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문제 정의
- 있다. 그러므로 반응의 조건을 일부 변형함으로써 비특이적 반응을 최소화 시킨 최적화된 다중 중합효소 연쇄반응조건을 확립하고자하였다(3, 9). 먼저 각 primed 유사한 Tm값(melting temperature)을가지도록 함은 물론 primer sequence?]- 상호 결합하지 못하도록함으로서 교차반응을 일으키지 않도록 하였다.
- 생체세포에 감염을 일으키는 DNA 바이러스 4종 B19, CMV, EBV, HBV 등은 세포 괴사나 종양을 일으킬 수 있는 바이러스로 인류건강에 위해 요인으로 작용해 왔다. 그러므로 본 연구에서는 B19, CMV, EBV, HBV와 같은 DNA 종양 바이러스를 혈액을 포함하는 생검시료에서 효율적으로 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄 반응법을 확립하고자 하였다.
- 또한 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과 목적하는 유전자와 정확히 일치함을 확인하였다. 따라서 본시험의 조건하에서 각각의 primer쌍은 표적 유전자와 결합이 가능하고 표적 DNA 부분의 증폭을 위한 목적으로 사용 가능하다고 판단하였다.
제안 방법
- 먼저 각 primed 유사한 Tm값(melting temperature)을가지도록 함은 물론 primer sequence?]- 상호 결합하지 못하도록함으로서 교차반응을 일으키지 않도록 하였다. 특히, extension (72。(2)과 annealing (55℃) 과정을 별도로 수행하면 개별 바이러스의 검출에는 별다른 영향이 없었으나 다중반응 수행 시에는 교차반응에 의한 억제현상이 나타났으므로 두 과정을 동시에 수행 가능한 온도인 68。(2를 선택하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다(자료 미제시). 이 같은 시험조건하에서 4종의 바이러스에 대한 반응산물이 동일한 비율로 생성됨을 확인하였다(Fig.
- 배양 후, 배양액 200 μ1를 ampicillin (50 |ig/ml), IPTQ X-Gal이 포함된 LB agar plate에 도말하여 37℃ 에서 20시간 배양하였다. 1차로 white colony만을 선별하여 colony PCR을 이용해 유전자 삽입 여부를 확인한 후, DNA sequencing을 통하여 삽입된 표적 유전자의 염기서열을 확인하였다. 확보된 바이러스 유전자들은 PCR 조건의 최적화 과정과 다중 중합효소 연쇄반응에서 양성 대조군으로 이용하였다.
- 합성하였다(Table 1). B19-F, B19-R, EBV-F, EBV-R, CMV-F, CMV-R, HBV-F, HBV-R 등의 primer가 증폭되는 염기서열 사이에 유사성을 최소화하고 자체내의 base-paring0] 이루어지지 않으며 비특이적 반응을 억제할 수 있도록 각 바이러스 genome 염기서열을 분석하여 높은 Tm값을 갖는 8개의 primer를 고안하였다. 각 primer는 B19의 ns 유전자에 결합하는 B19-F와 B19-R primer, EBV의 pol 유전자에 결합하는 EBV-F와 EBV-R primer, CMV의 pol 유전자에 결합하는 CMV-F와 CMV-R 그리고 HBV의 pol 유전자를 targeting 하는 HBV-F와 HBV-R이다 (Table 1).
- CMV, EBV, HBV의 viral 유전자를 증폭하기 위하여 각각의 pol 유전자에 결합하는 CMV-F와 CMV-R, HBV-F와 HBV-R, EBV-F와 EBV-R primer pair를 사용하였고, B19은 B19의 ns 유전자에 결합하는 B19-F와 B19-R primer pail를 사용하여 각각의 viral gene에 대한 PCR 반응을 수행하였다(Table 1). PCR 반응의 반응시간 및 온도조건은 다음과 같다.
- 목적하는 EBV, CMV, HBV 와 B19 바이러스 유전자의 증폭을 위하여 각각의 primer 당 20 pmoles/|jl가 되도록 Table 1의 8종의 primer를 혼합하여 사용하였다. Premix는.25 μ1 반응 기준으로 lx PCR buffer [50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2], 각각 200 |1M의 deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 각각 20 pmoles/|il씩 8종의 primer mixture, 0.5 U Taq polymerase (Solgent, Korea)와 template DNA를 가하여 다중 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
- Specific amplification of viral genomes by multiplex PCR. The multiplex PCR was carried out using the primer pool (B19-F and R for BQ, HBV-F and R for HBV, CMV-F and R for CMV, EBV-F and R for EBV). (A) 1 pg of total DNA from human blood cell was spiked with 0.
- 다중 중합효소 연쇄반응을 최적화 하기 위하여 magnesium ion, primer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP) 농도 및 PCR buffer 조건, DNA polymerase의 종류, cycling condition을 결정하였으며 재현성 확보를 위하여 t* emplate 제외한 모든 성분을 2X premix 형태로 혼합하여 사용하였다. 목적하는 EBV, CMV, HBV 와 B19 바이러스 유전자의 증폭을 위하여 각각의 primer 당 20 pmoles/|jl가 되도록 Table 1의 8종의 primer를 혼합하여 사용하였다.
- 이를 molecule 수가 50 copies가 되도록 하여 다중 중합 효소 연쇄반응의 주형으로 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 또한 다중 중합효소 연쇄반응의 감도를 결정하기 위하여 최적화된 조건에서 각각의 클론된 viral DNA를 10-fold 계열 희석하고 이를 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다. 이때 input의 양을 기준으로 환산하여 PCR 반응물에서의 template copy 수를 결정하였으며 다섯 번의 시험결과를 평균하여 감도를 결정하였다.
- 또한 생체 조직을 시료로 이용하였을 때 본 다중 중합효소 연쇄반응의 특이성이 유지되는지 시험하고자 재료 및 방법에서와같이 준비한 혈액 시료에 viral genome을 spiking하고 이를 주형으로 하여 동일한 조건으로 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 음성대조군으로서 viral genome을 spiking 하지 않은 시험관을 함께 반응시켰다.
- 1 and 2). 또한 생체조직에 대해서도 다중 중합효소 연쇄반응의 특이성이 유지되는지 알아보기 위하여 생쥐의 간(liver) 조직과 인간 혈액 시료에 각각 50 copies의 viral genome을 spiking하고 total DNA를 정제하여 이를 주형으로 같은 조건에서 다중 중합 효소 연쇄반응을 수행한 결과 정제한 바이러스 DNA를 이용하였을 때와 마찬가지로 유의성 있게 증폭되었다(Fig 2). 그러므로 본 연구에서 확립한 네 종의 바이러스에 대한 다중 중합효소 연쇄반응은 생체 시료를 이용한 바이러스의 검출 진단법으로 응용 가능한 방법이라 할 수 있다.
- 증폭된 viral DNA의 확인을 위하여 PCR 산물의 일부를 2% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 UV transillu-minator 로 증폭여부를 확인하였다. 또한 필요할 경우 염기서열을 dideoxy nucleotide 법으로 결정 (Solgent, Korea) 하여 반응물의 진위를 최종 확인하였다.
- 먼저, 개별 바이러스에 대한 PCR 반응을 수행하기 위하여 하나의 시험관에서 수행되는 다중 중합효소 연쇄반응에서도 특이적으로 EBV, CMV, HBV 와 B19 vines의 증폭이 가능한 primer pair를 합성하였다(Table 1). B19-F, B19-R, EBV-F, EBV-R, CMV-F, CMV-R, HBV-F, HBV-R 등의 primer가 증폭되는 염기서열 사이에 유사성을 최소화하고 자체내의 base-paring0] 이루어지지 않으며 비특이적 반응을 억제할 수 있도록 각 바이러스 genome 염기서열을 분석하여 높은 Tm값을 갖는 8개의 primer를 고안하였다.
- premix 형태로 혼합하여 사용하였다. 목적하는 EBV, CMV, HBV 와 B19 바이러스 유전자의 증폭을 위하여 각각의 primer 당 20 pmoles/|jl가 되도록 Table 1의 8종의 primer를 혼합하여 사용하였다. Premix는.
- 바이러스 DNA의 증폭을 위한 PCR반응은 IX PCR buffer, 각각 200 |1M의 deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dUTP)와 바이러스 종에 따라 특이적인 20 pmole씩의 forward 및 reverse primer pair, 0.5 U의 Taq polymerase (Solgent, Korea)를 가한 후 25 μ1가 되도록 멸균증류수를 가하여 수행하였다. 이때 바이러스로부터 추출, 정제된 viral DNA 0.
- 생체 조직에 대하여 본 다중 중합효소 연쇄반응의 특이 성이 유지되는지 시험하기 위하여 0.5 g의 minced 생쥐의 간(liver) 조직 또는 건강한 사람의 혈액 5 ml에 cloning한 표적 viral DNA 를 각각 100 pg씩 넣고 이 sample로부터 total DNA를 분리, 정제하였다. 이를 molecule 수가 50 copies가 되도록 하여 다중 중합 효소 연쇄반응의 주형으로 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
- 또한 다중 중합효소 연쇄반응의 감도를 결정하기 위하여 최적화된 조건에서 각각의 클론된 viral DNA를 10-fold 계열 희석하고 이를 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다. 이때 input의 양을 기준으로 환산하여 PCR 반응물에서의 template copy 수를 결정하였으며 다섯 번의 시험결과를 평균하여 감도를 결정하였다.
- 5 U의 Taq polymerase (Solgent, Korea)를 가한 후 25 μ1가 되도록 멸균증류수를 가하여 수행하였다. 이때 바이러스로부터 추출, 정제된 viral DNA 0.1 μg를주형으로 사용하였고, GeneAmp PCR system 2700 (ABI PCR system, PE Applied Biosystems, USA) PCR 장비를 이용하였다.
- 5 g의 minced 생쥐의 간(liver) 조직 또는 건강한 사람의 혈액 5 ml에 cloning한 표적 viral DNA 를 각각 100 pg씩 넣고 이 sample로부터 total DNA를 분리, 정제하였다. 이를 molecule 수가 50 copies가 되도록 하여 다중 중합 효소 연쇄반응의 주형으로 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 또한 다중 중합효소 연쇄반응의 감도를 결정하기 위하여 최적화된 조건에서 각각의 클론된 viral DNA를 10-fold 계열 희석하고 이를 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다.
- 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위하여 Puregene DNA purification kit (Gentra, USA)을 사용하여 EBV, CMV, HBV, B19 등의 genomic DNA를 추출하였다. 필요에 따라 spin column (Highpure Viral Nucleic Acid Extraction Column, Roche Diagnostics, Germany) 등으로 추출한 DNA를 핵산분해효소가 없는 멸균 D.
- 중합효소 연쇄반응을 이용하여 EBV, CMV, HBV와 B19 바이러스 genome을 각각 증폭하기 위하여 각각 CMV, EBV와 HBV 의 pol 유전자에 결합하는 CMV-F와 CMV-R primer, HBV-F 와 HBV-R primer 및 EBV-F와 EBV-R primer, parvovirus Bl9의 ns 유전자에 결합하는 B19-F와 B19-R primer을 제작하고 각각의 primer pair를 사용하여 반응을 수행하였다(Table 1). Predenaturation 과정은 95℃에서 2분, extension condition을 annealing step 과 함께 68℃ 1분의 조건으로 수행하였다.
- 50。(2에서 3분, 95 ℃ 에서 2분간 pre-incubation하고 95℃ 20초, 68℃ 1분을 40회 반복한 후 7TC에서 3분 더 반응시켰다. 증폭된 viral DNA의 확인을 위하여 PCR 산물의 일부를 2% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 UV transillu-minator 로 증폭여부를 확인하였다. 또한 필요할 경우 염기서열을 dideoxy nucleotide 법으로 결정 (Solgent, Korea) 하여 반응물의 진위를 최종 확인하였다.
- 증폭된 바이러스 유전자의 확보의 확인을 위하여 PCR 반응에 의해 증폭시킨 4종의 viral 유전자 단편을 Topo TA Cloning kit (Invitrogen, US A)를 사용하여 제한효소 처리과정 없이 cloning 하였다. pCR2.
- 이와 같은 사항을 고려하여 Table 1에서와 같은 primer pairt 설정하고 몇 번의 시행착오를 거쳐 네 종의 바이러스 모두 검출 가능한 thermo cycling 조건을 확립하였다(9, 10, 23). 특히, 본 연구에서는 annealing과 extension을 68℃에서 수행하는 2단계 반응으로 유전자 증폭 반응을 수행함으로써 primer의 결합 특이성을 증가시키고 교차반응을 최소화하였다 .
- DNA를 추출하였다. 필요에 따라 spin column (Highpure Viral Nucleic Acid Extraction Column, Roche Diagnostics, Germany) 등으로 추출한 DNA를 핵산분해효소가 없는 멸균 D.W. (0.05% NP-40 포함)로 elute하고, spectrophotometry 정 량방법을 이용하여 양과 순도를 결정하였다. 사용하기 전까지는 -20。(2에서 보관하였다가 PCR 반응에 시료로 사용하였다.
- 확립한 다중 중합효소 연쇄반응으로 목적하는 바이러스 검출 효율성을 평가하기 위하여 최적화한 cycling 조건에 따라 하나의 시험관에 각각 50 copies의 viral DNA를 주형으로 하고 합성한 8종의 primer pool을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응물의 일부를 2% agarose gel에서 전기영동 하여 분석한 결과 각 개별 바이러스에 대한 PCR반응을 수행한 결과와 마찬가지로 다중 중합효소 연쇄반응 조건에서도 각각의 바이러스 유전자가 모두 효율적으로 증폭됨을 확인하였다(Fig.
- 1차로 white colony만을 선별하여 colony PCR을 이용해 유전자 삽입 여부를 확인한 후, DNA sequencing을 통하여 삽입된 표적 유전자의 염기서열을 확인하였다. 확보된 바이러스 유전자들은 PCR 조건의 최적화 과정과 다중 중합효소 연쇄반응에서 양성 대조군으로 이용하였다.
성능/효과
- 이때 음성대조군으로서 viral genome을 spiking 하지 않은 시험관을 함께 반응시켰다. 그 결과 사람의 혈액과 같은 생체시료를 대상으로 하여도 정제된 viral DNA를 대상으로 다중 중합 효소 연쇄반응을 수행한 결과와 마찬가지로 매우 특이적으로 viral genome을 증폭할 수 있었다(Fig. 2). 또한 확립한 다중 중합 효소 연쇄반응의 감도를 결정하기 위하여 각각의 클론된 viral DNA를 10-fold 계열 희석하고 이를 주형으로 사용하여 반응을 수행한 결과 음성 대조군에서는 어떠한 반응물도 생성되지 않았고 B19, CMV, EBV, HBV 각 개별 바이러스 유전자는 모두 5- 10 copies 까지 유의성 있게 증폭되었다(Fig.
- 또한 생체조직에 대해서도 다중 중합효소 연쇄반응의 특이성이 유지되는지 알아보기 위하여 생쥐의 간(liver) 조직과 인간 혈액 시료에 각각 50 copies의 viral genome을 spiking하고 total DNA를 정제하여 이를 주형으로 같은 조건에서 다중 중합 효소 연쇄반응을 수행한 결과 정제한 바이러스 DNA를 이용하였을 때와 마찬가지로 유의성 있게 증폭되었다(Fig 2). 그러므로 본 연구에서 확립한 네 종의 바이러스에 대한 다중 중합효소 연쇄반응은 생체 시료를 이용한 바이러스의 검출 진단법으로 응용 가능한 방법이라 할 수 있다. 또한 본 시험방법의 감도는 약 5-10 분자수의 viral genome까지 증폭이 가능한 매우 민감한 시험법임을 확인하였다(Fig.
- 2). 따라서 본 시험조건하에서 4종의 primer pair> 이용하여 다중중합 효소 연쇄반응을 수행하여 B19, CMV EBV와 HBV의 동시검출이 가능함을 확인하였다.
- 특히, 조직이식환자의 경우 CMV는 활성화되어 혈액 내에서 발견되기도 한다. 따라서 본 연구에서 수행한 4 종의 바이러스 동시 검출법은 검출감도와 시험의 효율성을 근거로 할 때, 생검 시료의 바이러스 검출법으로 유용하다고 판단된다.
- 그러므로 본 연구에서 확립한 네 종의 바이러스에 대한 다중 중합효소 연쇄반응은 생체 시료를 이용한 바이러스의 검출 진단법으로 응용 가능한 방법이라 할 수 있다. 또한 본 시험방법의 감도는 약 5-10 분자수의 viral genome까지 증폭이 가능한 매우 민감한 시험법임을 확인하였다(Fig. 3). 그러므로 단일 시험으로 특이적이고도 높은 감도로 검출이 가능한 본 연구의 결과는 HBV, EBV, CMV, B19 바이러스에 대한 진단법으로써 가치가 있으며 생검시료와같은 임상검체에 적용이 가능할 것이라고 사료된다.
- 1). 또한 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과 목적하는 유전자와 정확히 일치함을 확인하였다. 따라서 본시험의 조건하에서 각각의 primer쌍은 표적 유전자와 결합이 가능하고 표적 DNA 부분의 증폭을 위한 목적으로 사용 가능하다고 판단하였다.
- 2). 또한 확립한 다중 중합 효소 연쇄반응의 감도를 결정하기 위하여 각각의 클론된 viral DNA를 10-fold 계열 희석하고 이를 주형으로 사용하여 반응을 수행한 결과 음성 대조군에서는 어떠한 반응물도 생성되지 않았고 B19, CMV, EBV, HBV 각 개별 바이러스 유전자는 모두 5- 10 copies 까지 유의성 있게 증폭되었다(Fig. 3). 더욱이 사람의 혈액 또는 생쥐 간의 마쇄 조직에 spiking한 시료를 사용하였을 때도 유사한 수준의 검출감도를 유지하였다(자료 미제시).
- 반응물의 일부를 2% agarose gel에서 전기영동 하여 분석한 결과 각 개별 바이러스에 대한 PCR반응을 수행한 결과와 마찬가지로 다중 중합효소 연쇄반응 조건에서도 각각의 바이러스 유전자가 모두 효율적으로 증폭됨을 확인하였다(Fig. 2 and 3).
- 특히, extension (72。(2)과 annealing (55℃) 과정을 별도로 수행하면 개별 바이러스의 검출에는 별다른 영향이 없었으나 다중반응 수행 시에는 교차반응에 의한 억제현상이 나타났으므로 두 과정을 동시에 수행 가능한 온도인 68。(2를 선택하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다(자료 미제시). 이 같은 시험조건하에서 4종의 바이러스에 대한 반응산물이 동일한 비율로 생성됨을 확인하였다(Fig. 2). 따라서 본 시험조건하에서 4종의 primer pair> 이용하여 다중중합 효소 연쇄반응을 수행하여 B19, CMV EBV와 HBV의 동시검출이 가능함을 확인하였다.
- Predenaturation 과정은 95℃에서 2분, extension condition을 annealing step 과 함께 68℃ 1분의 조건으로 수행하였다. 이와 같은 조건으로 PCR반응을 진행한 결과 B19 (175 bp), CMV (350 bp), HBV (262 bp), EBV (470 bp) 모두 예상했던 크기의 증폭산물을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 또한 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과 목적하는 유전자와 정확히 일치함을 확인하였다.
- 최적화한 조건에 따라 단일 시험관에서 PCR 반응을 수행한 결과 각각에 대한 개별 반응을 수행하였을 때와 마찬가지로 B19, CMV, EBV, HBV 모두 특이적으로 증폭되었다(Fig. 1 and 2). 또한 생체조직에 대해서도 다중 중합효소 연쇄반응의 특이성이 유지되는지 알아보기 위하여 생쥐의 간(liver) 조직과 인간 혈액 시료에 각각 50 copies의 viral genome을 spiking하고 total DNA를 정제하여 이를 주형으로 같은 조건에서 다중 중합 효소 연쇄반응을 수행한 결과 정제한 바이러스 DNA를 이용하였을 때와 마찬가지로 유의성 있게 증폭되었다(Fig 2).
후속연구
- 3). 그러므로 단일 시험으로 특이적이고도 높은 감도로 검출이 가능한 본 연구의 결과는 HBV, EBV, CMV, B19 바이러스에 대한 진단법으로써 가치가 있으며 생검시료와같은 임상검체에 적용이 가능할 것이라고 사료된다.
- 더욱이 사람의 혈액 또는 생쥐 간의 마쇄 조직에 spiking한 시료를 사용하였을 때도 유사한 수준의 검출감도를 유지하였다(자료 미제시). 그러므로 본 연구에서 설정한 다중 중합효소 연쇄반응은 생체시료에 대해서도 그 반응의 특이성이 뛰어난 바이러스 진단 방법으로 이용할 수 있을 것이라고 판단된다.
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