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문제 정의
- , 1990). 그러므로 본 연구에서는 Salmonella typhimurium TA98를 이용하여 담배 TPM 및 연기 주요성분들에 대한 돌연변이 유발성을 조사하였다.
- 따라서 본 연구에서는 인체에 유해한 독성 정도를 기준으로 35종의 특정 담배연기 성분(Table 1) 들을 선택하여 (Hoffman et al., 2001), 이들 성분에 대한 돌연변이 유발성 및 세포독성을 측정하고 이들 성분이 2R4F 표준담배의 TPM 및 GVP 성분의 전체 독성에 얼마나 기여하는지 조사하였다.
- 본 연구에서는 35종 특정 화학 성분들의 세포독성 및 돌연변이 유발성을 측정하여, 2R4F 표준담배의 TPM 및 GVP 성분의 전체 활성에 대한기여도를 조사하였다. Salmonella typhimurium TA98을 이용하여 대사활성법으로 담배 TPM 및 연기 주요성분들에 대한 돌연변이 유발성을 조사한 결과, 6종의 heterocyclic amine류 등이 현저히 높은 돌연변이 활성을 나타내었고, 특히 MelQ의 specific activity는 7.
- , 1984). 본 연구에서는 담배 흡연 시 Cambridge filter pad를 통과한 가스상 성분들을 20 mL PBS(pH 7.4) 용액이 있는 gaswashing bottle에 포집한 GVP 용액 및 가스상의 6 성분에 대한 세포독성을 비교하기 위해 이들 성분에 대한 세포 생존율의 변화를 조사하였다(Fig. 2).
제안 방법
- 담배 연기로부터 가스상 성분의 분획 (gas/vapor phase, GVP)의 제조를 위해 100 mL gas washing bottle을 사용하였다. CORESTA 표준흡연조건에 따라 10 개비의 담배 시료를 자동흡연장치를 이용하여 연소시킨 후, Cambridge filter pad를 통과한 가스상 성분들을 20 mL PBS(pH 7.4) 용액이 있는 gas washing bottle에 포집하였다. 이와 같은 방법으로 흡연한 담배 연기로부터 제조한 GVP 용액 중 carbonyl 화합물의 분석은 Health Canada 의 official method(1999)에 따라서 측정하였다.
- 8 Ug/mL의 범위에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소되었다. GVP 용액 내에 존재하는 특정 연기 성분들의 양을 측정해서 이들 성분들이 2R4F GVP의 세포독성에 대하여 미치는 기여도를 조사하였다(Table 5).
- Table 3에서는 2R4F 표준담배의 연기성분 양을 이용하여 담배 TPM의 돌연변이 활성에 대한 특정 담배 연기 성분이 미치는 기여도를 조사하였다. 표준담배 TPM 1 iig당 복귀돌연변이 집락수는 2.
- 담배연기 TPM에 함유된 6 성분에 대한 세포독성을 비교하기위해 세포를 사멸시키는 적정농도를 결정한 후, 이들 성분에 대한 세포독성 실험을 실시하여 세포 생존율의 변화를 조사하였다(Fig. 1).
- typhimurium TA98 균주에 S-9 mix를 첨가한 대사활성법에서 2 iig/plate의 양성대조 물질 (2AA) 첨가시 음성대조군(30-50 집락수)어I 비해 복귀돌연변이 집락수가 증가(1000-2000 집락수) 되어 본 실험이 적정히 이루어졌음을 알 수 있었다. 담배연기 중 함유된 26성분에 대한 돌연변이 유발성을 비교하기 위해 복귀돌연변이 집락수가 유의적으로 증가하는 적정농도를 결정한 후, 복귀돌연변이 본 실험을 실시하여 집락수의 변화를 조사하였다(Table 2).
- 담배연기의 입자상 성분 (TPM) 은 표준담배 (Kentucky reference cigarette ; 2R4F) 20개피를자동흡연장치 (* Heini Borgwaldt RM20/CS ; Germany) 를 이용하여 CORESTA 표준흡연조건 (puff volume: 35 mL, puff frequency- 60 sec, puff duration; 2 sec)하에서 연소시키고, 92 mm Cambridge filter pad를 이용하여 포집하였다. 적당량의 DMSO를 사용하-여 filter pad로부터 TPM을추출해서, 농도가 10 mg/mL이 되도록 한 후 -70℃ 에 보관하면서 시험에 사용하였다.
- 유기용매 용액 (50% ethanol-1% acetic acid) 150 此을 첨가해서 실온에서 15 분간 neutral red 를 추출한 후 microplate reader (BIO-TEK, USA)를 사용해서 540 run에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험 결과는 세포를 배양하지 않은 well에서 측정된 흡광도에 대하여 보정하였으며, 흡광도는 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 생존율로 변환하였다.
- BALB/c 3T3 세포 (blO, cells)를 96 well plate(n=6)에 이식해서 24 시간 동안 배양한 후 시험물질을 처리하였다. 모든 실험에서 사용되는 대조군은 최고농도의 시료가 첨가된 1%의 DMSO 또는 10%의 PBS 처리군으로 하였다. 시험물질의 처리 후 22 ± 2시간 동안 5% FBS, 100 U penicillin/mL 와 100 yg streptomycin/mL 이 포함된 DMEM 배양액에서 배양하였으며, 세포배양이 끝나면 배양액을 저】거한 후 150 应의 neutral red 용액(40 ug/mL)을 처리하여 37℃에서 배양하였다.
- 1 mL을 top agar에 혼합하고 즉시 vortex mixer로 2-3 초간 진탕하여 minimal glucose agar plate에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 부형제군 (음성대조군)은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액을 같은 방법으로 가하여 실시하였다. top agar가 굳은 후 플레이트 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집어 37C에서 약 48시간 배양 후 집락을 계수하였다.
- 2)에 접종해 shaking incubator# 이용하여 37 ℃ 에서 약 10 시간 배양한 후 사용하였다. 최소배지(minimal glucose agar p]血)는 1.5% Bacto agar와 Vogel-Bonner medium E 및 2% ghicose를 함유해서 만들었고 Top agar는 0.6% agar와 0.5% NaCl로 조제하였으며, top agar에는 0.05 mM의 histidine-biotin-i- 첨가하였다.
대상 데이터
- 18 ± 2시간이었다. BALB/c 3T3 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL 와 100 pg streptomycin/ mL이 포함된 DMED 배양액을 사용하였다. 배양된 세포는 2~3일마다 0.
- Dimethylsulf oxide(DMSO), 2 - Ami noanthracene (2-AA), acetaldehyde, acrolein, benzen, butyraldehyde, formaldehyde, propionaldehyde, 1-aminonaphthalene, 2-aminonaphthlene, aniline, o-toluidine, hydroquinone, sodium dodecyl sulfate(SDS), nuetral red '등'은 Sigma-Aldrich (USA) 제품을 사용하였다. 모든 polycyclic aromatic hydrocarbone-^] 시약들은 Supelco(USA)사로부터 공급받았으며, 2-amino-9H- pyrido[2, 3-b]indole(AaC)) 2-amino-3~methyl-9H- pyrido[2, 3-b]indole (MeAaC), 3-amino-l-methyl- 5H-pyrido[3, 4-&]indole (Trp-P-2), aminophenylnorharman, harman, norharman 등은 TRC(Canada) 그리고 3-aminoT, 4-dimethyl-5Hpyrido[3, 4~b] indole(Trp-P-l), (2-amino-3, 4-dimethylimidazo [4, 5ef]quinoline(MeIQ), 2 - amino - 3 - methy li midazo [4, 5-/]quinoline(IQ) 등은 Wako(Japan) 제품을 사용하였다.
- Dulbeccofs modified Eagle's mediuni(DMEM), fetal bovine serum(FBS), L-glutamine, penicillin/ streptomycin solution, phosphate-buffered saline (PBS) 등은 GIBCO(USA)제품을 사용하였다.
- 모든 polycyclic aromatic hydrocarbone-^] 시약들은 Supelco(USA)사로부터 공급받았으며, 2-amino-9H- pyrido[2, 3-b]indole(AaC)) 2-amino-3~methyl-9H- pyrido[2, 3-b]indole (MeAaC), 3-amino-l-methyl- 5H-pyrido[3, 4-&]indole (Trp-P-2), aminophenylnorharman, harman, norharman 등은 TRC(Canada) 그리고 3-aminoT, 4-dimethyl-5Hpyrido[3, 4~b] indole(Trp-P-l), (2-amino-3, 4-dimethylimidazo [4, 5ef]quinoline(MeIQ), 2 - amino - 3 - methy li midazo [4, 5-/]quinoline(IQ) 등은 Wako(Japan) 제품을 사용하였다. 그 외의 유기용매들은 특급시약을 사용하였다.
- 03% EDTA 용액을 이용하여 계대 유지하였다. 세포주의 자연발생적 돌연변이 생성을 최소화하기 위하여 구입 후부터 18번미만으로 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 배양은 CO2 배양기 (Forma, USA)를이용하여 포화 습도하에서 37℃, 5% CO2 상태로 배양하였다.
- 실험에 사용한 BALB/c 3T3 fibroblast 세포주 (BALB/c 3T3) 는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 분양받아 사용하였으며, 세포주기는 18 ± 2시간이었다. BALB/c 3T3 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL 와 100 pg streptomycin/ mL이 포함된 DMED 배양액을 사용하였다.
데이터처리
- /mL로 환산하여 표시하였다. SPSS (version 10.0) 통계프로그램을 이용하여 일원분산분석 (ANOVA)을 실시하였고 사후분석으로는 Duncan test를 통해서 p<0.05의 수준에서 각 시험 군과의 유의성을 검정하였다.
- 표시하였다. 돌연변이 유발성에 대한 시료들간의 유의적인 차이 (p<0.05)는 선형회귀분석을 통해서 구해진 각각의 시료들에 대한 활성도 값에 대한 일원분산분석 (ANOVA)과, 사후분석으로는 Duncan test를 이용하여 검증하였다. 시료에 대한 세포독성의 수치는 ECm 값으로 표기하였다.
- 복귀돌연변이 시험 결과는 시료로부터 각 농도군 3개의 평판으로부터 얻은 집락 수의 평균±표준편차와, 용량상관성이 나타나는 초기농도 범위에서 구해진 기울기 값을 이용해서 계산된 활성도 값(Specific activity, revertants/pg)을 표시하였다. 돌연변이 유발성에 대한 시료들간의 유의적인 차이 (p<0.
이론/모형
- 복귀돌연변이 시험은 Maron과 Ames(1983) 이제 시한 방법에 따라 수행하였고, 특정성분들에 대한 돌연변이 유발성 검색을 위해서 Salmonella typhimurium TA98 균주를 사용하였다. 시험물질의 처리는 대사활성효소계 (S-9 mix) 가 적용된 direct plate incorporation 방법으로 하였다.
- , 2001). 본 연구에서도 BALB/c 3T3 fibroblast 세포를 이용한 neutral red uptake 법을 사용해서 담배연기 및 특정 단일 성분들에 대한 세포독성을 조사하였다.
- 시험물질의 처리는 대사활성효소계 (S-9 mix) 가 적용된 direct plate incorporation 방법으로 하였다. 고압증기 멸균한 top agar를 dry bath에서 45℃로 예열한 멸균 tube에 2 mL 씩 분주한 다음, 시험물질 용액 0.
- 4) 용액이 있는 gas washing bottle에 포집하였다. 이와 같은 방법으로 흡연한 담배 연기로부터 제조한 GVP 용액 중 carbonyl 화합물의 분석은 Health Canada 의 official method(1999)에 따라서 측정하였다.
- 특정성분들에 대한 세포독성은 리소좀에 의한 neutral red 흡수 정도를 측정하는 Neutral red cytotoxicity assay 방법을 사용하였다(Borenfreund and Puemer, 1985). BALB/c 3T3 세포 (blO, cells)를 96 well plate(n=6)에 이식해서 24 시간 동안 배양한 후 시험물질을 처리하였다.
성능/효과
- 특히 4-aminobiphenyl 100 pg/plate 처리시 복귀돌연변이 집락수가 1, 062 로서 높은 돌연변이 유발성을 나타냈다. 10 종의 polycyclic aromatic hydrocarbon(PAH)류의 돌연변이 유발성을 0.5-100 yg/plate 농도범위에서 측정한 결과 acenaphthene, anthracene, chrysene, naphthalene 등은 집락수가 증가하지 않았으나 benzo[a]anthracene, benzo[e]pyrene, benzotbl fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, fluoranthene 등은 고농도(100 yg/plate) 처리시 음성대조군에 비해 집락수가 2-3배 증가하였다. Benzo[a]pyrene 은 저농도(0.
- 4 그리고 12 ug/mL 으로서 hydroquinone이 가장 높은 세포독성을 나타내었다. 2R4F 1개피 중에 포함된 단일성분의 양을 고려해서 독성기여도를 조사한 결과, 전체 TPM의 세포독성에 대하여 hydroquinone이 8.7%의 비교적 높은 독성 기여도를 보이는 것으로 나타났다. 지금까지 많은 연구에서 담배연기 중 가스상 성분과 특히 저분자량의 carbonyl 화합물 등은 세포독성에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Curvall et al.
- 관찰되지 않았다. 3종의 carbonyl 화합물에 대하여 여러 농도범위에서 세포 생존율을 측정한 결과 acetaldehyde는 100-300 pg/mL, acrolein 은 0.3-0.9 pg/mL, 그리고 formaldehyde는 0.6-1.8 Ug/mL의 범위에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소되었다. GVP 용액 내에 존재하는 특정 연기 성분들의 양을 측정해서 이들 성분들이 2R4F GVP의 세포독성에 대하여 미치는 기여도를 조사하였다(Table 5).
- 3종의 phenol류에 대하여 여러 농도범위에서 세포 생존율을 측정한 결과 catechole 10-50 ug/mL, O-cresole 100-400 pg/mL, 그리고 hydroquinone는 2T0 ug/mL의 범위에서 세포 생존율은 농도 의존적으로 감소하였다. PAH류, aromatic amine 류, 그리고 heterocyclic amine류 등을 대표해서 benzo(a)pyrene, 1-aminonsphthalene, 그리고 MelQ 에 대한 세포생존율을 1-10 ug/mL 농도 범위에서 조사한 결과, benzo(a)pyrene, 1-aminonsphthalene등은 세포독성을 나타내지 않았으나, MelQ는 농도 의존적으로 세포 생존율이 60%까지 감소되었다.
- 5-2 iig/plate)에서도 복귀돌연변이 집락 수가 140-412으로 농도의존적으로 증가되었고, PAH류 중 가장 높은 돌연변이 유발성을 나타내었다. 6종의 heterocyclic amine류의 돌연변이 유발성을 측정한 결과, AaC와 MeAac 등은 0.1-1 μ g/plate 범위에서 농도 의존적인 복귀돌연변이 집락 수가 증가되는 것이 관찰되었고, Trp-P-1 와 Trp-P-2 등은 0.001-0.05 yg/plate 범위에서 집락 수가 통계적으로 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다. IQ는 0.
- 6 ug/ml로서 현저 히 높은 세포독성을 보였다. 2R4F 표준담배 1개피중 포함된 단일성분의 양을 고려해서 독성기여도를 조사한 결과, TPM 의 세포독성에 대하여 hydroquinone0! 8.7% , 그리고 GVP에 대하여 acrolein이 61%의 높은 세포독성 기여도를 보이는 것으로 나타났다.
- Acetaldehyde, acrolein 그리고 formaldehyde의 EC®은 각각 146.5, 0.61 그리고 1.2 pg/n丄로서 acrolein이 가장 높은 세포독성을 나타내었고, 전체 GVP의 세포독성에 대해서도 acrolein이 61.0%의 현저히 높은 독성 기여도를 보이는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 carbon을 함유한 필터를 채택한 담배의 경우 이들 가스상 성분들이 효과적으로 제거되어 전 연기(whole smoke) 수준에서 낮은 세포독성을 보이는 경우를 잘 설명하는 결과라고 판단된다(Bombick et al.
- Aromatic amine류 0.5-100 pg/plate 농도 범위에서 돌연변이 유발성을 조사한 결과 aniline, o- toluidine, 3-aminobiphenyl 등은 복귀돌연변이 집락 수가 유의하게 증가하지 않았느나 1-aminonaphthalene, 2-aminonaphthalene, 4-aminobiphenyl 등은 농도의존적(1-100 ng/plate)으로 집락수가 증가하는 것을 확인하였다. 특히 4-aminobiphenyl 100 pg/plate 처리시 복귀돌연변이 집락수가 1, 062 로서 높은 돌연변이 유발성을 나타냈다.
- 85%인 것으로 나타났다. BALB/c 3T3 fibroblast 세포를 이용해서 담배 연기의 TPM 및 GVP에 함유된 특정성분들에 대한 세포독성을 측정한 결과, hydroquinone 및 acrolein의 EC5o°I 각각 3.4 iig/ml과 0.6 ug/ml로서 현저 히 높은 세포독성을 보였다. 2R4F 표준담배 1개피중 포함된 단일성분의 양을 고려해서 독성기여도를 조사한 결과, TPM 의 세포독성에 대하여 hydroquinone0! 8.
- Catechol, o-cresol, hydroquinone, 그리고 MelQ 의 ECa)은 각각 33.4, 213.9, 3.4 그리고 12 ug/mL 으로서 hydroquinone이 가장 높은 세포독성을 나타내었다. 2R4F 1개피 중에 포함된 단일성분의 양을 고려해서 독성기여도를 조사한 결과, 전체 TPM의 세포독성에 대하여 hydroquinone이 8.
- 05 yg/plate 범위에서 집락 수가 통계적으로 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다. IQ는 0.001-0.01 ng/plate 농도범위에서 복귀돌연변이 집락수가 현저히 증가하였으며, MelQ 0.001yg/plate 처리시 집락수가 826으로 음성대조군에 비해 크게 증가되어 26개 성분들중에서 가장 높은 돌연변이 유발성을 나타내었다. L-tryptophan 의 열분해시 발생되는 Q-carboline류의 일종인 harman 또는 norharman 등은 100 yg/plate 까지 처리했을 때 복귀 돌연변이 활성은 나타나지 않았으나, aminophenylnorharmane 0.
- 001yg/plate 처리시 집락수가 826으로 음성대조군에 비해 크게 증가되어 26개 성분들중에서 가장 높은 돌연변이 유발성을 나타내었다. L-tryptophan 의 열분해시 발생되는 Q-carboline류의 일종인 harman 또는 norharman 등은 100 yg/plate 까지 처리했을 때 복귀 돌연변이 활성은 나타나지 않았으나, aminophenylnorharmane 0.01-0.05 pg/plate 범위에서는 복귀 돌연변이 집락수가 농도 의존적으로 증가하였다. Aminophenylnorharmane 담배 연기 중에는 존재하지는 않지만 TA98 균주의 acetyltransferase 에 의해 norharman 과 aniline °1 결합되어 생성되어지는 aminophenyl-p-carboline 유도체의 일종으로 특히 YG1024 균주에서 높은 돌연변이 유발성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
- 3 mg이므로 1개피당 집락 수는 28, 363이었다. PAH계열 화합물 중 돌연변이 유발성이 가장 높은 benzo(a)pyrene의 specific activity는 189 revertants/pg이었고, 2R4F 1 개피연기중 포함된 함량은 7 ng이었으며 이것의 돌연변이 활성은 1.3 revetants/cigarette 로서 전체 TPM의 돌연변이 활성의 0.005% 미만인 것으로 나타났다. 단백질의 열분해 과정중 생성되는 heterocyclic amine류는 Salmonella test를 통해서 높은 돌연변이원성으로 잘 알려져 있다(Manabe and Wada, 1990).
- 감소하였다. PAH류, aromatic amine 류, 그리고 heterocyclic amine류 등을 대표해서 benzo(a)pyrene, 1-aminonsphthalene, 그리고 MelQ 에 대한 세포생존율을 1-10 ug/mL 농도 범위에서 조사한 결과, benzo(a)pyrene, 1-aminonsphthalene등은 세포독성을 나타내지 않았으나, MelQ는 농도 의존적으로 세포 생존율이 60%까지 감소되었다. Table 4 에서는 2R4F 표준담배의 연기성분 양을 이용하여 담배 TPM의 세포독성에 대한 특정 연기성분이 미치는 기여도를 조사하였다.
- S. typhimurium TA98 균주에 S-9 mix를 첨가한 대사활성법에서 2 iig/plate의 양성대조 물질 (2AA) 첨가시 음성대조군(30-50 집락수)어I 비해 복귀돌연변이 집락수가 증가(1000-2000 집락수) 되어 본 실험이 적정히 이루어졌음을 알 수 있었다. 담배연기 중 함유된 26성분에 대한 돌연변이 유발성을 비교하기 위해 복귀돌연변이 집락수가 유의적으로 증가하는 적정농도를 결정한 후, 복귀돌연변이 본 실험을 실시하여 집락수의 변화를 조사하였다(Table 2).
- 조사하였다. Salmonella typhimurium TA98을 이용하여 대사활성법으로 담배 TPM 및 연기 주요성분들에 대한 돌연변이 유발성을 조사한 결과, 6종의 heterocyclic amine류 등이 현저히 높은 돌연변이 활성을 나타내었고, 특히 MelQ의 specific activity는 7.9x105 revertants/ug로서 가장 높은 돌연변이 활성을 보였다. 그러나 2R4F 담배 연기 중 포함된 성분의 함량은 상당히 낮기 (0.
- , 2004). TA 98 균주를 사용하는 본 실험조건에서도 복귀돌연변이 활성을 보이지 않는 aniline 또는 o-foluidine 등에 norharman을첨가한 혼합물에 대한 돌연변이 유발성을 측정한 결과 1-100 yg/plate 범위에서 집락수가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다 (Data not shown). 이와 같은 결과는 담배연기 TPM의 돌연변이 활성은 단일 성분 자체뿐만 아니라 여러 성분의 결합에 의한 시너지 효과를 보이는 것으로 사료된다.
- 단백질의 열분해 과정중 생성되는 heterocyclic amine류는 Salmonella test를 통해서 높은 돌연변이원성으로 잘 알려져 있다(Manabe and Wada, 1990). TA 98 균주를 사용한 본 연구에서도 6종의 heterocyclic amine류의 복귀 돌연변이 집락수가 다른 성분들에 비해 높았으며, 특히 IQ와 MelQ의 specific activity는 각각 96, 978, 790, 667 revertants/ug로써 현저히 높은 돌연 변이활성을 나타냈다. 그러나 2R4F 담배 연기중 포함된 이들 성분의 함량은 상당히 낮았기 (0.
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