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문제 정의
- 본 연구는 패류의 인공종묘 생산시 먹이로 상용되는 Isochrysis galbana의 효과적인 냉동보존 기법을 확립하기 위하여 적정동해방지제의 종류 및 농도 그리고 해동 후 세포배양과 먹이효과를 조사하였다.
제안 방법
- 각각의 동해방지제에 침지된 유생은 0.5 ml straw에 5 X 105 cell/개체의 밀도로 수용하였고 평형시간은 20℃에서 20분을 두었다. 유생의 냉동은 프로그램 동결기 (Kryosave Integra, Rovers Polska, UK)를 이용하여 20℃부터 -12℃ 까지 -1℃/min의 속도로 냉각하였고 -12℃부터 -35℃까지는 -2℃/min.
- 냉동보존 효과를 위한 생존율 조사는 액체질소에 24시간 보관된 이후, straw틀 질소통에서 꺼낸 다음 20℃에서 해동한 결과를 이용하였다.
- 냉동보존된 Isochrysis galbana의 해동 이후의 배양은 각 실험구별로 3 × 105 cell을 채취하여 5일 동안 광학현미경 하에서 관찰하면서 그 성장을 비교하였다.
- 유생의 성장은 Profile-Project (Nikon, V-12B)틀 이용하여 각장과 각고를 0.1 ㎛까지 측정하였고 생존율을 조사하였다.
- 참굴 부유유생에게 공급한 Isochrysis galbana의 실험구는 냉동보존후 해동하여 배양된 실험구와 비냉동보존된 대조구로 구분하여 매일 1 X 104 cell/ml의 농도로 공급하였다.
대상 데이터
- 냉동보존을 위한 동해방지제는 dimethyl sulfoxide (DMSO), 이ycerol (Gly), ethylene 이 ycol (EG), 1.2-propanedial (PD) 등, 네가지의 동해방지제틀 사용하였으며 인공해수로 1.0 M에서 3.0 M까지 0.5 M 간격으로 희석하여 이용하였다.
- 냉동보존하여 해동한 Isochrysis galbana와 비냉동한 I. galbana의' 먹이효과 실험에는 평균각장, 평균각고, 평균#이 62.5 ± 5.8 mm, 110.4 ± 10.8 mm, 98.8 ± 31.4 g인 참굴 어미에서 산란유발된 부화 후 1일째 되는 D형 유생을 사용하였다. 부화한 D형 유생은 3 liter 원형 수조에 수용하였고 사육밀도는 사육해수 ml당 5 개체로 하였으며 수온은 25 ± 1℃로 유지하였다.
- 본 실험에 사용된 Isochrysis galbane: 전남대학교 복원생태학연구실의 먹이생물배양실에서 원종 배양중이던 것을 수온 20 ± 조도 4,000 lux에서 Conway 배지를 사용하여 20 Iter 생수병에 계대배양하였다.
이론/모형
- 1. Two-step freezing procedure used in the experiment.
성능/효과
- 냉동보존된 Isochrysis ga]bana의 해동 후 세포의 성장과 수질변화와의 관계를 조사한 걸과, glycerol의 경우 1.5 M에서 실험개시시 30 × 104 cell/ml이던 것이 3 일 후 190 x 104 cell/ml로 성장하였고 실험종료시인 5 일 후에는 512 x 104 cell/ml로 모든 실험구를 통하여 가장 높은 성장을 보였다. 이와 같이 가장 높은 성장을 보였을 때의 질산과 아질산 및 암모니아의 변화량을 보면 실험개시시 각각 19.
- 냉동보존된 Isochrysis galbana의 해동 후 생존율을 관찰한 결과, dimethyl sulfoxide의 경우는 1.0 M에서 3.0 M까지 각각 79.0%, 94.0%, 86.3%, 69.3%, 60.0%의 생존율을 보였고 ethylene glycol에서는 농도별로 각각 69.7%, 88.0%, 80.7%, 62.3%, 55.0%, 미ycerol에서는 각각 87.3%, 94.7%, 93.3%, 85.3%, 72.7%틀 보였으며 1.2-propanedial에서는 67.0%, 89.3%, 91.7%, 79.3%, 63.7%의 생존율을 보여 glycerol 1.5 M 농도에서 가장 좋았다 (Fig. 2).
- 0 M에서 실험개시시 30 × 104 cell/ml이던 것이 3 일 경과 후에는 158 × 104 cell/ml, 실험종료시인 5 일 후에는 407 × 104 cell/ml로 성장하였다. 또한 1.5 M 실험구에서는 30 × 104 cell/ml이던 것이 3일 후 190 X 104 cell/ml, 5 일 후에는 512 × 104 cell/ml로 모든 배양 실험구를 통틀어 가장 높은 성장을 보였다. 한편 2 M 실험구에서는 실험개시시 30 × 104 cell/ml이던 것이 3 일 후 176 X 104 cell/ml, 5 일 후에는 462 × 104 cell/ml로 성장한 반면 2.
- 5 M에서 실험개시시 30 × 104 cell/ml이던 것이 3 일 후 190 x 104 cell/ml로 성장하였고 실험종료시인 5 일 후에는 512 x 104 cell/ml로 모든 실험구를 통하여 가장 높은 성장을 보였다. 이와 같이 가장 높은 성장을 보였을 때의 질산과 아질산 및 암모니아의 변화량을 보면 실험개시시 각각 19.4 μm, 10.4 μm, 8.4 μm로 총질소량 38.2 μm이던 것이 실험종료 시에는 8.0 μm, 6.0 μm, 1.3 μm로 총질소량이 15.3 μm로 가장 낮아 세포증가율은 총질소량과 반비 례하였다.
- 참굴 D상 유생 각고의 경우, 냉동보존 후 배양된 먹이 실험구에서 실험개시시 62.2 ± 2.1 μm이던 것이 3 일 후 79.3 ± 2.5 μm, 실험 종료시인 5 일 후에는 128.4 ± 7.8 μm로 성장하였고, 대조구의 경우 실험개시시 62.2 ± 2.1 μm이던 것이 3 일 후 81.5 ± 3.6 μm, 실험 종료시인 5 일 후에는 131.3 ± 8.2 μm로 성장하여 각고의 경우 큰 성장의 차이는 보이지 않았다 (Fig. 8).
- 참굴 D형 유생을 대상으로 먹이효과 실험을 조사한 결과 각 장의 경우 냉동보존 후 배양된 먹이 실험구에서 실험개시시 72.5 ± 2.8 μm이던 것이 3 일후 84.1 ± 3.2 μm, 실험 종료시인 5 일 후에는 117.4 ± 8.2 μm로 성장하였다. 대조 구의 경우 실험개시시 72.
- 참굴 D상 유생의 생존율은 냉동보존 후 배양된 먹이 실험구에서 실험개시시 100%이던 것이 3 일 후 84.6%, 실험 종료시인 5일 후에는 65.2%의 생존율을 보였고, 대조구의 경우 실험개시시 100%이던 것이 3 일 후 85.4%, 실험 종료시인 5 일후에는 67.8%의 생존율을 보여 유의한 차이를 보이지 않았다 (Fig. 9).
후속연구
- Iso사}rysis galbana의 냉동보존 효과를 조사하기 위해 해동 후 생존율을 관찰한 결과, 각 동해방지제의 농도 1.5 M과 2M에서는 80% 이상의 생존율을 보임으로서 동해방지제 간의 유의한 차이는 없었다 동해방지제의 농도 1 M, 2.5 M 및 3 M의 실험구에서는 60%이상의 생존율을 보여 Canavate and Lubian (1995) 이 보고한 생존율 40%와는 차이를 보이고 있는데, 이러한 원인으로는 I. galbana의 경우, 동해방지제의 종류와 농도 및 독성, 냉각속도, 평형시간 등 복합요인에 따라 생존율에 차이를 보일 수 있다고 판단되어지나, 금후 종 특이성에 대한 적정 동해방지제의 종류와 농도에 관한 연구가 계속되어야 할 것이다.
- 특히 생존율에 큰 영향을 미친다고 보고되어 있는 동해방지제의 독성 및 투과성 여부와 관련한 복합요인의 작용에 관한 연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 해양 미세조류 냉동보존의 산업적인 유용성을 위해 냉동보존 후 생존율 확인뿐만 아니라 보존한 미세조류를 배양시켜 먹이로 이용할 수있는 기법도 개발되어야 할 것으로 판단되며 이와 같은 기법이 확립됨으로써 해양 유용동물의 인공종묘 생산시 냉동보존된 미세조류의 먹이생물로서의 역할도 가능해 질 것이라 생각된다.
- 본 연구의 걸과, 동해방지제의 종류와 농도에 따라 생존율이 차이를 보임으로써 냉동보존시 종별 동해방지제의 선택과 평형시간 및 각 단계별 온도 등에 대한 구체적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 특히 생존율에 큰 영향을 미친다고 보고되어 있는 동해방지제의 독성 및 투과성 여부와 관련한 복합요인의 작용에 관한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 생각된다. 특히 생존율에 큰 영향을 미친다고 보고되어 있는 동해방지제의 독성 및 투과성 여부와 관련한 복합요인의 작용에 관한 연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 해양 미세조류 냉동보존의 산업적인 유용성을 위해 냉동보존 후 생존율 확인뿐만 아니라 보존한 미세조류를 배양시켜 먹이로 이용할 수있는 기법도 개발되어야 할 것으로 판단되며 이와 같은 기법이 확립됨으로써 해양 유용동물의 인공종묘 생산시 냉동보존된 미세조류의 먹이생물로서의 역할도 가능해 질 것이라 생각된다.
- 한편 외국의 경우를 보면, Canavate and Lubian (1995) 은 유용 해산동물의 먹이로 이용되는 미세조류의 냉동보존에 관하여 보고하였고 Gwo et al. (2005)은 Nannochloropsis oculata의 냉동보존에 대하여 연구하였으나 동해방지제의 종류와 농도, 냉각속도, 평형시간 등에 따라 생존율에 차이를 보이고 있어 보다 구체적인 연구가 뒤따라야 할 것이다.
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