 폐질환에서 응용 가능성을 알아보고자 한다.
말초 혈관내피 progenitor 세포는 혈관내피세포의 항상성을 유지한다. 이 연구는 폐쇄성 및 제한성폐질환의 임상적 지표와 말초혈액의 혈관내피 progenitor 세포 수와 관련성을 평가하였다.
배경: 중간엽 줄기세포는 폐포상피세포 type 1, type 2, 그리고 fibroblast, 기관지 상피세포로로 분화하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서 쥐에서 bleomycin 처치로 폐손상 모델을 만들고 중간엽 줄기세포로 세포치료하여 중간엽 줄기세포가 폐손상의 회복에 관여하는지, 어떤 세포로 분화하는지, 세포분화에 관여하는 환경(miroenvironments)은 무엇인지 등을 알아보고자 하였다.
손상된 CFTR 기능을 정상적인 기도 상피로 변화시키는 것이 낭성섬유화증의 근본적인 치료법이다. 이 연구의 목적은 CFTR 유전자를 교정한 중간엽 줄기세포를 이용하여 정상적인 기도상피로의 분화를 확인하기 위함이다.

가설 설정

가설: 급성폐손상에서 말초 혈관내피 progenitor 세포가 증가하고 이러한 증가가 급성폐손상과 급성호흡부전증후군의 예후에 좋은 영향을 미칠 것이다.

제안 방법

결과: Mouse cell line의 배아줄기세포를 배양하여 non-ciliated secretory Clara cells로 분화하고 type 1 collagen이 분화유도에 영향을 미침을 확인하였다. 그리고 air-liquid interface에 배양 시 배아줄기세포가 기도상피로 분화하고, 분화된 세포는 정상적인 기관-기관지상피세포와 유사한 basal, ciliated, intermediate, Clara cells로 구성되며 전자현미경에서 섬모의 중앙에 tubule-doublet과 주위에 9쌍의 tubule을 확인하였다(Figure 4).
방법: 산소치료를 받고 있는 폐쇄성 및 제한성폐질환 각각 15명과 대조군 15명을 대상으로 하였으며 각 환자의 말초혈액에서 혈관내피 progenitor 세포 수를 세었으며, 혈관내피 progenitor 세포 표면항원 마커는 CD33, CD133, kinase-insert domain으로 하였다. 그리고 폐기능검사, 동맥혈가스분석, 혈액세포분획 등과 혈관내피 progenitor 세포 수와의 관련성을 분석하였다.
방법: Mouse cell line의 배아줄기세포를 배양하여 기도상피세포로 분화하는 것을 확인하고 type 1 collagen이 분화유도에 영향을 미치는 지를 확인하며, air-liquid interface에 배양 시 배아줄기세포가 기도상피로 분화하는지, 분화된 세포는 정상적인 기관-기관지상피세포와 유사한지 등을 RT-PCR, 면역화학염색, Western blotting, 전자현미경으로 확인하였다.
방법: busulfan 20 mg/kg로 골수를 억제하고 4 U/kg bleomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처치하여 기도손상을 일으킨 동물모델에서 대식세포[anti-CD11b (BD, Palo Alto, CA)]와 조혈모세포[anti-CD45 (BD)] 항체로 혈액줄기세포를 분리하고 5×106 cells/ml의 중간엽 줄기세포를 꼬리에 주입한 후 중간엽줄기세포의 분화와 microenvironments 변화를 조직학적인 방법, 사이토카인 측정 등을 통하여 확인하고, 중간엽 줄기세포 주입 후 14일까지 추적관찰하였다.
방법: 골수에서 유래하는 중간엽 줄기세포를 분리하여 air-liquid 배양 체계를 이용하여 중간엽 줄기세포가 기도상피세포로 분화하는지 알기위해 면역조직염색, flow cytometry, 광학현미경 등으로 확인하고, CFTR유전자 교정 중간엽 줄기세포가 cAMP 자극에 의해 chloride분비에 영향을 미치는가를 Clefflux분석으로 확인하였다.
방법: 산소치료를 받고 있는 폐쇄성 및 제한성폐질환 각각 15명과 대조군 15명을 대상으로 하였으며 각 환자의 말초혈액에서 혈관내피 progenitor 세포 수를 세었으며, 혈관내피 progenitor 세포 표면항원 마커는 CD33, CD133, kinase-insert domain으로 하였다. 그리고 폐기능검사, 동맥혈가스분석, 혈액세포분획 등과 혈관내피 progenitor 세포 수와의 관련성을 분석하였다.
방법: 초기 급성폐손상 환자 45명, 기관 삽관 대조군 10명, 건강대조군 7명을 대상으로 혈액에서 PBMC를 분리하여 세포배양판에 배양 후 24시간에 non-adherent 세포를 제거 후 1× 106 cells/well로 배양 판에 분주 후 7일에 콜로니 수를 세었다.

성능/효과

Kaplan-Meier curve of patients with ALI stratified by EPC CFU count of greater than or equal to 35 (red line) or less than 35 (green line). Patients with ALI with an EPC CFU count of greater than 35 had a survival benefit, with approximately 70% of these patients alive at 28 days, compared with 35% in those patients with EPC CFUs less than 35. p˂0.
결 과: 혈관내피세포 콜로니가 정상대조군에 비해 급성폐손상 환자에서 유의하게 증가하였으나(p<0.05, Figure 1), 급성폐손상과 기관삽관 대조군과는 차이가 없었다.
결과: Mouse cell line의 배아줄기세포를 배양하여 non-ciliated secretory Clara cells로 분화하고 type 1 collagen이 분화유도에 영향을 미침을 확인하였다. 그리고 air-liquid interface에 배양 시 배아줄기세포가 기도상피로 분화하고, 분화된 세포는 정상적인 기관-기관지상피세포와 유사한 basal, ciliated, intermediate, Clara cells로 구성되며 전자현미경에서 섬모의 중앙에 tubule-doublet과 주위에 9쌍의 tubule을 확인하였다(Figure 4).
결과: bleomycin 처치군에서 기도손상이 증가되었고, 중간엽 줄기세포 처치군에서 2주 동안 쥐의 생존율이 100%이었으며, 기도의 염증세포 및 폐손상, 폐섬유화가 유의하게 감소하였다. 중간엽 줄기세포는 손상된 폐에서 폐포 상피세포 type 1, type 2, fibroblasts, myofibroblasts로 분화하였다(Figure 6).
결과: 만성저산소증 폐질환환자에서 혈관내피 progenitor 세포 수가 대조군에 비해 낮았고, 제한성 폐질환환자에서 폐쇄성폐질환환자 보다 더 낮았으며 세포 자연사는 증가하였다(Figure 3). 제한성폐질환 환자에서 혈관내피 progenitor 세포 수의 감소는 폐용량감소, 폐포모세혈관 확산장애와 관련되며 적혈구 수와 연관이 있었다.
결과: 중간엽줄기세포는 air-liquid 배양 체계에서 기도상피세포로 분화하였으며 CFTR 유전자를 교정한 중간엽줄기세포가 cAMP 자극으로 chloride를 분비하였다(Figure 5).
결론: 말초 혈관내피 progenitor 세포 수 감소는 만성폐질환과 만성적 저산소증과 관련이 있으며, 특히 제한성폐질환의 중증도와 관련이 있었다. 말초 혈관내피 progenitor 세포 수의 감소는 이러한 질환의 혈관내피세포의 균형의 변화에 의해 일어남을 제시한다.
결론: 말초 혈관내피 progenitor 세포 수 증가는 급성폐손상 환자의 생존율을 증가시킨다
결론: 중간엽 줄기세포는 손상된 폐로 모여서 여러 가지 세포로 분화하고 폐염증을 감소시키고 세포 성장인자의 생성을 증가시킨다.
결론: 중간엽줄기세포를 이용하여 낭성 섬유화증에서 CFTR 유전자의 세포치료 가능성을 제시하였다.
급성폐손상 환자에서 콜로니 수가 증가할수록 생존기간이 증가하였다(Figure 2). 나이, 성별, 병의 중증도를 보정하였을 때 콜로니수가 35개 이상인 군에서 사망률이 30%, 35개 미만인 군에서 61%로 콜로니 수가 많은 군에서 사망률이 낮았다.
결과: 만성저산소증 폐질환환자에서 혈관내피 progenitor 세포 수가 대조군에 비해 낮았고, 제한성 폐질환환자에서 폐쇄성폐질환환자 보다 더 낮았으며 세포 자연사는 증가하였다(Figure 3). 제한성폐질환 환자에서 혈관내피 progenitor 세포 수의 감소는 폐용량감소, 폐포모세혈관 확산장애와 관련되며 적혈구 수와 연관이 있었다. 폐쇄성폐질환에서는 혈관내피 progenitor 세포 수와 기도폐쇄, 산소분압과 관련이 있었다.

후속연구

논문분석: 이 논문은 동물 실험이지만 중간엽 줄기세포가 손상된 폐에서 더 많이 모이고 폐포 상피세포 type 1, type 2와 fibroblasts, myofibroblasts로 분화하며, 또한 세포 분화에 주위 환경(microenvironment)이 영향을 주어 폐손상을 억제함을 보여주는 논문으로 줄기세포치료가 폐에서 세포손상, 폐섬유화의 억제에 치료제로 사용될 수 있음을 보여주는 논문으로 생각된다. 그러나 분화된 세포가 fibroblasts, myofibroblasts로 분화하여 만성폐쇄성폐질환이나, 중증 천식에서 이러한 세포들이 위해한 영향을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있어 더 많은 연구가 필요할 것이다. 또한 분화된 세포들이 얼마동안 효과가 있을 것인지, 투여되는 세포의 수의 변화가 치료에 대한 효과를 증대 시킬 수 있을 것인지에 대한 연구가 필요하고, 사람에서 일반적인 치료에 반응하지 않는 폐섬유화증 이나, 만성 천식에서 임상연구가 필요할 것으로 생각된다.
논문분석: 말초 혈관내피 progenitor 세포의 분석을 콜로니로 하였는데 줄기세포의 마커나 면역화학염색을 통하여 확인하지 않아 콜로니가 줄기세포외에 다른 세포의 혼합 가능성을 배제하기 어려운 점이 있고 동물실험에서 밝혀진 것처럼 혈관내피 progenitor 세포가 1형 상피세포, 섬유아세포, 대식세포 등으로 분화하여 어떻게 급성 폐손상에 영향을 미치었는지에 대한 기전연구가 필요하다.
논문분석: 이 논문은 air-liquid 배양 체계를 이용한 논문으로 환자에서의 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
그러나 분화된 세포가 fibroblasts, myofibroblasts로 분화하여 만성폐쇄성폐질환이나, 중증 천식에서 이러한 세포들이 위해한 영향을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있어 더 많은 연구가 필요할 것이다. 또한 분화된 세포들이 얼마동안 효과가 있을 것인지, 투여되는 세포의 수의 변화가 치료에 대한 효과를 증대 시킬 수 있을 것인지에 대한 연구가 필요하고, 사람에서 일반적인 치료에 반응하지 않는 폐섬유화증 이나, 만성 천식에서 임상연구가 필요할 것으로 생각된다.

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