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문제 정의
- 찾아보기 어려운 실정이다. 따라서 본 연구는 국내 담수어종 중의 하나인 붕어, Carassius aruatus 를 nonylphenol에 장기간 노출시킴으로써 나타나는 생식지표의 변화를 조사하여 추후 여러 종류의 EDCs가 수서동물에 미치는 위해성에 관한 연구를 수행하는데 기초 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 32주였다. 실험수조는 30 L의 지수형 순환 여 과식 사각 유리수조에 각 농도구별로 두 그룹으로 나누어 2회 반복 실험을 하였다. 실험어는 각 수조마다 35 개체씩 수용 하였으며, 실험기간 동안 광주기와 온도는 자연조건으로 설정하였다.
- A)을 acetone에 1 : 100 으로 녹인 후 증류수로 1 g NP 의 표준용액을 만든 다음, 실험농도 별로 희석하여 조제하였다. 실험 구는 대조구 (negative)와 acetone (solvent) 대조구외 5개 농도구를 설정하여 급성독성 실험을 하였으며, 노출농도는 예비실험 결과 Ackermann et al. (2002) 등의 문헌을 참고하여 0 (control), 18, 37, 83 |ig NPL-'로 설정하였다.
- 용출된 n-hexane에 N? 가스를 넣고, 4% diethyl ether/n-hexane 1 mL를 더해서 용해시켰다. 이 용액을 4% diethyl ether/n-hexane으로 통과시키면서 최초의 용출액 8mL를 채취하였고, 용출된 4% diethyl ether/n-hexane에 N? 가스를 불어넣어 05 mL까지 농축하여 측정용 시료용액으로하였다 이와 같은 과정을 거친 다음 GC-MSD (Shimadzu, Model GC 17A, QP-5050A)로 검출하였다. 위와 같은 방법으로 검출된 사육수내의 nonylphenol 농도는 Table 1과 같다.
- 어류의 생존율은 매일 12시간 간격으로 사망 개체를 확인하여 누적사망율을 구한 후 생존율로 환산하였다.
- 대조구를 포함한 각 노출구에서 실험 종료 시기에 생존한 전 개체를 채집하여 해부한 후 생식소의 외형을 육안으로 확인하였고, 외형적 이상을 가진 개체들을 농도구별로 백분율(%)로 표시하였다.
- 암컷의 생식세포 발달은 난원세포기 (oogonial stage), 난황형성 전기 (previtellogenic stage), 난황 형성개시기 (initial vitellogenic stage), 난황형성활성기 (active vitellogenic stage) 성숙기 (mature stage) 그리고 완숙기 (ripe stage)의 6단계로 나누었으며, 이를 토대로 생식소 발달단계를 성장기 (growing: G), 성숙기 (mature: M), 완숙 및 산란기 (ripe and spawning: RS) 그리고 회복 및 휴지기 (recovery and rest- ing:RR)의 4단계로 나누었다(Fig. 1).
- 수컷의 생식세포 발달은 정원세포기 (spermatogonium stage), 정모세포기 (spermatocyte stage), 정세포기 (spermatid stage), 정자기 (sperm stage)의 4 단계로 나누었으며, 이를 토대로 생식소 발달단계를 분열증식 및 성장기 (multiplicative and growing: MG), 성 숙기 (mature: M), 완숙 및 방정 기 (ripe and spent: RS) 그리고 회복 및 휴지기 (recovery and resting: RR)의 4단계로 나누었다 (Fig. 2).
- 이용하여 다음과 같이 조사하였다. 암컷은 각발달단계별로 상수(RR=L G=2, M=3, RS=4)를곱한 전체의 합을 개체 수로 나누었으며, 수컷 역시 각 발달단계별로 상수(RR=1, MG=2, M=3, RS =4)를 곱하여 계산하였다.
- 채집된 모든 개체들은 Bouin's solution에 고정 후, 파라핀 절편법으로 두께 4~6 |im의 횡단면과 종단면으로 연속절편을 제 작하였으며 , Mayer, s he- matoxylin-eosin (H-E) 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- Intersex 출현율은 실험개시기에 충청북도 내수면연구소에서 채집한 자연대조구(wild group), 실험종료일의 실험대조구 및 노출구의 어류를 채집하여 조사하였다. Intersex는 생식소 조직표본의 현미경 검경 시 난소에서 수컷의 생식세포 또는 정소에서 암컷의 생식세포가 관찰되는 것을 기준으로 조사하였다.
- 5% EDTA용액 70)xL 씩을 넣어 반응을 중지시킨 다음 595 nm에서 OD 값을 측정하였다. 정제된 붕어의 혈액 속에 있는 vitellogenin의 흡광도를 측정하고 표준 적정 그래프에 의하여 그 농도를 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 붕어, Carassius aurams는 충청북도 내수면연구소에서 315개체를 분양받아 실험 실로 운반 후 30 L 수조 6개 에 나누어 4주 동안 순응시켰다. 개체의 크기는 평균 전장 53mm, 평균 전 중 2.
- 실험기간은 2004년 10월 5일부터 2005년 5월 20일까지 32주였다. 실험수조는 30 L의 지수형 순환 여 과식 사각 유리수조에 각 농도구별로 두 그룹으로 나누어 2회 반복 실험을 하였다.
- 실험수조는 30 L의 지수형 순환 여 과식 사각 유리수조에 각 농도구별로 두 그룹으로 나누어 2회 반복 실험을 하였다. 실험어는 각 수조마다 35 개체씩 수용 하였으며, 실험기간 동안 광주기와 온도는 자연조건으로 설정하였다. 먹이는 1, 000 |im 크기의 잉어용 인공배 합사료 (Ewhaoil & fat ind.
- 본 연구에 사용된 시험용액은 nonylphenol (NP, Aldrich Chem. Co. Inc., U.S.A)을 acetone에 1 : 100 으로 녹인 후 증류수로 1 g NP 의 표준용액을 만든 다음, 실험농도 별로 희석하여 조제하였다. 실험 구는 대조구 (negative)와 acetone (solvent) 대조구외 5개 농도구를 설정하여 급성독성 실험을 하였으며, 노출농도는 예비실험 결과 Ackermann et al.
데이터처리
- 분석은 32주 노출 후 모든 개체들을 대상으로 하였으며, 통계처리는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 ANOVAt-test를 한 후 다중비교를 최소 유의치 검정 (Lesat-significant difference test)으로 유의성 (P< 0.05)을 검정하였다.
이론/모형
- Vitellogenine 국립환경과학원 연구사업으로 개발된 붕어의 vitellogenin 모노클론 항체를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 정량검색을 수행하였다. 혈청은 붕어의 미 부정맥에서 주사기를 이용하여 혈액을 채취한 후 10분간 4℃ 냉장고에서 안정시킨 다음 3, 000rpm에서 30분간 원심분리하여 분리하였다.
성능/효과
- 노출구의 평균 생존율은 83.0%로 대조구의 생존율 88.5%보다 다소 낮게 나타났다. 대조구는 실험개시 후 3주까지는 100%의 생존율을 보이다가 차츰 감소하기 시작하여 20주에 88.
- 5%보다 다소 낮게 나타났다. 대조구는 실험개시 후 3주까지는 100%의 생존율을 보이다가 차츰 감소하기 시작하여 20주에 88.5%를 나타냈다. 모든 노출구는 실험개시 후 11주까지는 불규칙한 양상을 나타냈지만, 12주부터 농도가 높을수록 생존율이 감소하기 시작하였다 (Fig.
- 5%를 나타냈다. 모든 노출구는 실험개시 후 11주까지는 불규칙한 양상을 나타냈지만, 12주부터 농도가 높을수록 생존율이 감소하기 시작하였다 (Fig. 3).
- 5와 같다. 생식소 기형은 대조 구를 포함한 모든 노출구에서 암컷 생식소의 기형율이 수컷보다 높게 나타났다. NP 노출구에서 암컷의 생식소 기형은 18, 37 및 83ng NPL-1농도 구에서 각각 31.
- 6과 같다. 암컷의 GSI는 대조구에서 23.43 이었으나, 18, 37 및 83 ng NPL1 농도구에서 각각 15.27, 19.38, 16.11 로 나타나 대조구에 비해 NP 노출 구에서 낮은 값을 보였다. 수컷의 GSI는 대조 구에서 4.
- 11 로 나타나 대조구에 비해 NP 노출 구에서 낮은 값을 보였다. 수컷의 GSI는 대조 구에서 4.23 이었으며, 모든 NP 노출구에서 각각 4.2 내외로 조사되어 대조구와 NP 노출구 사이에 뚜렷한 차이는 없었다.
- 7과 같다. 암컷의 HSI는 대조구에서 2.93, NP 노출구에서 평균 3.10으로 조사되었고, 수컷의 HSI 는 대조구에서 3.69, NP 노출구에서 평균 3.42로 조사되어 암 . 수 모두 대조구와 NP 노출구 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
- 42로 조사되어 암 . 수 모두 대조구와 NP 노출구 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
- 암컷의 생식소 발달은 대조구에서 전 개체가 완숙 및 산란기로 조사되었고, NP 노출구에서 18과 37)xg NPL'1 농도구에서는 완숙 및 산란기가 100%, 83 μg NPL 1 농도구에서는 성장기 9.1%, 완숙 및 산란기 90.9%로 조사되었다. 수컷의 생식소발달은 대조구에서 전 개체가 완숙 및 방정기로 조사되 었고, NP 노출구에서 18과 83 |ig NPL-1 농도 구에서는 완숙 및 방정기가 100%, 37|ig NPL-' 농도구에서는 성숙기 8.
- 9%로 조사되었다. 수컷의 생식소발달은 대조구에서 전 개체가 완숙 및 방정기로 조사되 었고, NP 노출구에서 18과 83 |ig NPL-1 농도 구에서는 완숙 및 방정기가 100%, 37|ig NPL-' 농도구에서는 성숙기 8.3%, 완숙 및 방정기 91.7% 로 조사되었다. 대조구에 비해 37μg NPL"1 농도 구에서의 수컷과 83 ㎍ NPL 1 농도구에서의 암컷에서 생식소 발달이 다소 느린 개체들이 관찰되었지만, 전체적으로 암 .
- 7% 로 조사되었다. 대조구에 비해 37μg NPL"1 농도 구에서의 수컷과 83 ㎍ NPL 1 농도구에서의 암컷에서 생식소 발달이 다소 느린 개체들이 관찰되었지만, 전체적으로 암 . 수 모두 대조구와 NP 노출 구 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig.
- 92로 조사되었다. 대조구에 비해 83 μg NPL「'농도구의 암컷과 37 ng NP L'1 농도구의 수컷에서 GI가 다소 낮게 관찰되었지만, 전체 적으로 암 . 수 모두 대조구와 NP 노출구 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
- Intersex 출현율은 대조구에서 4.16%, NP 노출 구에서 25.67%로 대조구보다 NP 노출구가 높게 조사되었으며, 18μg NPL'1 농도구에서 36.51%로 가장 높았다 또한 수컷 생식소에서 intersex 출현율은 대조구에서 0%, NP 노출구에서 10.1%로 조사되었고, 암컷 생식소에서의 출현율은 대조구에서 4.2%, NP 노출구에서 15.6%로 나타나, 수컷보다 암컷의 생식소에서 높게 조사되었다(Fig. 10).
- 12와 같다. 암컷의 혈중 vitellogenin 농도는 대조구에서 50.2gg L-1, NP 노출 구에서 43.4|ig L1로 조사되어 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 하지 만, 수컷의 경우 대조구의 0.
- 본 연구에서 nonylphenol에 노출되는 동안 붕어의 생존율은 노출 후 11주까지는 농도와 뚜렷한 상관관계가 없었으나, 12주부터는 농도에 따라 생존율이 감소하였다. 이와 같은 변화는 종, 노출 물질 및 방법 등 다양한 요인에 따라 생물이 받는 영향이 서로 다르며, 환경에 대한 개체의 적응력 차이로 생각된다.
- (Ren, 1996; Sumpter, 1998; Nimrod and Benson, 1998; Tanghe et al, 1999; Harries et 2000). 또한 수컷의 생식소에 난황 전구체인 vitellogeniine의 수치를 큰 폭으로 증가시키거나 암컷과 수컷 모두에서 생식소 발달을 부분적으로 억제시키는 효과도 나타낸다. Fathead minnow, Pimephales promelas를 butyl benzyl phth- alate와 4-nonylphenol에 3주 동안 노출시킨 결과, butyl benzyl phthalafe(l00 μg L-1)에서는 생존, GSJ, 생식력, 난의 크기, vitellogenin 및 이차성징 등에서는 영향이 없었으나, nonylphenol (1, 10 and 100 |ig I/')에 노출된 암컷들에서 산란 수와 GSI가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 100 ㎍ NPL-1에서는 난의 크기와 전체적인 생식력이 감소하는 것으로 나타났다(Harries et al.
- 또한 수컷의 생식소에 난황 전구체인 vitellogeniine의 수치를 큰 폭으로 증가시키거나 암컷과 수컷 모두에서 생식소 발달을 부분적으로 억제시키는 효과도 나타낸다. Fathead minnow, Pimephales promelas를 butyl benzyl phth- alate와 4-nonylphenol에 3주 동안 노출시킨 결과, butyl benzyl phthalafe(l00 μg L-1)에서는 생존, GSJ, 생식력, 난의 크기, vitellogenin 및 이차성징 등에서는 영향이 없었으나, nonylphenol (1, 10 and 100 |ig I/')에 노출된 암컷들에서 산란 수와 GSI가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 100 ㎍ NPL-1에서는 난의 크기와 전체적인 생식력이 감소하는 것으로 나타났다(Harries et al., 2000). Nonylphenol 0.
- 본 연구에서 32주간 nonylphenol에 노출된 붕어의 생식소의 외형적 기형율이 대조구에 비해 모든 NP 노출구에서 높았으며, GSI는 암컷에서, HSI는 수컷에서 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였다. 생식소 발달빈도와 GI는 암컷에서는 83 μgNPL= 수컷에서는 37|igNPLT 농도구에서 생식소 발달이 일부 개체에서 지연되는 것으로 나타났지만 유의적 차이는 관찰되지 않았다.
- 보였다. 생식소 발달빈도와 GI는 암컷에서는 83 μgNPL= 수컷에서는 37|igNPLT 농도구에서 생식소 발달이 일부 개체에서 지연되는 것으로 나타났지만 유의적 차이는 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서 vitellonenin 농도는 암컷은 대조 구에 비해 거의 차이가 없었지만, 수컷은 대조구에 비해 모든 NP 노출구에서 큰 폭으로 증가된 양상을 나타냈다.
- 본 연구에서는 대조구에 비해 83 jig NPL-1, 37 gg NP L1 그리고 18 jig NP 농도구 순으로 intersex의 출현율이 높게 나타났다. 하지만 암컷의 생식소에서 분포비율이 높고, 생식소 발달 및 GI가 대조 구와 NP 노출구 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않아 기존 연구들과 같은 결론을 내리기에는 어려움이 있었다.
- 이상의 연구결과들을 볼 때 nonylphenole 장기간 노출 시 어류의 생존에 영향을 미치며, 기존 단기간 노출결과들과 마찬가지로 내분비 계장 애 물질로서의 작용을하는 것으로 보여진다.
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