선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 14)그러나현재 이러한 내성균에 적절히 사용할 수 있는 항생물질이 부족한 실정이므로 이 균주들에 효과적으로 작용하는 항생물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. 본 연구에서는 MRSA, VISA 및 V矢E에 대한 항생물질 개발을 목표로 곤충유래 생익인 백강잠으로부터 이들 내성균에 효과적인 항균활성 물질을 분리 . 정제하였으며 몇 가지 특성을 확인하였기에 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 MRSA, VISA 및 V矢E에 대한 항생물질 개발을 목표로 곤충유래 생익인 백강잠으로부터 이들 내성균에 효과적인 항균활성 물질을 분리 . 정제하였으며 몇 가지 특성을 확인하였기에 보고하고자 한다.
- 항생제 내성균인 MRSA와 VRE에 대한 항생물질 개발을 목표로 곤충 유래의 생약인 백강잠으로부터 항균활성을 검출하였다. 백강잠 추출물을 C18 역상 칼럼 크로마토그래피 및 C18 역상 HPLC와 carbon-500 HPLC를 시행하여 순수하게 정제된 물질을 분리하였으며 이 항균물질을 bocorpsine 명명하였다.
제안 방법
- 활성량이 많은 분획으로부터 활성성분을 분리 . 정제하기 위하여 C18 역상 HPLC를 실시한 결고" CH3CN 농도 약 20-30% 사이에서 2개의 활성 피크를 얻었다. 비교적 강한 비활성을 나타내는 분획을 다시 C18 역상 HPLC로 분석하여 활성을 가진 단일피크를 얻을 수 있었다(Fig.
- 5)에 녹인 후 단백질분해효소인 트립신 1 此을 가한 다음 37℃에서 12시간 반응시켰다. 10 |4/의 반응액을 취해 10 mM phosphate buffer0!] 계열 희석한 후 항균활성의 유무를 확인하였다. 대조군으로는 트립신을넣지 않고 반응시킨 최종 정제품을 이용하였다.
- 한편, MIC는 CLSKClinical and Laboratory Standards Institute)의 미량액체배지 희석법에 의하여 조제한 균주와 혼합하여 35℃에서 20시간 배양한 후, 650 nm 에서의 흡광도를 측정해 증식을 저해하는 최소농도로 결정하였다.⑸ 또한, 대상균주를 도말한 평판배지에 적당량의 시료를 묻힌 paper disc를 올려놓고 37℃에서 20시간 배양하여 생기는 투명환의 크기를 계측하여 항균활성을 검정하였다.
- 용출분획을 동결 . 건조하여 적당량의 10 mM phosphate buffer 에 용해한 후, 상기방법으로 항균활성을 검정하였다. 활성이 확인된 분획으로부터 활성 물질을 순수하게 분리하기 위해 YMC- Pack ODS-A 칼럼 (S-5, 120 A, 250x4.
- 그 밖의 시약은 특급 또는 HPLC용 등급을 사용하였다. 기기는 Waters Breeze HPLC(Waters, MA, USA), Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, CA, USA), SPECTRONIC 3000 ARRAY (Milton Roi, NY, USA) 흡광광도계, Voyager DESTR(PerSeptive Biosystems, MA, U.S.A.) 질량분석기 및 ABI 아미노산 서열 자동분석기를 사용하였다.
- 질량분석 스펙트럼은 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF) 방법에 의해 분석하였다. 단백질 함량은 BCA Protein assay kit(Pierce, IL, USA)를 사용하여 정량분석 하였으며, 활성물질의 구조를 확인하기 위해 아미노 말단의 아미노산 서열을 분석하였다. 질량분석 및 아미노산 서열 자동분석은 한국 기초과학지원연구소에서 수행하였다.
- 10 |4/의 반응액을 취해 10 mM phosphate buffer0!] 계열 희석한 후 항균활성의 유무를 확인하였다. 대조군으로는 트립신을넣지 않고 반응시킨 최종 정제품을 이용하였다.
- 백강잠 추출물을 C18 역상 칼럼 크로마토그래피 및 C18 역상 HPLC와 carbon-500 HPLC를 시행하여 순수하게 정제된 물질을 분리하였으며 이 항균물질을 bocorpsine 명명하였다. 이물질은 그람 양성균 뿐만이 아니라 그람 음성균에도 매우 강한 활성을 나타내었으며, 특히 VISA, MRSA 및 VRE에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다.
- 6 mm: YMC, Kyoto, Japan)을 이용하여 역상 HPLC를 실행하였다. 용출분획의 흡광도 패턴을 확인하기 위해 UV 검출기를 사용하였다. 먼저 활성분획의 건조시료를 증류수에 용해한 후 HPLC에 주입하고 0.
- 05% TFA 수용액으로 용출하면서 220 nm와 285 nm에서의 UV 흡광도를 측정하였다. 용출분획의 흡광도가 0.2 이상 올라가지 않고 유지되면 단계적으로 0.05% TFA 10% CHgN으로 용출하였으며, 마지막으로 0.05% TFA 40% CH3CN을 사용하여 용출하였다. 용출분획을 동결 .
- 05% TFA 수용액에 용해한 후 ODS-AM AM12 S50 수지를 충진시킨 칼럼을 이용하여 크로마토그래피를 실시하였다. 용출용매는 0.05% TFA 수용액, 0.05% TFA 10% CH3CN 및 0.05% TEA 40% CH3CN을 사용하였으며 우선 0.05% TFA 수용액으로 용출하면서 220 nm와 285 nm에서의 UV 흡광도를 측정하였다. 용출분획의 흡광도가 0.
- 1). 이 단일피크의 순도는 TSK gel Carbon-500 칼럼을이용한 HPLC 분석으로 확인하였으며 물질을 bocorpsin으로 명명하였다(자료 미제시). 일반적으로 용출되는 CH3CN의 농도는유기분자의 소수성 또는 분자량에 비례하므로 활성물질은 비교적 분자량이 큰 물질로 추정하였다.
- 용출분획의 건조시료에 대해 활성을 확인한 후 CH3CN의 농도가 15%로부터 30%까지 60분 동안 증가되도록 용출하여 활성을 가진 피크를 얻을 수 있었다. 이 피크의 순도를 확인하기 위해 TSK gel Carbon-500 칼럼 (150* 4.6 mm: Ibsoh, Tokyo, Japan)을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 분석조건은 CH&N의 농도를 10%로부터 40%까지 80분 동안 증가시키는 linear gradient 방법을 사용하였다.
- 정제하기 위하여 0.05% TFA 수용액에 용해한 후 ODS-AM AM12 S50 수지를 충진시킨 칼럼을 이용하여 크로마토그래피를 실시하였다. 용출용매는 0.
- 단백질 함량은 BCA Protein assay kit(Pierce, IL, USA)를 사용하여 정량분석 하였으며, 활성물질의 구조를 확인하기 위해 아미노 말단의 아미노산 서열을 분석하였다. 질량분석 및 아미노산 서열 자동분석은 한국 기초과학지원연구소에서 수행하였다. 한편, 활성성분이 펩타이드성 물질임을 확인하기 위해 100 μg의최종 정제품을 100 以의 2M urea(pH 7.
- 여기에 적당량의 시료를 10|jZ의 10 mM phosphate buffer 에 계열 희석하여 첨가한 후, 37℃에서 5시간 배양하여 650 nm 에서의 흡광도를 측정해 균의 증식을 결정하였다. 항균활성의 정량은 시료 대신 0.05% BSA를 포함하는 50 mM phoshpate buffer(pH 6.0)만 첨가한 경우의 균의 증식을 100%로 해 그 증식저해 활성을 계산하였다. 한편, MIC는 CLSKClinical and Laboratory Standards Institute)의 미량액체배지 희석법에 의하여 조제한 균주와 혼합하여 35℃에서 20시간 배양한 후, 650 nm 에서의 흡광도를 측정해 증식을 저해하는 최소농도로 결정하였다.
- 활성물질을 증류수에 녹인 후 UV 흡수 스펙트럼을 분석하였다. 질량분석 스펙트럼은 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF) 방법에 의해 분석하였다.
- 건조하여 적당량의 10 mM phosphate buffer 에 용해한 후, 상기방법으로 항균활성을 검정하였다. 활성이 확인된 분획으로부터 활성 물질을 순수하게 분리하기 위해 YMC- Pack ODS-A 칼럼 (S-5, 120 A, 250x4.6 mm: YMC, Kyoto, Japan)을 이용하여 역상 HPLC를 실행하였다. 용출분획의 흡광도 패턴을 확인하기 위해 UV 검출기를 사용하였다.
대상 데이터
- aureus CCARM 3501(MRSA) 균주는 항생제 내성 균주 은행 (Culture Collection of Antibiotics Resistant Microbes, CCARM)에서 구입하여 사용하였다. Esherichiacoli K-12 594 (Stif 균주는 동경대학의 Natori Shunji 교수로부터 분양 받았으며 그 밖의 항생제 감수성 균주인 Bacillus subtilis KCTC 3069, Micrococcus luteus KCTC 1056, Staphylococcus aureus KCTC 1928, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004, E. coli 0157 H7 993, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Shigella flexneri KCTC 2008 및 Candida albicans KCTC 1940 등은 한국 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 구입하여 사용하였다.
- 8 曲/n僵 나타내는 균주를 선발하여 사용하였다. S. aureus CCARM 3501(MRSA) 균주는 항생제 내성 균주 은행 (Culture Collection of Antibiotics Resistant Microbes, CCARM)에서 구입하여 사용하였다. Esherichiacoli K-12 594 (Stif 균주는 동경대학의 Natori Shunji 교수로부터 분양 받았으며 그 밖의 항생제 감수성 균주인 Bacillus subtilis KCTC 3069, Micrococcus luteus KCTC 1056, Staphylococcus aureus KCTC 1928, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004, E.
- 경동시장에서 구입한 백강잠(B. Corpus') 약 100 g을 분쇄하여트립신 저해제(100KIU/mZ) 존재 하에 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) 수용액 U에 넣고 실온에서 12시간 동안 추출하였다. 추출물을 30분 동안 35,000 g로 초원심 분리하여 상등액을 취하고 Millipore AA 박막(0.
- 시약은 주로 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였으며, Antibiotic medium 3, Bacto-trypton, Y2ast Extract, Bacto-pepton, 그리고 Muller-Hinton Broth 등의 배지는 Difco 사(Detroit, MI, USA)의 제품을 주로 사용하였다. 그 밖의 시약은 특급 또는 HPLC용 등급을 사용하였다.
- 임상에서 분리한 반코마이신 내성 Enterococcus faecium(y'RE') 및 vancomycin intermediate resistant S. as於ws(VISA)는 passage-derived str血ns을 유도하여 반코마이신에 대한 MIC가각각 128 ng/m/, 12.8 曲/n僵 나타내는 균주를 선발하여 사용하였다. S.
이론/모형
- 6 mm: Ibsoh, Tokyo, Japan)을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 분석조건은 CH&N의 농도를 10%로부터 40%까지 80분 동안 증가시키는 linear gradient 방법을 사용하였다.
- 질량분석 스펙트럼은 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF) 방법에 의해 분석하였다. 단백질 함량은 BCA Protein assay kit(Pierce, IL, USA)를 사용하여 정량분석 하였으며, 활성물질의 구조를 확인하기 위해 아미노 말단의 아미노산 서열을 분석하였다.
- 0)만 첨가한 경우의 균의 증식을 100%로 해 그 증식저해 활성을 계산하였다. 한편, MIC는 CLSKClinical and Laboratory Standards Institute)의 미량액체배지 희석법에 의하여 조제한 균주와 혼합하여 35℃에서 20시간 배양한 후, 650 nm 에서의 흡광도를 측정해 증식을 저해하는 최소농도로 결정하였다.⑸ 또한, 대상균주를 도말한 평판배지에 적당량의 시료를 묻힌 paper disc를 올려놓고 37℃에서 20시간 배양하여 생기는 투명환의 크기를 계측하여 항균활성을 검정하였다.
- 항균활성은 주로 Leem 등의 방법°에 따라 liquid growth inhibition assay로 검정하였다. 즉, 대수기의 균주를 3xl08celV m/로 희석하여 130 mM NaCl, 02%(W/V) BSA를 포함하는 10 mM phosphate buffer(pH 6.
성능/효과
- 체액성 방어물질로는 직접 이물질에 치사적으로 작용하는 혈구응집소와 항균 펩타이드 등이 존재한다.9)이러한 물질들은 침입한 세균을 인식하는 방어기구와 Toll pathway 및 IMD pathway를 거쳐 합성이 유도되어 침입한 세균의 세포막에 치사적으로 작용하여 세균을 사멸한다는 것이 밝혀지고 있다.7)최근에는 유용생물자원 확보 및 신기능 생물 소재 개발이라는 산업적, 경제적 측면에서의 중요성 때문에 항생제로의 개발을 목표로 이러한 생체방어물질을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
- 2). BCA 법에 의한 단백질 정량분석결과 정량적으로 검량선을 그릴 수 있었으며 트립신으로 반응시킨 시료는 항균 활성이 소실됨을 확인하였다(자료 미제시). 이상의 결과로부터 bocorpsine 펩타이드성 물질임을 확인할 수 있었다.
- Bocorpsine 그람 양성균 뿐만이 아니라 그람 음성균에도 매우 강한 활성을 나타내며, 특히 항생제 내성균인 MRSA, VISA 및 VRE에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다. 그람 양성균인 B.
- Bocorpsin의 분자량은 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF) 방법에 의해 2295.45임을 확인하였다(Fig. 2). BCA 법에 의한 단백질 정량분석결과 정량적으로 검량선을 그릴 수 있었으며 트립신으로 반응시킨 시료는 항균 활성이 소실됨을 확인하였다(자료 미제시).
- VRE에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다. 그람 양성균인 B. subtilis KCTC 3069, M. luteus KCTC 1056, S. aureus KCTC 1928, P aeruginosa KCTC 2004에 대하여 MIC 값이 각각 3.2, 6.4, 6.4, 12.8 卜ig/m/이었으며 , 그람 음성균인 E. coli K12 594, E. coli 0157 H7 993, K. pneumoniae KCTC 2208, S. flexneri KCTC 2008에 대하여 각각 1.6, 3.2, 6, 4 12.8 瞄同의 MIC 값을 나타내었다. 또한, 진균인 C.
- 임상에서 분리한 VISA 및 VRE는 반코마이신의 대하여 매우 강한 내성을 나타내는 균주이다. 대조군으로 사용한 magainin Ⅱ는 VRE에 대한 MIC가 10 μ以m/을 나타내어 bocorpsin이 magainin Ⅱ에 비해 6배 정도 강한 활성을 나타냄을 알 수 있었다(자료 미제시). Magainin Ⅱ는 아프리카 개구리로부터 보고된 항균 펩타이드로서 곤충유래 펩타이드와 같이 생체빙母를 담당하는 물질로 알려져 있다.
- 백강잠 추출물의 동결건조시료를 C18 역상칼럼 크로마토그래피에 의해 분리한 후 항균활성을 확인한 결과, 0.05% TFA 수용액 및 0.05% TFA 10% CH3CN으로 용출한 분획으로부터는 활성을 검출할 수 없었으나, 0.05% TFA 40% CH3CN으로 용출한분획 2곳에서 강한 활성을 검출하였다. 활성량이 많은 분획으로부터 활성성분을 분리 .
- CH3CN 의 농도를 linear gradient 방법에 의해 0%로부터 30%까지 50 분 동안 증가시켰다. 용출분획의 건조시료에 대해 활성을 확인한 후 CH3CN의 농도가 15%로부터 30%까지 60분 동안 증가되도록 용출하여 활성을 가진 피크를 얻을 수 있었다. 이 피크의 순도를 확인하기 위해 TSK gel Carbon-500 칼럼 (150* 4.
- 백강잠 추출물을 C18 역상 칼럼 크로마토그래피 및 C18 역상 HPLC와 carbon-500 HPLC를 시행하여 순수하게 정제된 물질을 분리하였으며 이 항균물질을 bocorpsine 명명하였다. 이물질은 그람 양성균 뿐만이 아니라 그람 음성균에도 매우 강한 활성을 나타내었으며, 특히 VISA, MRSA 및 VRE에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다. Borcopsin의 분자량은 2295.
- BCA 법에 의한 단백질 정량분석결과 정량적으로 검량선을 그릴 수 있었으며 트립신으로 반응시킨 시료는 항균 활성이 소실됨을 확인하였다(자료 미제시). 이상의 결과로부터 bocorpsine 펩타이드성 물질임을 확인할 수 있었다. 한편, 아미노산 서열분석은 결과를 얻을 수 없었다.
- 본 연구를 통해 백강잠으로부터 분리 . 정제된 펩타이드성 항균물질 bocorpsine 그람 양성균 뿐만이 아니라 그람 음성균에도 매우 강한 활성을 나타내며, 특히 MRSA, VISA 및 VRE에대하여 다른 항균펩타이드에 비해 강한 항균활성을 나타내었다 (자료 미제시). 누에 유충에 백강균이 감염되면 누에 체내에서 생체방어기구가 활성화됨으로써 여러 항균물질이 유도될 것이다.
- 0 μg/mZ에서 그 증식을 저해하였다. 특히 메치실린내성균인 S. aureus CCARM 3501와 반코마이신 내성 S. aureus (VISA)및 E. faecium 균주(VRE)에 대하여 각각 12.8, 3.2, 1.6 μ以m2의 MIC 값을 나타내어 강한 증식저해 활성을 갖는 것을알 수 있었다(IBble I). 임상에서 분리한 VISA 및 VRE는 반코마이신의 대하여 매우 강한 내성을 나타내는 균주이다.
후속연구
- 실제로 지난 수년간 enterococcal vancomycin resistant gene인 vanK, van?> 및 仇mC가 VISA의 내성원인 유전자로 추정되었으며 최근 미국에서 MRSA로부터 분리된 vancomycin 고도내성균주에서 vanA 유전자가 발견되었다.18)이상과 같이, MRSA, VISA 및 VRE에 적절히 사용할 수 있는 항생물질이 부족한 실정이므로 이 균주들에 효과적으로 작용하는 항생물질의 개발이 요구된다. 최근 개발된 내성균 치료용 항생제 Linezolid가 임상에서 많이 사용되고 있는데 이미 Linezolid 내성균의 출현이 보고되었다.
- 한편 에드만 분해에 의한 아미노산 서열자동분석결과로부터 어떤 아미노산도 검출되지 않았으므로 아미노 말단이 수식되어 있을 것으로 예상된다. Borcopsin을 항생물질 개발의 선도물질로 응용하기 위해서는 그 구조 및 활성 메카니즘에 관한 후속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 최근 개발된 내성균 치료용 항생제 Linezolid가 임상에서 많이 사용되고 있는데 이미 Linezolid 내성균의 출현이 보고되었다.助 향후 항생물질의 개발 방향은 기존의 항생제와는 다른 항생기전을 나타냄으로써 내성이 발생하지 않는 항생물질을 개발하는 것이 매우 시급하고 중요하다고 사료된다. 곤충을 비롯하여 고등동물까지 생체방어물질로서 다양하게 존재하는 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)는 주로 병원균의 세포벽에 membrane pore를 형성하거나 이온채널에 길항적으로 작용하여 그 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.