[국내논문]다약제내성 암세포에서 shMDR과 Sodium/Iodide Symporter 유전자의 이입에 의한 Doxorubicin 감수성과 방사성옥소 섭취의 증가 Increases in Doxorubicin Sensitivity and Radioiodide Uptake by Transfecting shMDR and Sodium/Iodide Symporter Gene in Cancer Cells Expressing Multidrug Resistance원문보기
목적: mdr1유전자를 표적으로 한 short hairpin RNA (shMDR)는 다약재내성을 나타내는 암세포에서 효과적으로 mdr1 유전자의 발현을 억제 할 수 있고 sodium iodide symporter (NIS)는 유전자 치료와 리포터로의 기능을 동시에 나타낼 수 있다. 이 연구에서는 사람 대장암세포(HCT15)에 shMDR과 NIS를 동시에 이입하고 Tc-99m sestamibi와 I-125 섭취를 측정하였고 doxorubicin과 I-131 치료효과도 관찰하였다. 대상 및 방법: 사람 태아 신장 세포주(Human Embryonic Kidney cells; HEK293)에 liposome 시약으로 shMDR을 이입하고 RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. shMDR와 NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 만들고 HCT15 세포에 이입 후 48시간에 shMDR에 의한 Pgp의 기능 억제를 확인하기위해 Tc-99m sestamibi 섭취와 doxorubicin 세포독성을 측정하였다. 또한 NIS유전자의 기능을 확인 하기위해 I-125 섭취와 I-131 세포독성도 확인하였다. 결과: shMDR이 이입 된 HEK293 세포에서 mdr1의 mRNA와 Pgp의 발현이 각각 75%, 80% 감소하였다. NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 HCT15 세포에 이입하고 NIS 유전자 발현을 확인 한 결과 대조군에 비해 월등히 높게 발현하였다. Ad-shMDR 300 MOI, Ad-shMDR 300 MOI 와 Ad-NIS 10 MOI를 처리한 경우 Tc-99m sestamibi의 섭취가 대조군보다 1.5배 정도 증가하였다. HCT15 세포에 Ad-NIS 10 MOI를 감염시킨 경우 I-125 섭취가 대조군에 비해 25배 이상 증가였다. 또한 Ad-shMDR와 Ad-NIS를 동시 감염 시켰을 경우 doxorubicin의 세포 독성이 증가하여 나타났고 Ad-NIS 20 MOI를 감염시켰을 때 I-131에 의한 세포독성이 대조군보다 증가하였다. 결론: 세포에 shMDR의 이입으로 mdr1 유전자의 발현이 억제되고 Tc-99m sestamibi의 섭취와 doxorubicin의 세포독성이 증가하였으며 NIS 유전자의 이입으로 I-125의 섭취와 I-131의 세포독성이 증가하였다. 다약제내성세포에 shMDR와 NIS 유전자의 동시 이입은 doxorubicin과 방사성 옥소의 이중치료 효과를 높일 수 있을 것으로 본다.
목적: mdr1유전자를 표적으로 한 short hairpin RNA (shMDR)는 다약재내성을 나타내는 암세포에서 효과적으로 mdr1 유전자의 발현을 억제 할 수 있고 sodium iodide symporter (NIS)는 유전자 치료와 리포터로의 기능을 동시에 나타낼 수 있다. 이 연구에서는 사람 대장암세포(HCT15)에 shMDR과 NIS를 동시에 이입하고 Tc-99m sestamibi와 I-125 섭취를 측정하였고 doxorubicin과 I-131 치료효과도 관찰하였다. 대상 및 방법: 사람 태아 신장 세포주(Human Embryonic Kidney cells; HEK293)에 liposome 시약으로 shMDR을 이입하고 RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. shMDR와 NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 만들고 HCT15 세포에 이입 후 48시간에 shMDR에 의한 Pgp의 기능 억제를 확인하기위해 Tc-99m sestamibi 섭취와 doxorubicin 세포독성을 측정하였다. 또한 NIS유전자의 기능을 확인 하기위해 I-125 섭취와 I-131 세포독성도 확인하였다. 결과: shMDR이 이입 된 HEK293 세포에서 mdr1의 mRNA와 Pgp의 발현이 각각 75%, 80% 감소하였다. NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 HCT15 세포에 이입하고 NIS 유전자 발현을 확인 한 결과 대조군에 비해 월등히 높게 발현하였다. Ad-shMDR 300 MOI, Ad-shMDR 300 MOI 와 Ad-NIS 10 MOI를 처리한 경우 Tc-99m sestamibi의 섭취가 대조군보다 1.5배 정도 증가하였다. HCT15 세포에 Ad-NIS 10 MOI를 감염시킨 경우 I-125 섭취가 대조군에 비해 25배 이상 증가였다. 또한 Ad-shMDR와 Ad-NIS를 동시 감염 시켰을 경우 doxorubicin의 세포 독성이 증가하여 나타났고 Ad-NIS 20 MOI를 감염시켰을 때 I-131에 의한 세포독성이 대조군보다 증가하였다. 결론: 세포에 shMDR의 이입으로 mdr1 유전자의 발현이 억제되고 Tc-99m sestamibi의 섭취와 doxorubicin의 세포독성이 증가하였으며 NIS 유전자의 이입으로 I-125의 섭취와 I-131의 세포독성이 증가하였다. 다약제내성세포에 shMDR와 NIS 유전자의 동시 이입은 doxorubicin과 방사성 옥소의 이중치료 효과를 높일 수 있을 것으로 본다.
Purpose: Multidrug resistance (MDR) of the cancer cells related to mdr1 gene expression can be effectively treated by selective short hairpin RNA for mdr1 gene (shMDR). Sodium/iodide symporter (NIS) gene is well known to have both reporter and therapeutic gene characteristics. We have co-transfected...
Purpose: Multidrug resistance (MDR) of the cancer cells related to mdr1 gene expression can be effectively treated by selective short hairpin RNA for mdr1 gene (shMDR). Sodium/iodide symporter (NIS) gene is well known to have both reporter and therapeutic gene characteristics. We have co-transfected both shMDR and NIS gene into colon cancer cells (HCT15 cell) expressing MDR and Tc-99m sestamibi and I-125 uptake were measured. In addition, cytotoxic effects of doxorubicin and I-131 therapy were also assessed after transfection. Material and Methods: At first, shMDR was transfected with liposome reagent into human embryonic kidney cells (HEK293) and HCT cells. shMDR transfection was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. Adenovirus expressing NIS (Ad-NIS) gene and shMDR (Ad-shMDR) were co-transfected with Ad-NIS into HCT15 cells. Forty-eight hours after infection, inhibition of P-gycoprotein (Pgp) function by shMDR was analyzed by a change of Tc-99m sestamibi uptake and doxorubicin cytotoxicity, and functional activity of induced NIS gene expression was assessed with I-125 uptake assay. Results: In HEK293 cells transfected with shMDR, mdr1 mRNA and Pgp protein expressions were down regulated. HCT15 cells infected with 20 MOI of Ad-NIS was higher NIS protein expression than control cells. After transfection of 300 MOI of Ad-shMDR either with or without 10 MOI of Ad-NIS, uptake of Tc-99m sestamibi increased up to 1.5-fold than control cells. HCT15 cells infected with 10 MOI of Ad-NIS showed approximately 25-fold higher I-125 uptake than control cells. Cotransfection of Ad-shMDR and Ad-NIS resulted in enhanced cytotoxic by doxorubicin in HCT15 cells. I-131 treatment on HCT15 cells infected with 20 MOI of Ad-NIS revealed increased cytotoxic effect. Conclusion: Suppression of mdr1 gene expression, retention of Tc-99m sestamibi, enhanced doxorubicin cytotoxicity and increases in I-125 uptake were achieved in MDR expressing cancer cell by co-transfection of shMDR and NIS gene. Dual therapy with doxorubicin and radioiodine after cotransfection shMDR and NIS gene can be used to overcome MDR.
Purpose: Multidrug resistance (MDR) of the cancer cells related to mdr1 gene expression can be effectively treated by selective short hairpin RNA for mdr1 gene (shMDR). Sodium/iodide symporter (NIS) gene is well known to have both reporter and therapeutic gene characteristics. We have co-transfected both shMDR and NIS gene into colon cancer cells (HCT15 cell) expressing MDR and Tc-99m sestamibi and I-125 uptake were measured. In addition, cytotoxic effects of doxorubicin and I-131 therapy were also assessed after transfection. Material and Methods: At first, shMDR was transfected with liposome reagent into human embryonic kidney cells (HEK293) and HCT cells. shMDR transfection was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. Adenovirus expressing NIS (Ad-NIS) gene and shMDR (Ad-shMDR) were co-transfected with Ad-NIS into HCT15 cells. Forty-eight hours after infection, inhibition of P-gycoprotein (Pgp) function by shMDR was analyzed by a change of Tc-99m sestamibi uptake and doxorubicin cytotoxicity, and functional activity of induced NIS gene expression was assessed with I-125 uptake assay. Results: In HEK293 cells transfected with shMDR, mdr1 mRNA and Pgp protein expressions were down regulated. HCT15 cells infected with 20 MOI of Ad-NIS was higher NIS protein expression than control cells. After transfection of 300 MOI of Ad-shMDR either with or without 10 MOI of Ad-NIS, uptake of Tc-99m sestamibi increased up to 1.5-fold than control cells. HCT15 cells infected with 10 MOI of Ad-NIS showed approximately 25-fold higher I-125 uptake than control cells. Cotransfection of Ad-shMDR and Ad-NIS resulted in enhanced cytotoxic by doxorubicin in HCT15 cells. I-131 treatment on HCT15 cells infected with 20 MOI of Ad-NIS revealed increased cytotoxic effect. Conclusion: Suppression of mdr1 gene expression, retention of Tc-99m sestamibi, enhanced doxorubicin cytotoxicity and increases in I-125 uptake were achieved in MDR expressing cancer cell by co-transfection of shMDR and NIS gene. Dual therapy with doxorubicin and radioiodine after cotransfection shMDR and NIS gene can be used to overcome MDR.
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문제 정의
세포독성의 증가로 확인하고자 하였다. 또한 mdrl 유전자가 발현되는 세포주에서 NIS유전자를 동시에 발현시켰을 때, 치료용 방사성핵종인 H31 의 세포 내 유입을 증가시키는지를 확인함으로서 shRNA를 이용한 약물치료와 함께 1-131 방사성치료를 병행하여 치료 효과를 증가시킬 수 있을 가능성에 대하여 알아보고자 하였다.
본 연구는 항암 약물치료 효과를 감소시키는 mdrl 유전자를 short hairpin RNA (shRNA)를 이용하여 발현을 억제시키고, 그 효과를 Pgp 기질물질로 이용되는 Tc~99m sestamibi 섭취 검사로서 확인하고자 하였으며, 또한 다 약제내성 극복효과를 세포 내 doxorubicin 섭취 증가와 이에 따르는 세포독성의 증가로 확인하고자 하였다. 또한 mdrl 유전자가 발현되는 세포주에서 NIS유전자를 동시에 발현시켰을 때, 치료용 방사성핵종인 H31 의 세포 내 유입을 증가시키는지를 확인함으로서 shRNA를 이용한 약물치료와 함께 1-131 방사성치료를 병행하여 치료 효과를 증가시킬 수 있을 가능성에 대하여 알아보고자 하였다.
저자들의 이번 연구에서는 mdrl 유전자에 대한 shRNA 와 NIS유전자를 동시에 이입시킨 체세포와 암세포에서 mdrl유전자의 억제와 NIS단백의 발현을 증가시키고자 하는 두 가지의 목적을 모두 달성할 수 있었다. 항암 화학요법 치료에서 가장 문제가 되는 암세포에 shMDR을 이 입하거나 주사한 경우.
제안 방법
HCT15 세포를 6 well plate에 Ixl" 세포를 분주하여 Ad-shMDR 300 MOI, Ad-shMDR 300 MOI와 Ad-NIS 10 MOI를 감염시키고 48시간동안 배양한 후, trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다. 370 kBq Tc-99m sestamibi를 PBS 100 G에 희석 하여 30분 동안 37℃에서 배 양하고 차가운 PBS로 2회 세 척 하였다.
370 kBq Tc-99m sestamibi를 PBS 100 G에 희석 하여 30분 동안 37℃에서 배 양하고 차가운 PBS로 2회 세 척 하였다. 2% SDS< 넣어 세포를 용해 시켜 감마선계측기 (Packard, Ⅱ, USA)로 측정하였고 Tc-99m sestamibi 섭취율은 총단백질로 보정한 cpm/mg protein으로 환산하여 평가하였다⑼
7 kBq [1-125] Nal* bHBSS 500 ul로 희석 처리한 뒤 37℃에 30분간 배양 하고 차가운 bHBSS로 3회 세척하였다. 2% SDSf- 넣어 세포를 용해 시켜 감마선계측기 (Packard, USA)로 측정하였다. NIS유전자의 기능을 측정하고자 방사성옥소 섭취율 측정 시 50 UM KC1CU를 첨가하여 CIO「에 의해 옥소의 섭취가 저해되는지를 평가하였다.
5 mM MgCb, 1 mM dNTP mixture, 10 mM DTT, RNaseOUT recombinant ribonuclease inhibitor, 50 unit Superscript reverse transcTiptase 와 diethylpyrocarbonate-treated water) 가 되게 넣었다. 42℃에서 60분 동안 역전사반응을 실시해서 complementary DNA (cDNA)를 얻었다. cDNA 2 μ1을 주형으로 하는 [1.
2 M과 4 M CsCl를 이용하여 초원심분리기로 정제하였다. Adeno-X™Rapid titer Kit (Clontech Lab., USA)을 사용하여 virus titei를 측정하고 multiplicity of infection (MOI)로 환산하여 각 실험에 사용하였다.
HCT15 세포를 96 well plate에 2xl04 세포를 분주 한 후, adenovirus# 감염시킨 24시간 뒤 doxorubicin (Sigma Aldrich, USA) 을 0.01, 0.1, 1, 60, 250, 500, 1000 nM/L 처리하였다. 48시간동안 배양한 후 Cell Count Kit-8 (CCK-8: Dojindo, Japan) 시약을 10 ul 씩 분주해서 4시간 동안 37℃ 에서 배양한 후 흡광도를 측정하였다.
Effect of shRNA on drug sensitivity to doxorubicin in HCT15 cells. Infected HCT15 cells with 300 MOI Ad-shMDR and 10 MOt Ad-NIS were incubated at 37°c for 48 h in the presence of a series of concentrations doxorubicin Data are the means and SD of three measurements and are represents two separate experiments.
NIS 유전자는 방사성옥소를 이용한 영상과 치료 효과를 높일 수 있는 유전자로써 shMDR과 함께 NIS 유전자 발현을 유도하여 화학치료요법과 방사성치료를 병행함으로써 치료 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 보고 Ad-shMDR과 Ad-NIS를 공동 이입하였다. 한 세포에 두개 이상의 유전자를 이입하는 방법은 두 가지의 유전자를 융합하는 internal ribosomal entry site (IRES)로 결합시키거나, *" 양즉성 promoter로 두 유전자를 분리하는 법:" 같은 vector에서 두유 전자를 다른 부위에 위치시키는 방법 " 융합시킬 때 한가지 기능이 잘 발현되지 못하는 경우에는 같은 역가의 바이러스를 공동 이입시키는 방법 등이 있다.
2% SDSf- 넣어 세포를 용해 시켜 감마선계측기 (Packard, USA)로 측정하였다. NIS유전자의 기능을 측정하고자 방사성옥소 섭취율 측정 시 50 UM KC1CU를 첨가하여 CIO「에 의해 옥소의 섭취가 저해되는지를 평가하였다. 1-125 섭취율은 cpm/mg protein으로 환산하여 평가하였다.
Pgp의 발현을 확인하기 위해 HEK293 1 X106 세포에 shMDR 유전자를 lipofectamin plus 시약 (Invitrogen Co., USA)으로 이입하였고 NIS 발현은 HCT15 세포에 20 MOI Ad-NIS로 감염시켰다. 각각 이입 후 48시간에 세포를 PBS 로 세척하고 단백질 추출 [50 mM Tris-HCl (pH 8.
5% NP-40, 100 μ M phenylmethylsulphonyl fluoride, 1 Ug/ml aprotinin, 1 pg/ml luepeptm, 1 mM DTT] 완충액으로 단백질을 추출하여 100 μM을 8% SDS-PAGE에 싣고 nitrocellulose 막에 옮겼다. TBST [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, and 0.1% Tween 20] 완충액에 5% skim milk를 넣고 실온에서 1 시간동안 blocking 한 후 monoclonal anti-Pgp antibody C219 (170 kD, Calbiochem Co., USA), monoclonal anti-NIS FP5A (90 kD, Lab Vision Co., USA), monoclonal anti-f actin antibody (Sigma-Aldrich, USA), monoclonal anti-a Tubulin antibody (Sigma-Aldrich, USA)를 처리해서 immu- noblotting을 하였다. Peroxidase/p 붙어 있는 anti-mouse를 2차 antibody로 사용하였고 ECL시약(ECL, Amersham Pharmacia Biotech, USA)을 nitrocellulose 막에 도포한 뒤 X-ray 필름에 감광시켰다.
383 g, BSA 5 g) 로 세척하였다. bHBSS로 4.6, 9.3, 18.5 MBq 1-131 을 희석하고 각각의 플라스크에 희석액을 넣어 7시간동안 배양하였다. 차가운 bHBSS로 3회 세척한 후에 trypsine-EDTA를 처리해서 세포를 회수하고 6 well plate에 well당 lxltf개의 세포를 넣고 37℃에서 7일 동안 배양하였다.
pRNAT Hl-1 vector의 Xho I, Hind Ⅲ 위치에 shMDR (Ad- shMDR)을 이입 하였고 사람 NIS 유전자(Ad-NIS)는 cytomegalovirus promoter# 사용하여 발현을 유도 하였匸} (삼성의료원 이경한 교수 제공).⑸ 복제능력이 없는 human recombinant adenovirus serotype 5 구조를 이용한 pAdEasy-1 vector■와 재조합을 한 뒤 HEK293 세포에 이입 후 생산된 adenovirus를 2.
대상 및 방법 : 사람 태아 신장 세포주(Human Embryonic Kidney cells: HEK293)에 liposome 시약으로 shMDR을 이입하고 RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. shMDR와 NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 만들고 HCT15 세포에 이입 후 48시간에 shMDR에 의한 Pgp의 기능 억제를 확인하기위해 Tc-99m sestamibi 섭취와 doxorubicin 세포독성을 측정하였다. 또한 NIS유전자의 기능을 확인 하기위해 1-125 섭취와 1-131 세포독성도 확인하였다.
이경한 교수 제공).⑸ 복제능력이 없는 human recombinant adenovirus serotype 5 구조를 이용한 pAdEasy-1 vector■와 재조합을 한 뒤 HEK293 세포에 이입 후 생산된 adenovirus를 2.2 M과 4 M CsCl를 이용하여 초원심분리기로 정제하였다. Adeno-X™Rapid titer Kit (Clontech Lab.
22) 이 연구에서는 HEK293 세포에 양전위를 띄는 liposome으로 shMDR DNA를 세포에이입하여 shMDR의 역할이 원활하게 시행됨을 RT-PCR과 western blot으로 확인하였다. 다음 실험에서는 adenovirus (Ad-shMDR, Ad-NIS) 를 이용하여 세포수준에서 shMDR 과 NIS의 기능을 확인함으로써 동물 모델에 적용이 용이하 게 하였다
이 연구에서는 사람 대장암세포 (HCT15) 에 shMDR과 NIS를 동시에 이입하고 Tc-99m sestamibi와 1-125 섭취를 측정하였고 doxorubicin과 1-131 치료효과도 관찰하였다. 대상 및 방법 : 사람 태아 신장 세포주(Human Embryonic Kidney cells: HEK293)에 liposome 시약으로 shMDR을 이입하고 RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. shMDR와 NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 만들고 HCT15 세포에 이입 후 48시간에 shMDR에 의한 Pgp의 기능 억제를 확인하기위해 Tc-99m sestamibi 섭취와 doxorubicin 세포독성을 측정하였다.
사람 mdrl 유전자 (NCBI, Gene Bank: NM__000927)의 mRNA를 표적으로 한 Wu 등》과 동일한 염기서열의 short hairpin RNA (shRNA)는 [shMDR; 5-GGAAAAGAAA CCAACTGTCdTdT (sense), dTdTCCTTTTCTTTGGT TGACAG-5 (antisense)] mdrl DNA의 502-520 bp 위치에 존재 하는 19 mer의 oligonucleotide이다 pRNAT Hl-1 vector (GenScript Co., USA)의 Xho I, Hind Ⅲ 위치를 이용하여 Hl promoter에 의해 shMDR이 발현되는 adenovirus 제작을 위한 기본구조를 만들었다.
차가운 bHBSS로 3회 세척한 후에 trypsine-EDTA를 처리해서 세포를 회수하고 6 well plate에 well당 lxltf개의 세포를 넣고 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 세포 집락이 형성되면 PBS로 세척하고 crystal violet 시 약 (0.5 g crystal violet 250 ml, 40% formaldehyde 25 ml, ethanol 50 ml, water 175 ml) 을 500 111 씩 분주하여 염색한 후 세포수가 30개 이상인 집락을 측정하였다. 평균과 표준 편차를 구하고 세포의 생존율을 백분율로 환산하였다17)
안1MDR이 이입된 pRNAT Hl-1 vectore HEK293 ixW6 세포에 lipofectamin plus 시약 (Invitrogen Co., USA)으로이입시킨 48시간 뒤 TRIzol (Invitrogen Co., USA)을 이용해 RNA* 분리하였다. RT-PCRe Superscript First-Strand Synthesis System (Fermentas Co.
나타낼 수 있다. 이 연구에서는 사람 대장암세포 (HCT15) 에 shMDR과 NIS를 동시에 이입하고 Tc-99m sestamibi와 1-125 섭취를 측정하였고 doxorubicin과 1-131 치료효과도 관찰하였다. 대상 및 방법 : 사람 태아 신장 세포주(Human Embryonic Kidney cells: HEK293)에 liposome 시약으로 shMDR을 이입하고 RT-PCR과 western blot으로 분석하였다.
5 unit의 Taq 중합효소, 20 pM mdrl primer (5'-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3‘: 5'-GAAGCACT GGGATGTCCGGT-3') ] 혼합액 를 만들었고 GAPDH primer (57-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3;7 5f-GTAG AGGCAGGGATGATGTTC9) 는 대조군으로 사용하였다. 증폭조건은 94℃ 에서 3분 동안 변성을 유도하고 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분 30초를 33회 시행하였다. PCR 생성물은 1.
대상 데이터
인체 대장암 세포인 HCT15 세포주는 20% 혈청. 0.7% 항생제 (GibcoBRL Co., USA) 가 포함된 RPMI 1640 (GibcoBRL Co., USA) 배지에 배양하였고, 인체 태아 신장(Human Embryonic Kidney cell: HEK293, ATCC No.: CRL-1573) 세포주는 10% 혈청이 들어있는 MEM (GibcoBRL Co., USA) 배지에 5% CO2 농도로 37℃에서 배양하여 실험에 사용하였다.
42℃에서 60분 동안 역전사반응을 실시해서 complementary DNA (cDNA)를 얻었다. cDNA 2 μ1을 주형으로 하는 [1.5 mM MgCb, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 20 pM mdrl primer (5'-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3‘: 5'-GAAGCACT GGGATGTCCGGT-3') ] 혼합액 를 만들었고 GAPDH primer (57-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3;7 5f-GTAG AGGCAGGGATGATGTTC9) 는 대조군으로 사용하였다. 증폭조건은 94℃ 에서 3분 동안 변성을 유도하고 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분 30초를 33회 시행하였다.
Boland 등17)은 유방암 MCF7세포. 전립 선암 DU145 세포, 폐선암 A549 세포, 유방암 T-47D 세포. 전립선암 PC-3 세포, 대장암 HT-29 세포에서 Ad-NIS를 감 염시켰을 때 옥소 섭취가 35-225배 증가 하였고 감염시킨 세 포를 IT31로 처리했을 경우 세포 집락 형성능이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, 1-123을 마우스 복강에 주사하 였을 경우 이식된 종양조직의 방사능 집적을 영상으로 확인한 결과를 발표한 바 있다.
데이터처리
5 g crystal violet 250 ml, 40% formaldehyde 25 ml, ethanol 50 ml, water 175 ml) 을 500 111 씩 분주하여 염색한 후 세포수가 30개 이상인 집락을 측정하였다. 평균과 표준 편차를 구하고 세포의 생존율을 백분율로 환산하였다17)
성능/효과
배출하는 역할을 한다.3,6) 이러한 기질은 일반적으로 지용성 양이온 화합물로써 에너지 의존성이 높으며 약물 배출 펌프 작용에 의해 세포 밖으로 배출되며, 기질의 종류 중 항암치료제는 taxanes (paclitaxel, docetaxel), anthracycline 계 항생물질, epipodophyllotoxins (etoposide, teniposide) 등이 있다. Pgp modulator는 칼슘통로 차단제인 verapamil, 면역억제제 cyclosporin A로 알려져 있고 Pgp에 대한 경쟁적 억제자로 작용하는 물질로서 약제의 세포 내 축적을 증가시킨다.
Pgp modulator는 칼슘통로 차단제인 verapamil, 면역억제제 cyclosporin A로 알려져 있고 Pgp에 대한 경쟁적 억제자로 작용하는 물질로서 약제의 세포 내 축적을 증가시킨다. 6)암 환자의 장기적인 항암치료제 투여는 종양의 Pgp 발현이 증가되고 화학요법의 치료효과를 감소시키므로, 다 약제내성의 극복은 항암치료의 성공과 직접적으로 연관되어있다.
저자들의 연구에서도 감마카메라 영상이나 PET 영상뿐만 아니라 치료용 방사성 핵종을 이용한 방사선 치료효과까지 기대할 수 있는 NIS 유 전자를 발현시키는 adenovirus를 이용하였다. Ad- NIS 20 MOI를 처리한 경우에서 NIS 유전자의 발현이 대조군에 비해 월등히 증가했음을 확인하였고 M25 섭취량으로 평가한 NIS의 기능도, 대조군에 비해 25배 정도 증가되었다. 또한 H31을 처리한 경우 Ad-NIS에 감염된 세포가 대조군에 비해 세포생존율이 25% 감소됨으로서 NIS을 이용한 방사성치 료효과를 기대할 수 있었다.
5 MBq를 7시간 처리 했을 때 세포 생존율이 1-131의 양이 증가할수록 반비례적으로 감소함을 확인할 수 있었다. Ad-NIS 20 MOI로 감염 시킨 경우 18.5 MBq를 처리했을 때 54%를 보이는 반면 대조군은 79%의 생존율을 나타내 가장 큰 차이가 나타났다(Fig. 6).
Ad-NIS로 감염시킨 뒤 48시간이 경과한 후 1-131 4.6, 9.3, 18.5 MBq를 7시간 처리 했을 때 세포 생존율이 1-131의 양이 증가할수록 반비례적으로 감소함을 확인할 수 있었다. Ad-NIS 20 MOI로 감염 시킨 경우 18.
HCT15 세포에 Ad-NIS 10 MOI, Ad-NIS 10 MOI와 Ad-shMDR 100 MOI, Ad-shMDR 100 MOI를 감염시키고 48시간 후에 3.7 kBq/500 111을 30분 처리하여 1-125 섭취율을 측정한 결과, Ad-NIS 10 MOI 처리했을 때 1-125 섭취율이 대조군보다 약 25배 높았다. Ad-NIS 10 MOI와 Ad-shMDR 100 MOI 처리한 세포에서는 Ad-NIS 10 MOI 처리했을 때와 유사한 증가치를 보였다.
HCT15 세포에 Ad-shMDR로 감염시킨 24시간 뒤 doxorubicin을 0.01, 0.1, 1, 60, 250, 500, 1000 UM/L농도로 처리한 결과, 대조군보다 Ad-shMDR 300 MOI와 Ad-NIS 10 MOI을 동시에 감염시킨 경우가 doxorubicin에 대한 감수성이 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 1, 60 UM/L의 농도로 처리 한 경우에는 암세포의 항암제 감수성이 대조군보다 30% 이상 증가하였다(Fig.
80% 감소하였다. NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 HCT15 세포에 이입하고 NIS 유전자 발현을 확인한 결과 대조군에 비해 월등히 높게 발현하였다. Ad-shMDR 300 MOI, Ad-shMDR 300 MOI 와 Ad-NIS 10 MC)I를 처리한 경우 Tc-99m sestamibi의 섭취가 대조군보다 1.
Ad-NIS 10 MOI와 Ad-shMDR 100 MOI 처리한 세포에서는 Ad-NIS 10 MOI 처리했을 때와 유사한 증가치를 보였다. NIS 유전자가 이 입된 HCT15 세포를 C1QT를 처리하였을 경우에는 Ad-NIS 10 MOI, Ad-NIS 10 MOI와 Ad-shMDR 100 MOI를 처리한 경우의 방사성옥소 섭취율은 NIS를 이입하지 않은 대조군과 유사한 결과를 나타내 방사성옥소의 섭취가 저해되어 NIS 유전자 특이적 반응임을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
1 mL Tc-99m sestamibi를 30분 동안 37℃ 에서 배 양한 결과를 비교하면. Tc-99m sestamibi 섭취정도는 Ad-shMDR 300 MOI, Ad-shMDR 300 MOI와 Ad-NIS 10 MOI를 감염시켰을 때 대조군보다 섭취율이 약 1.5배 증가되었다(Fig. 3).
또한 NIS유전자의 기능을 확인 하기위해 1-125 섭취와 1-131 세포독성도 확인하였다. 결과: shMDR이 이입 된 HEK293 세포에서 mdrl의 mRNA와 Pgp의 발현이 각각 75%. 80% 감소하였다.
또한 Ad-shMDR와 Ad-NIS를 동시감염 시켰을 경우 doxorubicin의 세포 독성이 증가하여 나타났고 Ad-NIS 20 MOI를 감염시켰을 때 1-131에 의한 세포독성이 대조군보다 증가하였다. 결론: 세포에 shMDR의 이입으로 mdrl 유전자의 발현이 억제되고 Tc-99m sestamibi 의 섭취와 doxorubicin의 세포독성이 증가하였으며 NIS 유전자의 이입으로 1-125의 섭취와 1-131의 세포독성이 증가하였다. 다약제내성세포에 shMDR와 NIS 유전자의 동시 이 입은 doxorubicin과 방사성 옥소의 이중치료 효과를 높일 수 있을 것으로 본다.
두 가지의 기능을 나타내지 못하였다. 그러나 동시에 공동 이입한 경우에는 두 가지의 기능이 충분하게 나타났으므로 본 연구를 성공적으로 수행할 수 있었다.
뒤에 회수한 세포를 RT-PCR 한 결과. 대조군에 비하여 mdrl발현이 mRNA 영역에서 75% 감소되어짐을 확인하였다(Fig. 1A). 또한 western blot 검사에서도 Pgp 발현이 대조군보다 80% 감소됨을 확인하였다(Fig.
HCT15 세포에 Ad-NIS 10 MOI를 감염시킨 경우 1-125 섭취가 대조군에 비해 25배 이상 증가였다. 또한 Ad-shMDR와 Ad-NIS를 동시감염 시켰을 경우 doxorubicin의 세포 독성이 증가하여 나타났고 Ad-NIS 20 MOI를 감염시켰을 때 1-131에 의한 세포독성이 대조군보다 증가하였다. 결론: 세포에 shMDR의 이입으로 mdrl 유전자의 발현이 억제되고 Tc-99m sestamibi 의 섭취와 doxorubicin의 세포독성이 증가하였으며 NIS 유전자의 이입으로 1-125의 섭취와 1-131의 세포독성이 증가하였다.
Ad- NIS 20 MOI를 처리한 경우에서 NIS 유전자의 발현이 대조군에 비해 월등히 증가했음을 확인하였고 M25 섭취량으로 평가한 NIS의 기능도, 대조군에 비해 25배 정도 증가되었다. 또한 H31을 처리한 경우 Ad-NIS에 감염된 세포가 대조군에 비해 세포생존율이 25% 감소됨으로서 NIS을 이용한 방사성치 료효과를 기대할 수 있었다.
shMDR와 NIS 유전자가 발현하는 adenovirus를 만들고 HCT15 세포에 이입 후 48시간에 shMDR에 의한 Pgp의 기능 억제를 확인하기위해 Tc-99m sestamibi 섭취와 doxorubicin 세포독성을 측정하였다. 또한 NIS유전자의 기능을 확인 하기위해 1-125 섭취와 1-131 세포독성도 확인하였다. 결과: shMDR이 이입 된 HEK293 세포에서 mdrl의 mRNA와 Pgp의 발현이 각각 75%.
49)저자들 의 본 연구에서는 adenoviral vector system (Ad-shMDR)을 이용하여 인체 대장암세포에 감염을 유도하였고, Fig 5에서 표시하였듯이 Ad-shMDR을 감염시킨 세포에 doxorubicin을 처리한 경우, 세포생존율이 대조군에 비하여 유의하게 감소 되었음을 확인할 수 있었다. 또한 mdrl유전자에 대한 shRNA (Ad-shMDR)< 처리한 후, Tc-99m sestamibi 섭취 량이 약 1.5배 증가됨을 확인할 수 있었다. 이들 결과는 저자 들이 제작한 mdrl에 대한 shMDR이 유전자 수준에 작용하여 Pgp의 발현을 억제시킴으로서 항암제인 doxorubicin의 암세 포에 대한 독성 을 증가시 키 고 Tc-99m sestamibi의 세 포 내 섭취 증가를 나타낸다는 것을 증명하였고, mdrl이 과발 현된 암조직에 Ad-shMDR를 감염시킴으로써 내성을 보이 던 암조직에 사용하지 못하던 약제들을 사용함으로서 항암 화학치료요법의 효과를 증가시킬 것으로 추측할 수 있다
1A). 또한 western blot 검사에서도 Pgp 발현이 대조군보다 80% 감소됨을 확인하였다(Fig. IB). Ad-NIS를 감염시킨 대장암 세포에서는 NIS 유전자의 발현이 대조군에 비하여 증가하였음을 확인하였다(Fig.
이러한 선도적인 연구들은 siRNA의 투여가 다약재 내성을 완전 극복하거나 기존의 세포막에 영향을 미침으로서 세포막에 발현된 Pgp에 길항하여 세포질내의 약물 농도를 증가시키는 방법에 부가한 다면 다 약재 내성을 극복할 수 있는 길이 열릴 것이란 가정을 가능하게 한다. 본 연구에서도 이들이 발표한 siRNA 염기서열과 동일한 shRNA을 제작하여 내인성 mdrl 유전자가 발현된 HEK293 세포에 이입한 48시간 후 mdrl의 mRNA와 Pgp 발현이 감소됨을 RT-PCR과 western blot으로 증명할 수 있었다.
5배 증가됨을 확인할 수 있었다. 이들 결과는 저자 들이 제작한 mdrl에 대한 shMDR이 유전자 수준에 작용하여 Pgp의 발현을 억제시킴으로서 항암제인 doxorubicin의 암세 포에 대한 독성 을 증가시 키 고 Tc-99m sestamibi의 세 포 내 섭취 증가를 나타낸다는 것을 증명하였고, mdrl이 과발 현된 암조직에 Ad-shMDR를 감염시킴으로써 내성을 보이 던 암조직에 사용하지 못하던 약제들을 사용함으로서 항암 화학치료요법의 효과를 증가시킬 것으로 추측할 수 있다
후속연구
항암 화학요법 치료에서 가장 문제가 되는 암세포에 shMDR을 이 입하거나 주사한 경우. NIS 유전자를 핵의학 영상의 reporter 유전자로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 shMDR로서 항암제 의 약제 감수성을 증가 시키고, NIS 단백질을 이용한 IT31 등에 의한 방사선 치료를 병용함으로서 암조직에 대한 이 중 치료를 시행하여 항암치료 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 추측한다. 본연구에서는 체내실험에서 shMDR과 NIS 유전자의 효과를 증명했지만, 향후 종양이식 동물 모델에서 항암 약물치료와 방사성 옥소를 이용한 방사선 치료를 병행하여 이들의 치료 효과 증진에 대한 상승 작용을 규명한다면 이것이 임상 적용에 있어서의 가능성에 한 발짝 다가서는 의의를 가질 수 있다고 본다.
결론: 세포에 shMDR의 이입으로 mdrl 유전자의 발현이 억제되고 Tc-99m sestamibi 의 섭취와 doxorubicin의 세포독성이 증가하였으며 NIS 유전자의 이입으로 1-125의 섭취와 1-131의 세포독성이 증가하였다. 다약제내성세포에 shMDR와 NIS 유전자의 동시 이 입은 doxorubicin과 방사성 옥소의 이중치료 효과를 높일 수 있을 것으로 본다.
NIS 유전자를 핵의학 영상의 reporter 유전자로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 shMDR로서 항암제 의 약제 감수성을 증가 시키고, NIS 단백질을 이용한 IT31 등에 의한 방사선 치료를 병용함으로서 암조직에 대한 이 중 치료를 시행하여 항암치료 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 추측한다. 본연구에서는 체내실험에서 shMDR과 NIS 유전자의 효과를 증명했지만, 향후 종양이식 동물 모델에서 항암 약물치료와 방사성 옥소를 이용한 방사선 치료를 병행하여 이들의 치료 효과 증진에 대한 상승 작용을 규명한다면 이것이 임상 적용에 있어서의 가능성에 한 발짝 다가서는 의의를 가질 수 있다고 본다.
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