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문제 정의
- 2)순무에 관한 성분연구로는 순무 잎에 포함된 휘발성 isothiocyanate 연구, 순무의 이uco- sinolate 성분의 휘발성 isothiocyanate와 nitrile에 대한 연구,1) 가열 선, 후 순무의 glucosinolate의 함량의 변화, myrosinase 활성, 지질, indole 및 cinnamic acid 유도체의 분리동정에 대하여 보고된 바 있다.7)저자는 강화도 특화작목인 순무로부터 성분분석 및 생리활성 검증을 통하여 순무를 이용한 기능성 식품 개발방안을 모색하고자 이 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 9(06 로부터 구성당은 D-glucopyranose임을 알 수 있었다. 따라서, 화합물 5는 "sitosterol의 C-3의 hydroxyl기에 D- glucopyranose가 0결합하고 있는 화합물인 β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranoside(daucosterol)로 구조 결정하였다.8,9)
- 'H-NMR 스펙트럼에서 δH 5.32(1 H, br. d, J=4.8 Hz, H-6) signal로부터 1개의 olefinic methine을 확인하였고, SH 3.47(1H, m, H-3) signal로부터 oxygenated methine을 확인하였다. 또한 8H 2.
- 이를 EtOAc분획, n-BuOH분획, H:Q 분 획으로 나누었으며, EtOAc분획과 BuOH분획에 대해 silica gel 및 ODS column chromatography를 실시하여 5종의 화합물을 분리 정제하였다. 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT spectrum 및 Mass spectrum 등을 통하여 palmitic acid methyl ester(l), linolenic acid methyl ester(2), linoleic acid methyl ester(3), /^-sitosterol (4), daucoster이(5)으로 구조를 결정하였다.
- 45, acetone-acetonitrile = 5 :1)을 분리 하였다. BRE7(400 mg) 분획에 대하여 silica gel c.c.((|)4-5X 12 cm, n-hexane- EtOAc = 3:l)로 정제하여 BRE7-7[(화합물 2, 52 mg, TLC (Kieselgel 60 F254) Rf =0.55, n-hexane-EtOAc = 1 :1)J을 분리하였다, BRE10(218mg) 분획에 대하여 silica gel c.c.(Φ2.5× 10 cm, n-hexane-EtOAc= 10 : 1)로 정 제 하여 BRE10-1 (화합물 3, 69 mg, TLC(Kieselgel 60 F254) %= 0.5, n-hexane-EtOAc = 3:1)}을 분리 하였다.
- n-BuOH 및 HQ분획을 얻었다. EtOAc분획과 ”-BuOH분획에 대하여 TLC를 이용하여 함유성분을 추정하였으며, silica gel과 ODS cohunn chromatography 를 반복하여 3종의 지질화합물과 2종의 sterol화합물을 분리하였다.
- EtOAc분획에 대하여 silica gel column ch2matogiaphy(ce) (Φ5X22cm, n-hexane-EtOAc =10:1t5:1t3:1t1 :1t CHCl3-MeOH= 10 :1 t7 :1 t 5 : 1 t3 :1 t2 : 1 t 1 :1)를실시하여 18개의 분획물(BRE-1 ~BRE-18)을 얻었다. 이 중에서 BRE-5(1.
- 녹는점은 Fisher-Johnes Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, Miami, USA)로 측정하였으며, EI/MS와 FAB/MS는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. GC는 GC-14B(Shimadzu, Tokyo, Japan)로, GC/MS 는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, UV lamp는 Spectroline(Model ENF-240 C/ F, Spectronics Corporation, New York, USA)을 사용하였으며, 비선광도는 Polarimeter P-1020(JASCO, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- 25 jim, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC로 분석한 각 peak의 최종적인 확인은 GC-MS의 libraiy 분석을 바탕으로 확인하였다.
- NMR 스펙트럼은 Xerian Inova AS 400(\erian, Califormia, USA)으로 측정하였고, IR spectmme Perkin model 599B (Perkin-Elmer, Massachusetts, USA)로 측정하였다. 녹는점은 Fisher-Johnes Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, Miami, USA)로 측정하였으며, EI/MS와 FAB/MS는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였다.
- 발색되었다. g-NMR(400MHz, CDC13) spectrum에서 8h 5.21 (6H, m)으] signal로부터 olefinic methine proton 6개가 존재함을 확인하였고, gH 3.64(3H, 아의 signal로부터 methoxy의존재를 확인 하였다. δH 2.
- n-BuOH 분획으로부터 ster이 의 분리. h-BuOH 분획 (48 g)으로부터 silica gel c.c.((|)10X 11 cm, CHCl3-MeOH = 7 :1 → 5: 1 t3 :1 t 1 : 1)를 실시하여 분획하였고, 이 분획을 TLCS. 확인하여 유사한 것끼리 모아 16개의 분획(BRB-1 ~BRB-16)으로나누었다.
- 강화특화작목의 생리활성 탐색 및 효능 검정 연구에 선행하여, 순무(Brassica campestris ssp rapa)뿌리 껍질을 제거한 속 부분 48 kg을 80% MeOH용액으로 실온에서 하루 동안 추출하기를 2빈 반복하였다. 용내 극성의 차이에 따라 계통 분획 하여 세가지 분획 즉 EtOAc.
- ((|)4X 13 cm, n- hexane~EtOAc = 7:1)를 실시하여, 9개의 분획물(RRE5-1 ~ BRE5-9)을 얻었다. 그 중 BRE5-3(125 mg) 분획을 silica gel c.c.((|)2.5X 14 cm, n-hexane-EtOAc =15: 1)로 정제하여 BRE5-3- 1 [(화합물 1, 23 mg, TLC(Kieselgel 60 F254) 凡=0.65, n- hexane~EtOAc = 5:1)]을 분리 하였다. 또한 BRE5-5(482 mg) 분획을 ODS c.
- 녹는점은 Fisher-Johnes Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, Miami, USA)로 측정하였으며, EI/MS와 FAB/MS는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. GC는 GC-14B(Shimadzu, Tokyo, Japan)로, GC/MS 는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, UV lamp는 Spectroline(Model ENF-240 C/ F, Spectronics Corporation, New York, USA)을 사용하였으며, 비선광도는 Polarimeter P-1020(JASCO, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- 65, n- hexane~EtOAc = 5:1)]을 분리 하였다. 또한 BRE5-5(482 mg) 분획을 ODS c.c.(Φ3.5X9cm, acetone-acetonitrile = 3: 1)로 정제하여 BRE554[(화합물 4, 32 mg, TLC(RP-18 F254s) Rf = 0.45, acetone-acetonitrile = 5 :1)을 분리 하였다. BRE7(400 mg) 분획에 대하여 silica gel c.
- 시료 BRE5-3-l(화합물 I, 1 mg/1 m/), BRE7-7(화합물 2, 1 mg/1 m/) 및 BRE10-1(화합물 3, 1 mg/1 m/)로부터 각 3 µl를 취하여, FID가 설치된 GC (GC-14B, Shimadzii, Tokyo, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착 시켜 분석하였다. 분석용 컬넘은 DB-5(30mX0.32mm IDX0.25 jim, J & W, Folsom, California, USA)를 사용하였으며, GC의 injector 온도는 300Y, oven 온도는 처음 3분 동안 15CPC로 유지하였고, 승온 속도를 WC/min으로 하여 최종온도가 300℃ 가 되도록 한 후 5분간 30(TC를 유지하도록 하였다. 분석한 화합물 1, 2 및 3으] Retension time(min)은 각각 9.
- 55(3)으로 나타났다. 분석한 화합물을 동정하기 위하여, GC(Agilent technologies, California, USA)와 연걸된 mass spectrometeitJMS-VOO, JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 분석 용으로 사용한 컬 넘 (HP-5, 30mX0.32 mm ID X 0.25 jim, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC로 분석한 각 peak의 최종적인 확인은 GC-MS의 libraiy 분석을 바탕으로 확인하였다.
- 순무 뿌리로부터 활성 물질을 분리 동정 하기 위하여 80% MeOH 수용액으로 추출하고 이를 여과, 감압 농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 이를 EtOAc분획, n-BuOH분획, H:Q 분 획으로 나누었으며, EtOAc분획과 BuOH분획에 대해 silica gel 및 ODS column chromatography를 실시하여 5종의 화합물을 분리 정제하였다.
- 순무(丽的函 campestteis ssp rapa) 뿌리부분 생체 중 100 kg을 껍질과 속 부분을 구분하고 세절하여 속부분(48 kg)을 MeOH 80% 수용액 (181×5)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과를 하였다. 얻어진 여액을 45℃에서 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다.
- 화합물 1, 2 및 3의 GC/MS 분석. 시료 BRE5-3-l(화합물 I, 1 mg/1 m/), BRE7-7(화합물 2, 1 mg/1 m/) 및 BRE10-1(화합물 3, 1 mg/1 m/)로부터 각 3 µl를 취하여, FID가 설치된 GC (GC-14B, Shimadzii, Tokyo, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착 시켜 분석하였다. 분석용 컬넘은 DB-5(30mX0.
- 얻었다. 이를 EtOAc분획, n-BuOH분획, H:Q 분 획으로 나누었으며, EtOAc분획과 BuOH분획에 대해 silica gel 및 ODS column chromatography를 실시하여 5종의 화합물을 분리 정제하였다. 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT spectrum 및 Mass spectrum 등을 통하여 palmitic acid methyl ester(l), linolenic acid methyl ester(2), linoleic acid methyl ester(3), /^-sitosterol (4), daucoster이(5)으로 구조를 결정하였다.
대상 데이터
- 따라서 이 화합물은 세 쌍의 이중결합을 갖고 있는 aliphatic chain 형태의 화합물로 판단되었다. 13C-NMR(100MHz, CDC13) spectrum에서 19개의 탄소 signal이 관측되었다. & 174.
- 6 Hz)에서 tenninal methyl proton이 관측 되어져 지방산 화합물로 추측 되었다. 13C-NMR(100MHz, CDCh) spectrum에서 17개의 탄소 signal이 관측되었고, δC 170.5에서 carbonyl carbon과 & 51.5에서 methoxy기가 관측되었다. & 34.
- 시약 및 기기. Column chromatogFaphy용 silica g솨은 Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. Thin layer chromatography(이하 TLC라고 함)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- Column chromatogFaphy용 silica g솨은 Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. Thin layer chromatography(이하 TLC라고 함)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 실험재료. 본 실험에 사용한 순무는 2005년도 5월 강화군 농업기술센터로부터 제공받았고 , 강화군 강화특화작목연구소 정해곤 박사가 동정하였으며, 표본시료(KHU-050512)는 경희대학교 생명공학원 천연물화학실에 보관되어 있다.
성능/효과
- 4Hz)에서 1개의 triplet methyl proton signaK 확인 하였다. 13C-NMR spectrum에서 탄소수가 29개이고 methyl carbon이 6개 관측된 점으로부터 sterol화합물인 것을 확인하였다. & 140.
- 0 Hz)에서 triplet의 말단 methyl proton signal로부터 지방산 분자임을 추측할 수 있었다. 13C-NMR(100MHz, CDC13) spectrum에서 탄소수가 19개였으며, carbonyl에서 비롯한 1개 탄소(& 173.7)와 4개의 olefinic methine 탄소(& 129.7, 129.6, 127.8, 127.6) 그리고 & 512에서 methoxy기와 12개의 methylene 탄소가 & 34.1과 & 22.7 사이에서 관측되었으며, & 14.4에서 terminal methyl 탄소가 관측되어 탄소수 18개의 linoleic acid에 methyl기가 ester 형태로 결합된 물질임을 알 수 있었다. 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 13초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 NT 이온 peak가 m/z 294에서 관측되었다.
- 활성이 있는 것으로 확인 되었다. Palmitic acid, linolenic acid 는 항산화 활성이 높은 것으로 나타났으며, mm linoleic acidFe 항균 활성이 높은 것으로 나타났다. 또한 sterol 화합물 중 /^-sitosterol, daucosterole 많은 식물에 존재하는 물질이지만 다양한 활성이 알려져 있다.
- 발색되었다. iH-NMR(400MHz, CDC13) spectrum에서 8h 5.31(4H, m)으] signal로부터 olefinic methine proton 4개가 존재함을 확인하였고, gH 3.54(3H, s)에서 나타난 수소수 3개의 methoxy기와 δH 2.75(2H, dd, J=6.8, 6.4 Hz), SH 2.28(2H, t, J=8.6 Hz), 5h 2.02(2H, dt, J=6.8, 6.5 Hz), SH 2.01 (2H, dt, J = 6.5, 6.8 Hz)에서 allyl 위치의 methylene signal이 관측되었으며, 5h 1.37~ 1.22에서 다수의 methylene이 그리고 δH 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz)에서 triplet의 말단 methyl proton signal로부터 지방산 분자임을 추측할 수 있었다. 13C-NMR(100MHz, CDC13) spectrum에서 탄소수가 19개였으며, carbonyl에서 비롯한 1개 탄소(& 173.
- 42에서 나타나는 것으로 보아, glycosidation shift 가 인정되었다. 구성당 signal의 chemical shift를 검토한 결과, δH5.04에서 관측된 anomeric proton(d, J = 7.6 Hz)의 값으로부터 당이 sitosterol에 결합하고 있는 것을 확인하였으며, 13C- NMR 스펙트럼에서 당 signal들의 chemical shift [& 102.6(C- 1'), & 78.7(C-3'), & 78.3(C-5'), & 75.4(C-2'), & 71.5(C-4'), & 6*)1 1.9(06 로부터 구성당은 D-glucopyranose임을 알 수 있었다. 따라서, 화합물 5는 "sitosterol의 C-3의 hydroxyl기에 D- glucopyranose가 0결합하고 있는 화합물인 β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranoside(daucosterol)로 구조 결정하였다.
- 1에서 tenninal methyl signal0] 확인되었다. 따라서 정확한 구조 동정을 위하여 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 3 초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 이온 peak가 m/z 270에서 관측되어 270으로결정 하였고, 이것을 libraty와 비교해본 결과 palmitic acid methyl estei와 일치 하였다.
- 4에서 terminal methyl 탄소가 관측되어 탄소수 18개의 linoleic acid에 methyl기가 ester 형태로 결합된 물질임을 알 수 있었다. 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 13초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 NT 이온 peak가 m/z 294에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 검색한 결과 화합물 3을 linoleic acid의 methyl esterS.
- 구조를 규명하였다. 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 2Q초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 NT 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 2를 linolenic acid의 methyl ester로 동정하였다.
- 순무에서 분리된 지질 화합물들을 문헌 조사해 본 결과 생리 활성이 있는 것으로 확인 되었다. Palmitic acid, linolenic acid 는 항산화 활성이 높은 것으로 나타났으며, mm linoleic acidFe 항균 활성이 높은 것으로 나타났다.
- 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 2Q초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 NT 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 2를 linolenic acid의 methyl ester로 동정하였다.8)
- 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 5분 13초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 NT 이온 peak가 m/z 294에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 검색한 결과 화합물 3을 linoleic acid의 methyl esterS. 동정하였다.
- 9에서 6개의 methyl carbon을 확인하였다. 이를 종합하여 비교한 결과 화합물 4은 여러가지 식물에서 널리 함유되어 있는 sterol인 stigmast-5-en-3/3v>K/Qsitosterol)로 동정하였다.8,9)
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