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제안 방법
- 배양조건은 37℃, 5% CO2, 95% 이상의 적당한 습도를 유지한다. 신선한 배지를 2일 간격으로 교체하며 배양하였으며, 1주일에 한 번씩 계대 배양하였다. 실험에 쓰이는 세포는 70~90%의 충실도를 보이는 세포를 사용하였고 전 처리 후 pre-warmed PBS (phosphate buffered sal- ine)로 2회 세척한 후, ER stress 유도하는 시약 [DTT (3 mM/ml), tunicamycin (20(ig/ml), Ca저 ionopore A23187 (1 Hl/ml), BFA (1 ul/ml)]을 처리한다.
- RT-PCRe total RNA (3 ug/ml)에서 cDNA의 합성 후 94 ℃ 에 서 2분간 반응시 켜 Reverse Transcriptase를 inactivation 시킨 후 DEPC-HQ로 최종 100 μ1를 만들었다. cDNAt 증폭하기 위해 mouse Ajuba (NM_010590) primer (20-mer sense primer 5'-AGTCTCCTGGTCCCTTCGTT-3', 20-mer antisense primer 5'-TCACCCTCACAATGTCCTCA-3')와 dNTP와 taq polymerase및 taq buffer가 혼합된 2xDyemix (Biostream) 가하여 총 반응액이 20 μ1가 되도록 하여 PCR을 시행하였다. Ajuba의 증폭조건은 처음 94℃ 에서 5분간 predenaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 57.
- 같은 조건에서 ER stress maker인 Bip mRNA levelo] 같은 패턴으로 발현하는 것을 관찰할 수 있다. 앞의 실험결과에서 tunicamycin과 DTT의 스트레스 유도 시간에 따라 각각 0시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간의 경과에 따른 mRNA의 발현양상에 대해 관찰하였다. Tunicamycin의 스트레스 유도 후 대조군에 비하여 2시간 이후부터 강한 발현을 보이기 시작하여 차츰 시간이 지날수록 발현이 커졌으며 DTT는 스트레스 처리 4시간이후부터 강한 발현의 증가를 보여 증가하는 추세를 보였다.
- ERp29의 발현은 TSH 의존적으로 조절되며, thyroglobulin의 분비 량이 약 30% 증가한다[4]. Ajuba mRNA 발현의 TSH 의존성을 조사하였다. 갑상선 세포에서 TSH에대하여 Ajuba mRNA의 발현은 비의존적임을 확인하였다 (Fig.
- 즉, Ajuba 유전자에서는 TSH의 유무와 상관관계를 보이지 않았다. 정상상태에서와 ER stress 상태에서의 Ajuba mRNA의 세포 내 반감기를 측정하였다. DRB처리 전의 발현 정도를 100%로 하여 시간에 따른 발현 정도를 도표로 표시할 때, 세포 내 반감기는 약 2시간임을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 본 연구의 주된 대상인 Ajuba는 세포질 LIM domain에 포함되는 단백질 family의 일원으로 세포의 표면부착과 밀접한 관계가 있다. Actin cytoskeleton의 표면 수용체로서의 기능을 맡게 된다[1].
- 본 실험에 사용되는 갑상선 배양세포인 FRTL-5 (Fisher rat thyroid cells)는 5% 우혈청을 포함한 Coon's modified media에서 배양한다. 배양조건은 37℃, 5% CO2, 95% 이상의 적당한 습도를 유지한다.
- 신선한 배지를 2일 간격으로 교체하며 배양하였으며, 1주일에 한 번씩 계대 배양하였다. 실험에 쓰이는 세포는 70~90%의 충실도를 보이는 세포를 사용하였고 전 처리 후 pre-warmed PBS (phosphate buffered sal- ine)로 2회 세척한 후, ER stress 유도하는 시약 [DTT (3 mM/ml), tunicamycin (20(ig/ml), Ca저 ionopore A23187 (1 Hl/ml), BFA (1 ul/ml)]을 처리한다. Total RNA를 얻기 위하여 easy-BLUE™ Ibtal RNA Extraction Kit를 사용한다.
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