발효식품에 다량 함유되어 있는 NaCl이 ethyl carbamate 전구체인 N-carbamyl 화합물과 에탄올과의 화학반응에 영향을 주는 것으로 확인되었다. N-carbamyl 화합물과 에탄올의 화학반응 속도를 비교한 결과, carbamyl phosphate, urea, 시트룰린 순서로 ethyl carbamate의 생성 속도가 감소되었다. 또한 NaCl은 ethyl carbamate의 주요한 전구체로 추정되는 carbamyl phosphate 또는 시트룰린과 에탄올의 화학반응을 억제한 반면에, urea와 에탄올과의 반응은 오히려 촉진하였다. 앞으로 발효식품에서 ethyl carbamate 및 그 전구체의 생화학적 생성 기전뿐만 아니라 전구체간의 화학반응에 대한 NaCl의 역할에 대한 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
발효식품에 다량 함유되어 있는 NaCl이 ethyl carbamate 전구체인 N-carbamyl 화합물과 에탄올과의 화학반응에 영향을 주는 것으로 확인되었다. N-carbamyl 화합물과 에탄올의 화학반응 속도를 비교한 결과, carbamyl phosphate, urea, 시트룰린 순서로 ethyl carbamate의 생성 속도가 감소되었다. 또한 NaCl은 ethyl carbamate의 주요한 전구체로 추정되는 carbamyl phosphate 또는 시트룰린과 에탄올의 화학반응을 억제한 반면에, urea와 에탄올과의 반응은 오히려 촉진하였다. 앞으로 발효식품에서 ethyl carbamate 및 그 전구체의 생화학적 생성 기전뿐만 아니라 전구체간의 화학반응에 대한 NaCl의 역할에 대한 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
Ethyl carbamate, which is also known as a possible human carcinogen, is formed by ethanolysis of N-carbamyl compounds such as carbamyl phosphate, urea, or citrulline. NaCl that is highly present in fermented foods was suspected to have an influence on ethyl carbamate formation. This study was design...
Ethyl carbamate, which is also known as a possible human carcinogen, is formed by ethanolysis of N-carbamyl compounds such as carbamyl phosphate, urea, or citrulline. NaCl that is highly present in fermented foods was suspected to have an influence on ethyl carbamate formation. This study was designed to determine the effect of NaCl on the chemical reactions upon incubation of ethanol with the N-carbamyl compound in a 25% NaCl solution or in the absence of NaCl, and to find a possible association with the formation of ethyl carbamate. While the amount of ethyl carbamate formed in a urea solution with the addition of NaCl was increased up to 26%, the amount formed with citrulline or carbamyl phosphate in the presence of NaCl was decreased up to 30% and 40%, respectively. This indicates that NaCl should be considered as a potential factor influencing the rate of ethyl carbamate formation from its precursors.
Ethyl carbamate, which is also known as a possible human carcinogen, is formed by ethanolysis of N-carbamyl compounds such as carbamyl phosphate, urea, or citrulline. NaCl that is highly present in fermented foods was suspected to have an influence on ethyl carbamate formation. This study was designed to determine the effect of NaCl on the chemical reactions upon incubation of ethanol with the N-carbamyl compound in a 25% NaCl solution or in the absence of NaCl, and to find a possible association with the formation of ethyl carbamate. While the amount of ethyl carbamate formed in a urea solution with the addition of NaCl was increased up to 26%, the amount formed with citrulline or carbamyl phosphate in the presence of NaCl was decreased up to 30% and 40%, respectively. This indicates that NaCl should be considered as a potential factor influencing the rate of ethyl carbamate formation from its precursors.
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문제 정의
하지만 간장, 된장, 김치, 치즈 등의 발효식품에 다량 함유되어 있는 NaCl이 etliyl carbamate 전구체들의 화학 반응 속도에 미치는 영향에 대한 보고는 아직까지 없다. 따라서 본 연구는 발효식품에 다량 함유되어 있는 NaCl이 ethyl carbamate 전구체인 Mcarbamyl 화합물과 에탄올과의 .화학반응 속도에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 발효식품에 높게 함유되어 NaCI이 ethyl carbamate 전구체간의 화학반응 속도에 영향을 미치는지 확인하는데 목적을 두었다. 앞으로 발효과정에서 NaCI이 전구체간의 화학반응을 억제하는 기전과 발효 미생물의 생육 및 미생물 효소의 활성에 미치는 영향에 대한 연구가 계속 진행되어 ethyl carbamate 생성에 대한 Na(기의 역할이 총체적으로 규명되어야 할 것이다.
따라서 본 연구는 발효식품에 다량 함유되어 있는 NaCl이 ethyl carbamate 전구체인 Mcarbamyl 화합물과 에탄올과의 .화학반응 속도에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
가설 설정
6 Methanol were stopped at third day because carbamyl phosphate was known to be very reactive to ethanol. Data are expressed as means (μg) standard deviation (n = 3).
3)The mixtures were incubciled in nanopure water
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제안 방법
2와 같다. N-carbamyl 화합물과 에탄올과의 화학반응 속도에 NaCl이 영향을 미치는지 확인해 보려고 각 반응기질별로 NaCl을 첨가한 것과 첨가하지 않은 반응액을 만들었다. NaCl 농도는 전통간장의 염도인 22-30%(18) 를 기준으로 하여 25%로 제조되었다.
각 Mcarbamyl 반응액에 에탄올 용액을 첨가하는 시점을 반응 시작으로 하였다. 각 혼합액은 항온기(2?C)에서 교반되면서 반응이 진행되었다.
Ethyl cai'bamate 농도 계산은 Pierce 등 (19)이 사용한 내부 표준 물질 방법을 기초로 하였다. 농도비 (ethyl carbamate/propyl carbamate)를 가로축으로 하고 피크 면적비(ethyl carbamate/propyl carbamate)를 세로축으로 하는 표준 곡선을 작성한 후, 간장 시료의 피크 면적비를 표준선에 내삽함으로써 ethyl carbamate 농도를 계산하였다.
각 혼합액은 항온기(2?C)에서 교반되면서 반응이 진행되었다. 반응 시작 후 3일과 20일에 ethyl carbamate를 분석하여 각 반응기질의 상대적인 반응성 및 Mcarbamyl 화합물과 에탄올의 화학반응에 대한 NaCl의 영향을 비교하였다. 한편, carbamyl phosphate는 다른 화합물에 비교하여 반응성이 매우 높기 때문에 반응 시작 3일만에 분석되었다.
각 기질의 순수한 화학반응 속도을 비교하기 위하여 모든 반응기질의 농도를 동일하게 하였다. 반응 용매인 물에 대한 각 기질의 용해도를 비교하여 용해도가 가장 낮은 시트룰린을 기준으로 모든 기질 반응액을 0.6M 농도로 정하였다.
대상 데이터
Louis, MO, USA)에서 각각 구입되었다. Aluminum oxide(activated, neuti'al, 5-200 μm) 는 AC ROS organics(Geel, Belgium) 제품을 사용하였다. Kim 등(5>의방법에 따라 ethyl carbamate 함량을 분석하였다.
구입하였다. Ethyl carbamate와 〃-propyl carbamate는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA)와 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입되었다. Aluminum oxide(activated, neuti'al, 5-200 μm) 는 AC ROS organics(Geel, Belgium) 제품을 사용하였다.
NaCl 농도는 전통간장의 염도인 22-30%(18) 를 기준으로 하여 25%로 제조되었다. 발효식품에서 ethyl carbamate 전구체로 알려져 있는 N-carbamyl 화합물인 시트룰린, urea, carbamyl phosphate를 반응기질로 하였다. 한편 carbamyl 화합물이 아닌 아르기닌이 반옹 기질의 대조군으로 사용되었다.
5 mL까지 농축하고 gas chromatography-mass specti'ometiy-selected ion mode(GC-MS-SIM)에서 ethyl carbamate를 정 량하였다. 분석 조건은 DB WAX(30 m x 0.25 mm x 0.25 gm, J&W Scientific Co., Folsom, CA, USA) 칼럼을 장착한 Hewlett Packard 6890 II GC와 Hewlett Packard 5973 MSD를 사용하였다. 오븐 온도는 6(TC에서 a/min으로 135。(2까지 가열시킨 후 10℃/min 속도로 22CTC까지 가열하여 4분간 유지시켰으며, 주입구 온도는 210℃, 검출구 온도는 2201로, 하였다.
발효식품에서 ethyl carbamate 전구체로 알려져 있는 N-carbamyl 화합물인 시트룰린, urea, carbamyl phosphate를 반응기질로 하였다. 한편 carbamyl 화합물이 아닌 아르기닌이 반옹 기질의 대조군으로 사용되었다. 각 기질의 순수한 화학반응 속도을 비교하기 위하여 모든 반응기질의 농도를 동일하게 하였다.
이론/모형
먼저 scan mode로 표준 용액과 간장의 총이온 크로마토그램을 얻은 후 분리된 ethyl carbamate 피크의 머무름 시간과 mass fragmentationpattern으로 성분을 확인하고, 선택이온 측정법 (GC-MS-SIM)으로 m/z 62에서 분석하였다. Ethyl cai'bamate 농도 계산은 Pierce 등 (19)이 사용한 내부 표준 물질 방법을 기초로 하였다. 농도비 (ethyl carbamate/propyl carbamate)를 가로축으로 하고 피크 면적비(ethyl carbamate/propyl carbamate)를 세로축으로 하는 표준 곡선을 작성한 후, 간장 시료의 피크 면적비를 표준선에 내삽함으로써 ethyl carbamate 농도를 계산하였다.
Aluminum oxide(activated, neuti'al, 5-200 μm) 는 AC ROS organics(Geel, Belgium) 제품을 사용하였다. Kim 등(5>의방법에 따라 ethyl carbamate 함량을 분석하였다. 불활성화시킨 aluminum oxide(activated, neutral, 5-200 μm) 10 g, 무수황산나트륨 40 g을 순차적으로 유리칼럼 (3x5 cm)에 채우고, propyl carbam- ate를 내부 표준물질로 첨가한 간장 15 g에 700℃(2에서 16시간 이상 구운 Celite 15g과 섞어 맨 위층에 충진하였다.
Splitless 방법으로 시료를 주입하고, 70eV의 에너지로 전자 이온화방법을 사용할 때의 이온화원의 온도는 15(TC였다. 먼저 scan mode로 표준 용액과 간장의 총이온 크로마토그램을 얻은 후 분리된 ethyl carbamate 피크의 머무름 시간과 mass fragmentationpattern으로 성분을 확인하고, 선택이온 측정법 (GC-MS-SIM)으로 m/z 62에서 분석하였다. Ethyl cai'bamate 농도 계산은 Pierce 등 (19)이 사용한 내부 표준 물질 방법을 기초로 하였다.
성능/효과
3에 나타내었다. 15분대에서 검출된 피크가 질량 스펙트럼에서 ethyl carbamate의 특징적인 이온인 m/z 89, 74, 62을 가지고 있어서 성분이 확인되었다. 따라서 ethyl carbamate와 내부표준물질인 n- propyl carbamate에서 감도가 가장 높은 m/z 62의 선택적 이온 모드(selected ion mode)에서 얻은 크로마토그램의 피크 면적비와 농도비를 이용하여 시료내 ethyl carbamate가 정량되었다.
2)The reactions of 0.6 M carbamyl phosphate with 0.6 Methanol were stopped at third day because carbamyl phosphate was known to be very reactive to ethanol. Data are expressed as means (μg) standard deviation (n = 3).
대조기질로 사용된 아르기닌은 carbamyl기가 없는 화합물이기 때문에 20일까지 ethyl carbamate가 전혀 생성되지 않았다. 각 A-carbamyl 화합물과 에탄올간의 화학반응 속도를 비교해 보면, carbamyl phosphate, urea, 시트룰린 순서로 감소되었다. Ough 등(2)은 격렬한 조건에서 urea 또는 시트룰린과 에탄올을 반응시킨 후 ethyl carbamate 생성량을 비교한 결과, urea가 시트 룰린보다 반응성이 더 높다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다
15분대에서 검출된 피크가 질량 스펙트럼에서 ethyl carbamate의 특징적인 이온인 m/z 89, 74, 62을 가지고 있어서 성분이 확인되었다. 따라서 ethyl carbamate와 내부표준물질인 n- propyl carbamate에서 감도가 가장 높은 m/z 62의 선택적 이온 모드(selected ion mode)에서 얻은 크로마토그램의 피크 면적비와 농도비를 이용하여 시료내 ethyl carbamate가 정량되었다.
생성된 ethyl carbamate를 기준으로 각 반응 기질액의 화학 반 응에 대한 NaCl의 영향을 살펴보면, 시트룰린 반응액과 carbamyl phosphate 반응액은 NaCi에 의해 ethyl carbamate 생성량이 각각 34, 40%씩 감소되었으며 urea 반응액은 오히려 26% 증가되었다 (Fig. 4). 이것은 시트룰린과 carbamyl phosphate는 NaCl에 의해 에탄올과의 반응이 저해된 반면에, urea는 NaCl에 의해 에탄올과 의 반응이 오히려 촉진되었음을 의미한다.
후속연구
본 연구에서는 발효식품에 높게 함유되어 NaCI이 ethyl carbamate 전구체간의 화학반응 속도에 영향을 미치는지 확인하는데 목적을 두었다. 앞으로 발효과정에서 NaCI이 전구체간의 화학반응을 억제하는 기전과 발효 미생물의 생육 및 미생물 효소의 활성에 미치는 영향에 대한 연구가 계속 진행되어 ethyl carbamate 생성에 대한 Na(기의 역할이 총체적으로 규명되어야 할 것이다.
한편, 90일 숙성된 간장의 경우 ethyl carbamate 농도와 NaCI 함량(15-37%, w/v) 사이에 연관성이 없다고 보고되었다(4). 하지만 다양한 NaCI 농도에서 간장 숙성 중 ethyl carbamate 전구체의 농도를 모니터링한다면 전구체 사이의 화학 반응 속도에 대한 NaCl의 역할이 확인될 수 있을 것으로 사료된다. 간장 발효에 중요한 역할을 하는 Bacillus subtilis JI와 Zygosaccharomyces rniixii YI01의 아르기닌 대사기전에 관한 연구에서(20), 전구 체로는 urea보다는 시트룰린과 carbamyl phosphate가 그리고 대시• 효소의 활성이 높은 B.
참고문헌 (20)
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