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문제 정의
- dicentrarchiel 경우가 많은 것建 보인다. 본 연구는 이와 같이 양^넙치에 많은 피해를 입히는 것으로 추정되는 P die函trarchi의 증식환경과 생육조건, 화합물에 의한 구제효과 등을 조사하였다.
제안 방법
- 하였다. 실험방법은 멸균 지하해수에 화합물을 희석한 후 약욕처리를 하였는데, 0 87 mm petri dish에 멸균 지하 해수와 화합물을 희석한 용액 20 mL를 분주한 다음 비브리오균을 먹이로 배양된 P. dicentrarchi를 1.0x10"* cells/mL 농도로 접종시켰다. 구제효과는 화합물의 농도별로 180분 동안 약욕을 하면서 시간경과에 따른 충의 운동성과 형태적 변화를 현미경 (Olympus, BX 50, Japan) 400 배율로 관찰흐]였다.
- V. lentus 균을 먹이로 하여 15。(2에서 11일 동안 생육상태를 관찰하였다.
- 2), 온도별 생육시험과 같은 방법으로 V. lentus 균을 먹이로 하여 15。(3에서 11일 동안 생육상태를 관찰하였다.
- 해산 크로렐라로 배양한 로티퍼, Brachionus 를 멸균해수로 3회 세적한 후 물기를 제거하고 -701에 냉동 보관한 후 먹이로 이용하였다. Millport S 용액에 냉동된 로티퍼 0.5 mg/mL 혼합하여 배양용액(pH 7.2)을제조했는데, 로티퍼의 양은 사전에 예비실험을 통하여 충분히 충이 섭이하고 증식 가능한 양으로 정하였다. 충의 접종과 배양 온도, 기간 등은 세포주를 이용한 배양과 같은 조건으로 하였다.
- P. dicentrarchi의 생육환경 조건을 파악하기 위해 온도, pH 및 염분농도 등을 각각 다른 조건에서 배양하면서 생육상태를 관찰하였다. 실험구별로 충의 운동성과 형태변화, 증식 여부를 관찰하고 배양시간 경과에 따라 증식(+++), 생존(++), 감소(+), 사망 (-) 등으로 구분하였다.
- pH 6~9까지 생존 및 증식을 하였으며 pH 7~8 범위에서 활발한 증식이 이루어졌다. pH 5 및 pH 10에서는 접종 후 폐사하였다(Table 4).
- ±1시간 내에 실시하였다. 계수방법은 배양那지 6 卜iL를 pipetting하여 counting chamber 위에서 glutaraldehyde (Sigma, USA) 1% 용액을 소량 첨가하여 충을 고정한 후 cover glass (18x18 mm)로 덮어 광학 현미경 (Olympus, BX 50, Japan) 200 배율로 계수한 후 cells/mL로 환산하였다.
- 넙치 뇌조직을 이용한 배양과 같은 조건에서 뇌조직 대신 로티퍼를 첨가하여 제조하였다. 해산 크로렐라로 배양한 로티퍼, Brachionus 를 멸균해수로 3회 세적한 후 물기를 제거하고 -701에 냉동 보관한 후 먹이로 이용하였다.
- 넙치 뇌조직을 이용한 배양과 같은 조건에서 뇌조직 대신 충의 먹이로 H사의 넙치 치어 배합사료(0 0.5-0.6 mm, extruded pellet, Table 1)를 Millport S 용액에 1 mg/mL 첨가하여 배지를 제조하였다(pH 7.2). 배지에 혼합하는 치어 배합사료의 양은 사전에 예비실험을 통하여 충이 충분히 섭이하고 증식 가능한 양으로 정하였으며, 충의 접종과 배양 온도, 기간 등은 세포주를 이용한 배양과 같은 조건으로 하였다.
- 멸균 지하해수에 BHI 배지 (Merck, Germany)를 0.1% 첨가하여 기본배지 (SW BHI)를 제작하였다. 25 mL의 cell culture flask (Nunc, Denmark)에 SW BHI 배지를 10 mL 분주하고 중의 먹이로 V.
- 지금까지 배합사료, 뇌조직, 로티퍼 조직을 이용한 배양 과정에 대해서는 보고된 바 없어 예비실험을 통하여 증식 가능한 농도를 정하였다. 배양결과 전 실험구 모두 활발히 증식하였으나 특히 어류 주화세포, 세균, 치어용 배합사료 등을 먹이로 하여 10, cells/mL 내외의 고밀도로 증식하였다. Iglesis et al (2003)은 FBS 와 lipids가 포함된 L-15 medium을 이용하여 P.
-
2) 세균을 이용한 배양
배양배지는 Provasoli et al. (1957)의 Millport S 용액(NaCl 1.5 g, MgCl2-6H2O 0.25 g, KC1 0.04 g, CaSO4 0.012 g/distilled water 100 mL) 에 BH1 (Brain Heart Infusion) broth (Merck, Germany) 배지를 0.1% 첨가한 후 12FC에서 15분간 멸균시켜 Millport BHI 배지 (pH 7.2)를 제작하였다. 제작된 Millport BHI 배지를 25 mLE] cell culture flask (Nunc, Denmark)에 10 mL 분주하고 충의 먹이로 넙치 피부에서 분리된 비브리오균, Vibrio lentus를 3.
- 2). 배양액에는 배양 기간 동안에 세균의 증식을 막기 위해 항생제 penicillin (Gibco, USA) 100 IU와 streptomycin (Gibco, USA)을 100 |ig/mL 농도로 첨가하였다. 충의 접종과 배양 온도, 기간 등은 세포주를 이용한 배양과 같은 조건으로 하였다.
- 배지 종류별 배양과정의 스쿠티카충 계수는 접종 후 2일마다 하였으며, 계수 일자별 계수시점은 최초 접종시 접종시간을 기준하여 ±1시간 내에 실시하였다. 계수방법은 배양那지 6 卜iL를 pipetting하여 counting chamber 위에서 glutaraldehyde (Sigma, USA) 1% 용액을 소량 첨가하여 충을 고정한 후 cover glass (18x18 mm)로 덮어 광학 현미경 (Olympus, BX 50, Japan) 200 배율로 계수한 후 cells/mL로 환산하였다.
- dicentrarchi의 생육환경 조건을 파악하기 위해 온도, pH 및 염분농도 등을 각각 다른 조건에서 배양하면서 생육상태를 관찰하였다. 실험구별로 충의 운동성과 형태변화, 증식 여부를 관찰하고 배양시간 경과에 따라 증식(+++), 생존(++), 감소(+), 사망 (-) 등으로 구분하였다.
- (1996)의 효과측정 방법에 따라 판정하였다. 약욕처리 시간 180분 동안 30분 단위로 농도별 시간 경과에 따른 운동성과 형태적 변화를 5단계의 score로 구분하였다(Table 2).
- 양식넙치에서 분리된 스쿠티카섬모중 P. dicentrarchi那 대한생물학적 특성을 규명하기 위해 배양, 생육환경, 화합물의 in vitro 구제실험 등을 실시하였다. P- dicentrarchi 배양실험 결과 세포, 세균, 넙치치어 배합사료, 뇌 조직과 로티퍼 조직 등의 유기물을 먹이로 활발히 증식하였다.
- OxlO3 cells/mL 농도로 하였으며, 15℃ incubator에서 2주간 배양하였다. 어류주화세포 CHSE-214는 modified Eble's medium에 10%의 FBS 및 항생제 penicillin (Gibco, USA) 100 IU와 streptomycin (Gibco, USA)을 100 p.g/mL 농도로 각각 첨가하였다.
- dicentrarchi는 3.0乂1。3 cell/mL 농도로 접종한 후 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35℃ 에서 배양하면서 1!일 동안 생육상태를 관찰하였다(pH 7.2). 생육상태는 배지 종류별 배양시 측정방법과 같은 방법으로 하였다.
- 9*10, cells/mL로 최고 밀도에 도달하여 접종시보다 10배 정도로 증식하였다. 전반적으로 최고밀도 수준에서 장기간 생존하였다(Fig. 1).
- 2)를 제작하였다. 제작된 Millport BHI 배지를 25 mLE] cell culture flask (Nunc, Denmark)에 10 mL 분주하고 충의 먹이로 넙치 피부에서 분리된 비브리오균, Vibrio lentus를 3.0x108 cells/mL농도로 접종시켜 지속적으로 균이 증식되면서 충의 먹이가 되도록 하였다. 먹이로 사용한 V.
- 치어에 배합사료 투여후 수조 저 면에 침적된 사료에서 스쿠티카충이 활발히 증식하는 것이 관찰되며, 넙치의 뇌조직에 침투하여 다량 증식하고, 로티퍼 사체에서도 스쿠터카충이 증식되는 것이 관찰되어 치어용 배합사료와 뇌조직, 로티퍼 조직 등을 이용한 증식과정을 관찰하였다. 지금까지 배합사료, 뇌조직, 로티퍼 조직을 이용한 배양 과정에 대해서는 보고된 바 없어 예비실험을 통하여 증식 가능한 농도를 정하였다. 배양결과 전 실험구 모두 활발히 증식하였으나 특히 어류 주화세포, 세균, 치어용 배합사료 등을 먹이로 하여 10, cells/mL 내외의 고밀도로 증식하였다.
- 양식현장에서 넙치종묘 생산시 자.치어에 배합사료 투여후 수조 저 면에 침적된 사료에서 스쿠티카충이 활발히 증식하는 것이 관찰되며, 넙치의 뇌조직에 침투하여 다량 증식하고, 로티퍼 사체에서도 스쿠터카충이 증식되는 것이 관찰되어 치어용 배합사료와 뇌조직, 로티퍼 조직 등을 이용한 증식과정을 관찰하였다. 지금까지 배합사료, 뇌조직, 로티퍼 조직을 이용한 배양 과정에 대해서는 보고된 바 없어 예비실험을 통하여 증식 가능한 농도를 정하였다.
- 화합물의 종류별 약욕처리 농도는 포르말린 50, 100, 200, 300 및 400 ppm, 그리고 과산화수소 25, 50, 100, 150, 200 및 300 ppm으로 하였다.
대상 데이터
- P. dicentrarchi의 증식환경을 파악하기 위해 어류 주화 세포와 세균, 그리고 양식현장에서 스쿠티카충의 숙주나 먹이로 추정되는 물질을 이용하여 배양하였으며, 반복 실험구는 설정하지 않았다.
- 국내외에서 치료제로 가장 많이 사용되는 포르말린(Merck, Germany)과 과산화수소(Merck, Germany)를 이용하여 in vitro 구제실험을 하였다. 실험방법은 멸균 지하해수에 화합물을 희석한 후 약욕처리를 하였는데, 0 87 mm petri dish에 멸균 지하 해수와 화합물을 희석한 용액 20 mL를 분주한 다음 비브리오균을 먹이로 배양된 P.
- 어류주화세포 Chinook salmon embryo-214 (CHSE-214)를 12 well plate에 1 mL (2><105 cells/mL) 분주한 후 P. dicentrarchi 접종시켜 배양하였다. 충 접종은 CHSE-214 세포주에서 배양시킨 충을 l.
- 제주대학교 해양과학대학 해양생물공학과에서 제주도 북제 주군 지역의 육상양^장에서 양식중인 넙치 치어(14 cm)의 뇌에서 분리하여 silver carbonate와 silver nitrate 방법에 따라 염색 후 형태적 관찰 및 분자계통학적 동정과정을 거쳐 E dicentrarchi 로 동정된 스쿠티카충을 분양받아 실험에 이용하였다.
- 첨가하여 제조하였다. 해산 크로렐라로 배양한 로티퍼, Brachionus 를 멸균해수로 3회 세적한 후 물기를 제거하고 -701에 냉동 보관한 후 먹이로 이용하였다. Millport S 용액에 냉동된 로티퍼 0.
이론/모형
- 약욕처리 후 시간경과에 따른 충의 운동성과 형태적 변화를 Novotny et al. (1996)의 효과측정 방법에 따라 판정하였다. 약욕처리 시간 180분 동안 30분 단위로 농도별 시간 경과에 따른 운동성과 형태적 변화를 5단계의 score로 구분하였다(Table 2).
성능/효과
- 형태적 변화보다 빠르게 나타났다. 150, 200, 300 ppm 처리구 모두 30분 약욕으로 유영력을 상실하였으나 섬모운동은지속되었다. 300 ppm에서 60분 약욕으로 섬모운동까지 완전히 상실하였으며, 200 ppm에서는 90분, 150 ppm과 100 ppm에서는 각각 150분 만에 운동성을 완전히 상실하였다.
- 10~30℃ 범위에서 생존 및 증식이 이루어졌으며, 활발한 증식은 10~251 범위에서 이루어졌다. 3(TC에서는 접종 후 4일간 증식 후 감소하기 시작하여 7일후 전량 폐사하였다. 5。。에서는 접종 후 감소하기 시작하여 3일 후 전량 폐사하였으며, rc와 35。(2에서는 접종직후 전량 폐사하였다(Table 3).
- 150, 200, 300 ppm 처리구 모두 30분 약욕으로 유영력을 상실하였으나 섬모운동은지속되었다. 300 ppm에서 60분 약욕으로 섬모운동까지 완전히 상실하였으며, 200 ppm에서는 90분, 150 ppm과 100 ppm에서는 각각 150분 만에 운동성을 완전히 상실하였다. 50 ppn에서는 60분 약욕으로 유영력을 상실하였으나 섬모운동은 180분 후에 정지되었다.
- dicentrarchi那 대한생물학적 특성을 규명하기 위해 배양, 생육환경, 화합물의 in vitro 구제실험 등을 실시하였다. P- dicentrarchi 배양실험 결과 세포, 세균, 넙치치어 배합사료, 뇌 조직과 로티퍼 조직 등의 유기물을 먹이로 활발히 증식하였다. 생육환경 조건은 염분농도 5~45 ppt, pH 6~9 범위에서 증식이 이루어졌으며, 온도는 10~30℃ 범위에서 생존 및 증식이 가능하나 W~25℃ 범위에서 활발한 증식이 이루어졌다.
- P. dicentrarchi의 화합물 구제실험 결과 포르말린 300, 400 ppm 에 30분, 200 ppm에 6(混, 100 ppm에 90분, 50 ppm어서 120분 만에 구제효과를 보였다. 과산화수소 약욕에 따른 구제효과는 300 ppm에서 60분, 200 ppm에서 90분 만에 구제효과를 보였으며, 150 ppm 처리구와 100 ppm 처리구에서는 150분 만에 각각 운동성을 완전히 상실하여 구제효과를 보였다.
- dicentrarchi의 화합물 구제실험 결과 포르말린 300, 400 ppm 에 30분, 200 ppm에 6(混, 100 ppm에 90분, 50 ppm어서 120분 만에 구제효과를 보였다. 과산화수소 약욕에 따른 구제효과는 300 ppm에서 60분, 200 ppm에서 90분 만에 구제효과를 보였으며, 150 ppm 처리구와 100 ppm 처리구에서는 150분 만에 각각 운동성을 완전히 상실하여 구제효과를 보였다.
-
2) 세균을 이용한 배양
배양기간 동안 세균을 먹이로 활발히 증식하면서 전형적인 포식자와 피포식자의 관계를 보였다. 배양 6일째에 9.
- nigricans6^ 대한 in vitro 구제실험에서 포르말린은 200 ppm에서 30분 이내, 100 ppm에서 60분 약욕으로 구제효과를 보였으며, 과산화수소인 경우 500 ppm 이상에서 30분 이내, 250 ppm에서 60분 만에 구제되었다. 본 실험결과와 비교하여 큰 차이가 없었으나 U. 成에 비해 P. dicentrarchi가 이들 화합물에 대한 저항력이다소 높은 것으로 나타났다. Jee and Jo (2002)의 in vivo 구제실험에서는 넙치 치어에 초기감염인 경우 포르말린과 과산화수소 각 100 ppm/1 h/2 d~4 d 약욕처리로 구제효과가 있었으며, 중증인 경우는 치료효과가 없었다.
- marinunP] 염분농도 21~31 ppt, 수온 8~28℃ 범위에서 나타난다고 보고하였다. 이들 연구결과와 비교해볼 때 P. dicentrarchi는 Uronema sp에 비해 증식범위는 비슷하나 염분농도는 광염성인 것으로 보인다. Iglesias et al.
- 또한 Lee and Ha(1997)는 제주지역의 양屮넙치에서 분리한 스쿠티카충이 20~25。(2 범위에서 배양이 잘된다고 하였는데 대체로 본 연구의 배양 적수온과 일치하였다. 전반적2로 P- dicentrarchi는 광염, 광온성으로 환경에 대한 적응력이 매우 높았으며, 염분농도는 저염분에, 온도는 고온에 잘 적응하는 특성을 보였다.
- 1 ppt와 60 ppt에서는 접종 후 전량 폐사하였다. 전반적으로광염성을 보였으나 저염분에 잘 적응하는 특성을 보였다(Table 5).
- 포르말린 약욕에 의한 운동성의 변화는 형태적 변화보다 뚜렷이 나타났는데 300, 400 ppm 모두 30분 약욕으로 운동성을 완전히 상실하였다. 200 ppm에서 60분, 100 ppm에서 90분, 50 ppm 에서 120분 만에 각각 운동성을 완전히 상실하여 구제효과를 보였다(Fig.
후속연구
- 어체의 크기나 실험조건에 따라 다소 차이는 있으나 이들 연구결과를 종합해 볼 때 포르말린과 과산화수소를 넙치에 사용하는데 별 문제가 없는 것으로 보인다. 그러나 과산화수소인 경우 양식현장에서 넙치에 150 ppm/1 h 이상의 농도에서 수회 반복 약욕할 경우 스트레스 증상이 나타나는 경우가 관찰되므로 양식현장에서 과산화수소 사용에 대한 추가연구가 필요한 것으로 보인다.
- Jee and Jo (2002)의 in vivo 구제실험에서는 넙치 치어에 초기감염인 경우 포르말린과 과산화수소 각 100 ppm/1 h/2 d~4 d 약욕처리로 구제효과가 있었으며, 중증인 경우는 치료효과가 없었다. 본 실험의 결과보다 비교적 저농도에서 반복 약욕처리로 구제효과를 보였는데 이와 같은 결과를 종합해 볼 때 저농도에서도 반복 약욕처리를 해줄 경우 치료 효과를 높일 수 있을 것으로 추정된다.
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