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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 L. monocytogenes6^ 대한 단크론성 항체를 생산하고, 면역크로마토그래피법을 개발하였으며, 이를 임의로 접종시킨 식품시료 분석에 응용하여 그 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 L. monocytogenes를 신속하게 분석할 수 있는 면역 크로마토그래피 법을 개발하고자 하였다. 먼저 L monocytogenes 에 대한 단크론성 항체(FKLM-3B12-37)를 개발하여 직경 40nm 로 제작된 colloidal gold와 합성한 후 conjugate pad에 처리하였고 nitrocellulose membrane 상의 test line과 control line에 단크론성 항체와 anti-mouse IgG를 각각 처리하여 면역크로마토그래피법을 개발하였다.
제안 방법
- 소고기와 상추 각 25 g에 108 cell, 106 cell, 그리고 10" cell로 오염시킨 후 1시간 동안 고정화 시키고 LEB 125 mL를 첨가하여 2 분간 stomach하였다. Stomach한 각 시료의 상충액을 1 mL 취하여 3회 원심수세하고 최종 볼륨을 200 [iL 조정 한 후 면역크로마토그래피법에 적용하였다.
- 마지막으로 실험의 결과가 나타나는 NC membranee test line과 control line을 앞서 생산된 단크론성 항체와 anti-mouse IgG로 각각 처리하여 370에서 30분간 건조 후 사용하였다. Absorbent pad 는 다른 처리 없이 바로 사용하여 면역크로마토그래피를 개발하였다.
- 2) 2mL에 pellet을 부유시켜 냉장 보관하였다. Colloidal gold 입자와 항체의 결합을 확인하기 위해 항체, colloidal gold 용액, colloidal gold-antibody 용액을 fluorescence spectroscopy LAMBDA-900(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 확인하였다.
- 먼저 직경 40nm의 colloidal gold 용액을 Frens(15)의 방법으로 본 연구실에서 직접 준비하였다. Colloidal gold와 항체를 결합시키기에 앞서 colloidal gold를 안정화 시키는 항체의 량을 결정하였다. 먼저 동결 건조된 단크론성 항체를 0 mg/mL의 농도가 되도록 2 mM borax buffer에 녹여 준비하였고 colloidal gold 용액을 0.
- FKLM-3B12-17 hybridoma로부터 생산된 항체를 대량 생산하였고, 그 특성을 Western blot으로 확인하였다. 그 결과 Fig.
- Formalin 으로 처리된 L. monocytogenes(forma\ In killed L. monocytogenes, FKLM)를 PBS 에 10° cell/mL로 준비 하고 complete Freund's adjuvant(Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1 : l(v/v) 로 유화시켜 생후 7~8주된 BALB/C 마우스(Hyochang Science, Daegu, Korea)에 마리당 ceIl/200씩 복강에 1차 면역을 실시하였다. 1차 면역 2주와 4주 후 각각의 면역원과 incomplete Freund's adjuvants.
- L. monocytogenes ATCC 19115를 trypic soy broth(TSB, Difco, Ann Arbor, MI, USA)배지 500 mL에 접종한 후 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하고, 37% formalin 용액을 최종농도가 0.5%가 되도록 균을 배양한 배양액에 첨가하여 16시간 동안 약하게 진탕하며 처리하였다. 처리된 액을 5,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상충액은 버리고 균체는 0.
- 5로 맞춘 후 E-tube에 1 mL 씩 분주하였다. 각각의 E-tube에 단크론성 항체 용액을 0, 10, 20, 30-150 gL< 넣고 2mM borax but로 각 E- tube의 volume- 1150로 맞춘 후 교반하여 5분간 방치하였다. 시간이 경과 후 10%(w/v) NaCl 용액을 각 E-tube에 50gL씩 넣어 교반하고 1분 후 흡광도를 540 nm에서 관찰하여 colloidal gold 를 안정화시키는 항체의 량을 측정하였다(14).
- monocytogenes 배양액에 대하여 세척과정 없이 바로 면역크로마토그래피에 적용이 가능한지, 세척이 필요하다면 면역 크로마토그래피에 가장 영향을 적게 미치는 세척용액의 종류를 선택하는 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, L. monocy togenes ATCC 19115를 Listeria enrichment broth(LEB, Difco) 배지 5mL에 한백금이 접종한 후 3TC에서 24시간 배양한 배양액을 3개의 E-tube에 ImL씩 옮긴 후 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 생성된 pellet을 재부유하는 용액을 PBS (pH 7.4), 0.1 M Tris-HCl(pH 7.2), 그리고 3차 증류수 등 3종류로 하여 3회 원심 수세하여 준비하였고, 세척과정을 거치지 않은 배양액을 각각 개발된 면역크로마토그래피에 200씩 분주하였다. 또한 면역 크로마토그래피의 특이성을 확인하기 위해 L.
- 개발된 면역크로마토그래피에 대한 시료 전개용액의 영향을 확인하였다. 즉, L.
- 반면에 PBS와 Tris-HCl 용액은 양성시료에서 control과 test line에 적색선이 형성되었고 음성 시료에서는 control line에만 적색선이 형성되어 면역크로마토그래피에 사용이 적합한 용액으로 확인되었다. 그러나 적색선 의 색 강도가 PBS용액을 처리한 면역크로마토그래피에서 더 선 명하였기 때문에 PBS를 최적 전개용매로 선택하였다(Fig. 4)
- 최종 면역 후 항체 생성여부를 확인하기 위하여 마우스의 꼬리정맥에서 혈청을 채취하여 간접 비경쟁 효소 면역분석법 (indirect non-competitive ELISA}을 실시하여 항체의 역가를 측정하였다. 높은 역가를 가지는 마우스의 비장세포와 myeloma ceIl(V653)을 Kohler 등(12)의 방법에 따라 융합을 실시하였고, Mckeam 등(13)의 무한대 희석법으로 cloning한 후 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma를 개발하였다. 확보된 hybridoma 를 대량 배양한 후 마우스의 복강에 이식하여 1주일 후 복수액을 생산하였고, 생산된 복수액을 ammonium sulfate 침전법으로 1 차 정제한 후 protein G agrose(Bioprogen, Daejeon, Korea)로 2차 정제한 것을 PBS에 3일 동안 투석하였으며, 동결건조 시킨 후 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 가능성이 높다. 따라서 최적의 전개용매를 선택하기 위해 L. monocytogenes를 면역크로마토그래피에 적용 시 PBS, 0.1 M Tris- HC1, 3차 증류수, 마지막으로 LEB를 사용하여 면역 크로마토그래피에 적용하였다. 그 결과 3차 증류수의 경우 음성과 양성 시료 모두에서 control과 test line에 적색선이 형성되지 않았고, LEB배지의 경우 양성, 음성시료 모두 test line에 선이 생성되어 분석하는데 있어 부적합한 것으로 판단되었다.
- 2), 그리고 3차 증류수 등 3종류로 하여 3회 원심 수세하여 준비하였고, 세척과정을 거치지 않은 배양액을 각각 개발된 면역크로마토그래피에 200씩 분주하였다. 또한 면역 크로마토그래피의 특이성을 확인하기 위해 L. monocytogenes ATCC 19115와 다른 병원성미생물인 Salmonella typhimurium ATCC 13311, Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus cereus ATCC 40138, Staphylococcus aureus ATCC 14458을 면역크로마토그래피법으로 분석하여 교차반응성을 확인하였으며 검출한계를 측정하기 위해 L. monocytogenes 배양액을 10진 단계희석법을 이용하여 cell/mL로 희석하고 각 희석배수별 배양액을 200 씩 취해 면 역 크로마토그래 피 에 적 용하였다.
- 4)로 5배 희석하여 conjugate pa에 뿌린 후 3TC에서 30분간 건조 후 실험에 사용하였다. 마지막으로 실험의 결과가 나타나는 NC membranee test line과 control line을 앞서 생산된 단크론성 항체와 anti-mouse IgG로 각각 처리하여 370에서 30분간 건조 후 사용하였다. Absorbent pad 는 다른 처리 없이 바로 사용하여 면역크로마토그래피를 개발하였다.
- monocytogenes를 신속하게 분석할 수 있는 면역 크로마토그래피 법을 개발하고자 하였다. 먼저 L monocytogenes 에 대한 단크론성 항체(FKLM-3B12-37)를 개발하여 직경 40nm 로 제작된 colloidal gold와 합성한 후 conjugate pad에 처리하였고 nitrocellulose membrane 상의 test line과 control line에 단크론성 항체와 anti-mouse IgG를 각각 처리하여 면역크로마토그래피법을 개발하였다. 개발된 면역크로마토그래피 법의 검출한계는 10, cell/mL 수준까지 검줄이 가능했으며 다른 식중독 세균과는 교차반응이 없는 것으로 나타났다.
- 구성되어 있다. 먼저 sample pad는 1% BSA, 0.5% Tween 20, 5% sucrose, 5% dextrane, 0.05% sodium azide가 첨가된 50 mM borate buflfer(pH 7.4)에 30분간 남궜다가 꺼내 어 6(TC에 1시간 동안 건조시켜 사용하였다. Conjugate pad는 colloidal gold-antibody conjugate 용액을 BSA, sucrose가 각각 1%씩 포함된 20 mM borate buffer(pH 7.
- 교반 후 10% bovine serum albumin(BSA)용액을 최종 농도가 1%가 되도록 첨가한 후 다시 실온에서 교반하면서 30분 동안 반응시켰다. 반웅 후 10, 000rpm에서 15분간 원심분리하여 상충액을 제거하고 pellet을 2mM borate buflfer(pH 7.2) lOmL로 재부유한 후 상기 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하는 과정을 3회 반복 실시하였다. 최종 원심분리 후 BSA가 1%첨가된 2mM borate bufifer(pH 7.
- 각각의 E-tube에 단크론성 항체 용액을 0, 10, 20, 30-150 gL< 넣고 2mM borax but로 각 E- tube의 volume- 1150로 맞춘 후 교반하여 5분간 방치하였다. 시간이 경과 후 10%(w/v) NaCl 용액을 각 E-tube에 50gL씩 넣어 교반하고 1분 후 흡광도를 540 nm에서 관찰하여 colloidal gold 를 안정화시키는 항체의 량을 측정하였다(14).
- 즉, L. monocytogenes 배양액에 대하여 세척과정 없이 바로 면역크로마토그래피에 적용이 가능한지, 세척이 필요하다면 면역 크로마토그래피에 가장 영향을 적게 미치는 세척용액의 종류를 선택하는 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, L.
- 항체 역가가 높은 마우스를 이용하여 세포융합을 실시한 후 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma(FKLM-3B12-37)를 확보하였다. FKLM-3B12-17 hybridoma로부터 생산된 항체를 대량 생산하였고, 그 특성을 Western blot으로 확인하였다.
- 높은 역가를 가지는 마우스의 비장세포와 myeloma ceIl(V653)을 Kohler 등(12)의 방법에 따라 융합을 실시하였고, Mckeam 등(13)의 무한대 희석법으로 cloning한 후 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma를 개발하였다. 확보된 hybridoma 를 대량 배양한 후 마우스의 복강에 이식하여 1주일 후 복수액을 생산하였고, 생산된 복수액을 ammonium sulfate 침전법으로 1 차 정제한 후 protein G agrose(Bioprogen, Daejeon, Korea)로 2차 정제한 것을 PBS에 3일 동안 투석하였으며, 동결건조 시킨 후 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 그러나 면역크로마토그래피법에서는 colloidal gold를 marker로 사용하고 있다. 먼저 직경 40nm의 colloidal gold 용액을 Frens(15)의 방법으로 본 연구실에서 직접 준비하였다. Colloidal gold와 항체를 결합시키기에 앞서 colloidal gold를 안정화 시키는 항체의 량을 결정하였다.
이론/모형
- stomach하였다. Stomach한 각 시료의 상충액을 1 mL 취하여 3회 원심수세하고 최종 볼륨을 200 [iL 조정 한 후 면역크로마토그래피법에 적용하였다. 또한 각각의 stomach한 시료를 37(2에서 24시간 동안 배양한 후 각 배양 상등액을 1 mL취하여 3회 원심 수세하고 최종볼륨을 200 l 조정한 후 면역 크로마토그래피법에 적용하였다.
- Stomach한 각 시료의 상충액을 1 mL 취하여 3회 원심수세하고 최종 볼륨을 200 [iL 조정 한 후 면역크로마토그래피법에 적용하였다. 또한 각각의 stomach한 시료를 37(2에서 24시간 동안 배양한 후 각 배양 상등액을 1 mL취하여 3회 원심 수세하고 최종볼륨을 200 l 조정한 후 면역 크로마토그래피법에 적용하였다.
- 동량 혼합한 유화액으로 2회 추가 접종을 실시하고, 세포융합 3일 전에 2배량의 면역원만을 복강 내 주사하여 최종 면역하였다. 최종 면역 후 항체 생성여부를 확인하기 위하여 마우스의 꼬리정맥에서 혈청을 채취하여 간접 비경쟁 효소 면역분석법 (indirect non-competitive ELISA}을 실시하여 항체의 역가를 측정하였다. 높은 역가를 가지는 마우스의 비장세포와 myeloma ceIl(V653)을 Kohler 등(12)의 방법에 따라 융합을 실시하였고, Mckeam 등(13)의 무한대 희석법으로 cloning한 후 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma를 개발하였다.
성능/효과
- 먼저 L monocytogenes 에 대한 단크론성 항체(FKLM-3B12-37)를 개발하여 직경 40nm 로 제작된 colloidal gold와 합성한 후 conjugate pad에 처리하였고 nitrocellulose membrane 상의 test line과 control line에 단크론성 항체와 anti-mouse IgG를 각각 처리하여 면역크로마토그래피법을 개발하였다. 개발된 면역크로마토그래피 법의 검출한계는 10, cell/mL 수준까지 검줄이 가능했으며 다른 식중독 세균과는 교차반응이 없는 것으로 나타났다. 임으로 오염시킨 식품시료의 경우증균과정 없이 10“ ceW25g까지 바로 분석하는데 어려움이 있으며 24시간의 증균과정을 거친 후에는 10’ cell/25g까지 검출할 수 있었다.
- 1 M Tris- HC1, 3차 증류수, 마지막으로 LEB를 사용하여 면역 크로마토그래피에 적용하였다. 그 결과 3차 증류수의 경우 음성과 양성 시료 모두에서 control과 test line에 적색선이 형성되지 않았고, LEB배지의 경우 양성, 음성시료 모두 test line에 선이 생성되어 분석하는데 있어 부적합한 것으로 판단되었다. 반면에 PBS와 Tris-HCl 용액은 양성시료에서 control과 test line에 적색선이 형성되었고 음성 시료에서는 control line에만 적색선이 형성되어 면역크로마토그래피에 사용이 적합한 용액으로 확인되었다.
- 이와 같은 결과로 볼 때 일반적으로 시료 속에 오염되어 있는 균수의 경우가 iVcell 이하이며, 특히 소고기시료의 경우 시료에 고정되어 분리되지 않아 측정할 수 없을 가능성이 높을 것으로 사료된다. 따라서 개발된 면역 크로마토그래피로 식품 속의 L. mcytogenes를 검출하기 위해서는 24시간 이상의 증균 과정이 필요한 것으로 나타났다.
- 5). 따라서 개발된 면역크로마토그래 피는 Z. monocytogenes6^ 대해서만 특이하게 반응하는 것으로 확 인되었다. 또한 10진 단계희석으로 L.
- 일반적으로 육류를 비롯한 식품 시료의 경우 monocytogenes 뿐만 아니라 다른 식중독 균에 오염되어 있을 가능성이 높다. 따라서 다른 식중독균과의 교차반응을 확인한 결과 L. monocytogenes 대해서는 test와 control line에 선명한 적색선을 확인할 수 있었 으나, E. coli 와 S. typhimurium에는 control line에만 적색선이 형 성되어 교차반응이 없는 것으로 확인되었다. 그러나 B.
- monocytogenes6^ 대해서만 특이하게 반응하는 것으로 확 인되었다. 또한 10진 단계희석으로 L. monocytogenese 108~10 cell/mL로 희석하여 면역크로마토그래피에 적용한 결과 검출한계는 10celVmL 수준이였다(Fig. 6). 현재 개발되어 사용되고 있는 효소면역분석법의 평균 검출한계가 1 cell/mL이므로 본 연구에서 개발된 면역크로마토그래피의 민감도는 현재 시판되고 있는 키트와 비슷한 수준으로 확인되었다(17).
- 7)의 항체를 첨가하여 실시하였다. 또한, 항체와 colloidal gold의 합성 여부를 확인하기 위해 항체, colloidal gold 용액, 그리고 colloidal gold-antibody con- jugation을 fluorescence spectroscopy로 확인한 결과 항체만 존재하는 용액에서는 250-320 nm 사이에서 피크가 발생하였고 colloidal gold용액에는 480-600nm 사이에서, 마지막으로 colloidal gold- antibody conjugation에서는 250-320 nm A}0], 480~600nm 모두에서 피크가 발생하여 항체와 gold입자가 결합된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 그 결과 3차 증류수의 경우 음성과 양성 시료 모두에서 control과 test line에 적색선이 형성되지 않았고, LEB배지의 경우 양성, 음성시료 모두 test line에 선이 생성되어 분석하는데 있어 부적합한 것으로 판단되었다. 반면에 PBS와 Tris-HCl 용액은 양성시료에서 control과 test line에 적색선이 형성되었고 음성 시료에서는 control line에만 적색선이 형성되어 면역크로마토그래피에 사용이 적합한 용액으로 확인되었다. 그러나 적색선 의 색 강도가 PBS용액을 처리한 면역크로마토그래피에서 더 선 명하였기 때문에 PBS를 최적 전개용매로 선택하였다(Fig.
- monocytogenes를 10s cell, 106 cell, Iff1 cell로 임의로 오염시켜 앞서 설명한 방법과 동일하게 균을 배양한 후 면역크로마토그래피에 적용한 결과는 Table 1 과 같다. 배양하지 않고 바로 면역크로마토그래피에 적용한 경우 상추 시료에 L. monocytogenes를 lO'cell 오염시킨 시료에서만 검출되었으나 24시간 증균한 후 면역크로마토그래피에 적용한 경우는 모두 양성으로 검출이 되었다. 이와 같은 결과로 볼 때 일반적으로 시료 속에 오염되어 있는 균수의 경우가 iVcell 이하이며, 특히 소고기시료의 경우 시료에 고정되어 분리되지 않아 측정할 수 없을 가능성이 높을 것으로 사료된다.
- 임으로 오염시킨 식품시료의 경우증균과정 없이 10“ ceW25g까지 바로 분석하는데 어려움이 있으며 24시간의 증균과정을 거친 후에는 10’ cell/25g까지 검출할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 면역크로마토그래피법은 24시간의 증균 만으로 식품에 오염되어있는 L. monocytogenes를 검출할 수 있는 것으로 사료되었고, 기존의 식중독균 진단방법에 비해 신속하고 간편하게 그 결과를 확인할 수 있었다.
- 그러므로 충분한 항체의 의해 안정화된 colloid gold용액의 경우 10% NaCl을 첨가하였을 때 적색이 유지되지만 안정화되지 않은 경우에는 암청색으로 변하게 된다. 앞서 설명한 바와 같이 10% NaCl 을 이용하여 colloidal gold를 안정화 시키는 항체의 양을 측정한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 anti-Listeria MAb 항체는 colloidal gold I mL당 7 이상 첨가하였을 때 적색을 유지하여 colloidal gold를 안정화 시키는 것으로 나타났다. 그러나 7 의 항체량은 합성 시 colloidal gold의 응집현상을 나타내는 경우가 생겨 실제 합성에서는 colloidal gold 1 mL당 7.
- 개발된 면역크로마토그래피 법의 검출한계는 10, cell/mL 수준까지 검줄이 가능했으며 다른 식중독 세균과는 교차반응이 없는 것으로 나타났다. 임으로 오염시킨 식품시료의 경우증균과정 없이 10“ ceW25g까지 바로 분석하는데 어려움이 있으며 24시간의 증균과정을 거친 후에는 10’ cell/25g까지 검출할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 면역크로마토그래피법은 24시간의 증균 만으로 식품에 오염되어있는 L.
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