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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라에서 분리된 참다래 꽃썩음병 원 세균에서 스트렙토마이신 저항성 유전자와 plasmid와의 관계를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- StrAB primer로 증폭된 PCR 산물을 DNA purification kit(Bioneer)로 정제한 뒤 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 클로닝하였다. Ampicillin 과 X-gal이 포함된 LB 배지에서 흰색 콜로니를 선발하여 plasmid DNA를 분리한 뒤 EcoRI으로 처리하여 DNA가삽입되었는지 여부를 확인하였다. 확인된 plasmid는 Macrogen사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- 염기서열 분석을 위해 클로닝 된 plasmid를 EcoRl으로 처리하여 얻어진 삽입 절편을 random primed labeling 방법을 이용해 DIG-dUTP 로 labeling된 probe를 제조하였다. Labeling과 detection은 DIG-high prime DNA labeling and detection starter kit II(Roche)를 사용하여 제조자가 제시한 방법을 따라 행하였다.
- l㎕의 상층액을 PCR에 사용하였다. PCR 반응액은 0.25 uM의 primer, 각 200 uM의 dNTP, 1.5 mM MgCl2 2.5 ㎕, 10X buffer, 1.25 unit Taq DNA polymerase(Takara)를 포함하여 최종 부피를 25 ㎕ 되게 하였다. PCR 반응온도는 94℃, 5분의 denaturation 후 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하였다.
- 저항성 유전자의 염기서열 분석. StrAB primer로 증폭된 PCR 산물을 DNA purification kit(Bioneer)로 정제한 뒤 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 클로닝하였다. Ampicillin 과 X-gal이 포함된 LB 배지에서 흰색 콜로니를 선발하여 plasmid DNA를 분리한 뒤 EcoRI으로 처리하여 DNA가삽입되었는지 여부를 확인하였다.
- 식물에서 분리한 세균들이 가지고 있는 스트렙토마이신 저항성 유전자는 일반적으로 Tn5393 안에 strA-strB 유전자 형태로 들어 있다(Han 등, 2004). 국내에서 분리한 저항성 균주들이 strA-strB 유전자와 함께 이와 같은 transposon이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 Tn5393 내에서 적절한 primer를 설계하였다 (Fig. 1, Table 2).
- 스트렙토마이신 저항성 조사. 스트렙토마이신 저항성 여부를 조사하기 위해 0, 10, 50, 100, 200, 500 ug/m,의 스트렙토마이신이 첨가된 PS 액체배지 3 mH O.D600=1.0 되게 배양한 균주를 10uZ 접종한 뒤 28℃(3에서 48시간 진 탕배양한 후 최소저해농도를 결정하였다.
- 전기영동이 끝난 다음 DNA를 아가로스 젤로부터 nylon membrane(Roche)으로 capillary 방법으로 옮겼다(Ausbel 등, 1999). 염기서열 분석을 위해 클로닝 된 plasmid를 EcoRl으로 처리하여 얻어진 삽입 절편을 random primed labeling 방법을 이용해 DIG-dUTP 로 labeling된 probe를 제조하였다. Labeling과 detection은 DIG-high prime DNA labeling and detection starter kit II(Roche)를 사용하여 제조자가 제시한 방법을 따라 행하였다.
- 6 s, 전압은 6 V/cm 였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색한 후 UV하에서 확인하였다.
- syringae^:분리하였다. 총 41개 균주 중 스트렙토마이신 저항성을 보이는 2개의 균주를 대상으로 PCR과 염기서열 결정을 통해 저항성 유전자 구조를 조사하였다. PCR 결과 스트렙토마이신 저항성유전자는 Tn5359a에 들어 있는 strA- strB 구조인 것으로 밝혀졌다.
- Ampicillin 과 X-gal이 포함된 LB 배지에서 흰색 콜로니를 선발하여 plasmid DNA를 분리한 뒤 EcoRI으로 처리하여 DNA가삽입되었는지 여부를 확인하였다. 확인된 plasmid는 Macrogen사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
대상 데이터
- syringae pv. actinidiae Pall 을 사용하였다. Str AB primer setS.
- 주형 DNA의 제조는 배양액 100 ㎕를 원심분리 한 다음 증류수로 세척 뒤 100 ㎕의 1 % ChelexlOO 용액을 넣어 5분간 끊여 원심분리 하였다. l㎕의 상층액을 PCR에 사용하였다. PCR 반응액은 0.
- 꽃썩음병 균주로는 전라남도와 경상남도 소재 8개 시 • 군의 서로 다른 참다래 과수원에서 20이년 과 2002년에 분리되어 Pseudomonas syringae pv. syringae 로 동정된 41개 균주를 실험에 사용하였다(Table 1). 대조 균주로 사용된 Pseudomonas marginalis BJW1은 국내의 참다래 과수원에서 채집되어 동정된 스트렙토마이신 저항성 균주이고, P.
성능/효과
- 총 41개 균주 중 스트렙토마이신 저항성을 보이는 2개의 균주를 대상으로 PCR과 염기서열 결정을 통해 저항성 유전자 구조를 조사하였다. PCR 결과 스트렙토마이신 저항성유전자는 Tn5359a에 들어 있는 strA- strB 구조인 것으로 밝혀졌다. Xanthomonas campestris와 Erwinia 에서 알려진 IS6100과 IS 1133은 발견되지 않았다.
- syringae pv. syringae KHP7과 BJB3 이 가지고 있는 strA-유전자의 염기서열의 변이를 파악하기 위해 strA-strB를 cloning하여 분석한 결과 strA^\ 염기서열이 P. syringae A2, X campestris, E. amylovora, Corynebacterium striatum등에서 나타난 것과 동일한 다섯 곳에서 polymorphism 양상을 보여주었다(자료 미제시).
- 2B). tnpR-F와 str-7 primer를 사용하여 PCR을 수행하였을 때 insertion sequence가 존재한 다면 1, 776 bp의 band가 검출되어야 하지만 실험결과 486 bp의 band만 검출되어 두 균주 모두 insertion sequence가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2C). 이러한 결과는 우리나라 참다래 과수원에서 분리된 스트렙토마이신 저항성 P marginalis의 결과와 일치하여 (Han 등, 2003), Tn5393이 우리나라 식물병원성 세균에서 발견되는 보편적인 스트렙토마이신 저항성 유전자 구조임을 알 수 있었다.
- 국내에서 분리한 참다래 꽃썩음병균들의 약제 저항성 정도를 파악한 결과, 총 분리균주 41개 중 스트렙토마이신에 저항성을 가지는 균주는 KHP7과 BJB3 두 균주로, 분리균주 중 5%의 출현빈도를 나타내었다(Table 1). 스트렙토마이신 저항성 균주들의 최소저해 농도는 두 균주 모두 100 ug/m/이었다.
- 2A에서와 같이 예상하였던 1, 640 bp 의 band가 검출되었다. 또한 tnpA와 tnpR 유전자와 insertion sequence의 유무를 확인하기 위해 동일 조건으로 PCR을 수행한 결과, tnpA primer set의 경우에서도 예상하였던 300 bp 크기의 band가 검출되었다(Fig. 2B). tnpR-F와 str-7 primer를 사용하여 PCR을 수행하였을 때 insertion sequence가 존재한 다면 1, 776 bp의 band가 검출되어야 하지만 실험결과 486 bp의 band만 검출되어 두 균주 모두 insertion sequence가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 식물에서 발생하는 대부분의 세균성 병해는 진균성 병해와는 달리 방제 약제가 항생제와 동제로 제한되어 있어 약제 방제가 어려울 뿐만 아니라 방제 약제도 예방 위주의 약효를 나타내기 때문에 방제시기를 놓칠 경우 치료가 거의 불가능하다. 또한 항생제 및 동제에 의한 약제방제에서 약제 저항성균의 출현은 불가피하기 때문에 참다래 재배지에 출현하는 꽃 썩음 병균 집단 내에서 약제 저항성균의 분포 및 빈도를 파악하는 것은 약제방제의 효율성을 높이기 위하여 선행되어야 할 일이다.
- 이러한 현상을 막기 위해서는 스트렙토마이신이 주성분인 약제의 계속된 사용을 피하는 방제 프로그램을 사용해야 할 것이다.
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