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문제 정의
- 분획하였고 이 물질을 MBT-01108 물질이라 명명하였다. 본 연구에서는 시중에서 사용되는 소독제에 대한 병원성 미생물의 내성 빈도를 확인하고, 그 내성이 항생제 내성에도 영향을 미치는지를 알아보고자 한다. 그리고 본 연구실에서 제주도 손바닥 선인장으로부터 추출, 분획한 물질이 소독제와 항생제에서 획득 내성균에 대해 나타나는 내성 빈도와 항균 활성 물질로서의 가치에 대해 알아보고자 한다.
- 본 연구에서는 시중에서 사용되는 소독제에 대한 병원성 미생물의 내성 빈도를 확인하고, 그 내성이 항생제 내성에도 영향을 미치는지를 알아보고자 한다. 그리고 본 연구실에서 제주도 손바닥 선인장으로부터 추출, 분획한 물질이 소독제와 항생제에서 획득 내성균에 대해 나타나는 내성 빈도와 항균 활성 물질로서의 가치에 대해 알아보고자 한다.
제안 방법
- 본 연구실에서는 활성 물질의 탐색을 기존에 사용하여 온 미생물 대신 우리 나라에서 자생 . 재배되고 있는 식물 중 민간 요법에서 사용되어 온 식물을 이용하여 항생제 내성 균주에 대한 항균 물질을 탐색하였다.
- 대신 우리 나라에서 자생 . 재배되고 있는 식물 중 민간 요법에서 사용되어 온 식물을 이용하여 항생제 내성 균주에 대한 항균 물질을 탐색하였다. 제주도에서 경작 또는 일부 자생되는 선인장 중에서 Opuntia속에 속하는 해안 부채 선인장 (Opuntia littoralis cock)과 손바닥 선인장 (Opuntia ficus-indica var.
- 이에 본 연구실에서는 우리 나라에서 자생 . 재배되고 있는 손바닥을 여러가지 방법으로 가수 분해한 후 그 가수 분해 추출물로부터 항균 활성 물질을 추출 . 분획하였고 이 물질을 MBT-01108 물질이라 명명하였다.
- ODe에서 흡광도를 측정 후 CFU/ml이 되도록 희석을 하여 스코테린®, 푸드세프, 와이덱스액®, 헥시덱스액, 동인염화벤잘코뇸액, 동인테고, Iodo 175 등의 소독제 별로 최소 생육 억제 농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) test를 하였다[1, 14]. 각 소독제에 대한 최소 억제 농도를 기준으로 하여 wild type의 균주들을 먼저 LB broth에 소독제와 같이 접종을 하고 37℃, 200 rpm으로 16시간 배 양하였다.
- 이후에 소독제가 첨가된 평판 배지에 도말하여 37℃에서 20시간 배양하였다. 평판 배지에 자란 colony중에 단일 colony를 picking 하여 소독제가 첨가된 LB broth에 접종하고 37℃, 200 rpm 으로 16시간 배양한 후 MIC test를 시 행하였으며, 이와 동일한 방법으로 반복 실행한 결과에 의해 이 농도를 넘어선 균주들을 내성균으로 간주하고 그 빈도를 측정하였다.
- 각 소독제에 대한 기준 MIC 값을 넘어선 균주들을 사용하여 ampicillin, chloramphenicol, gentamycin, kanamycin, rifampicin, streptomycin, tetracycine 일곱 가지의 항생제를 사용해 각 항생제에 대한 내성 균주를 선별하였고 빈도를 측정하였다. 먼저 각 항생제에 대해 소독제와 동일한 방법으로 wild type의 다섯 균주들을 MIC test하였고 최소 억제 농도를 기준 값으로 정하였다.
- 먼저 각 항생제에 대해 소독제와 동일한 방법으로 wild type의 다섯 균주들을 MIC test하였고 최소 억제 농도를 기준 값으로 정하였다. 각 소독제에 대해 내성균으로 간주된 균들을 사용하여 LB broth에 최소 억제 농도의 소독제를 첨가해서 37℃, 200 rpm으로 16시간 배양하였다.
- 이후에 소독제가 첨가된 평판 배지에 도말하여 37℃에서 20시간 배양하였다. 평판 배지에 자란 colony 중에 단일 colony를 picking하여 소독제가 첨가된 LB broth에 접종하고 370 200 rpm으로 16시간 배 양한 후 ODseo에서 흡광도를 측정 후 IxlO6 CFU/ml이 되도록 희석하여 각 항생제별로 MIC test 를 실시하였다. 또한 소독제에 대한 내성 균주들을 paper disc법에 의하여 평판 배지에 100 μl에 도말한 후 각각의 항생제를 사용하여 paper disc (5>8 mm)에 흡수시킨 다음 37℃ 배양기에서 20시간 배양하여 항균 활성을 검토하였다[11, 13].
- 평판 배지에 자란 colony 중에 단일 colony를 picking하여 소독제가 첨가된 LB broth에 접종하고 370 200 rpm으로 16시간 배 양한 후 ODseo에서 흡광도를 측정 후 IxlO6 CFU/ml이 되도록 희석하여 각 항생제별로 MIC test 를 실시하였다. 또한 소독제에 대한 내성 균주들을 paper disc법에 의하여 평판 배지에 100 μl에 도말한 후 각각의 항생제를 사용하여 paper disc (5>8 mm)에 흡수시킨 다음 37℃ 배양기에서 20시간 배양하여 항균 활성을 검토하였다[11, 13].
- 분획한 물질 중에서 가장 항균 활성이 높은 물질인 MBT-01108 물질을 이용하였다. 일곱 가지 소독제와 일곱 가지 항생제에서 선별된 내성균과 환자로부터 분리한 균주인 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VREZ E. coli 0157을 사용하여 MBT-01108 물질의 항균 활성을 검토하였고, 시험 균들의 내성 획득 여부를 MIC test와 paper disc 방법을 사용해서 확인하였다. Paper disc 방법에 사용하기 위하여 MBT-01108 물질의 농도를 10 mg/ml로 동일하게 하여 시험 균주에 사용하였다.
- Paper disc 방법에 사용하기 위하여 MBT-01108 물질의 농도를 10 mg/ml로 동일하게 하여 시험 균주에 사용하였다. 또한 MIC test에 사용하기 위하여 MBT-01108 물질을 농도가 200 mg/ml이 되도록 멸균된 12.5% DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma, USA) 에녹인 후에 0.45 ㎛ filter (Sartorius, Germany)로 여과 제균시켰다. 그 다음 각각의 배지가 들어있는 96-well plate에 MBT-01108 물질의 최고 농도가 25 mg/ml이 되도록 첨가한 후에 두 배 연속 희석법 (two-fold serial dilution method)으로 0.
- 평판 배지에 각 균주의 단일 colony를 한 백금이 취해 각각의 액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 전배양하여 활성화시킨 후 고체 배지에 배양액 100 μ1를 떨어뜨려 균일하게 도말한다. 멸균된 paper disc를 넣고, 항생제 및 MBT-01108 물질의 각각의 농도별 로 100 gl/disc (농도 ; 10 mg/ml)가 되도록 흡수시 킨 다음 37C 에서 24시간 동안 배 양한 후 disc 주위의 inhibitory zone을 관찰하였다. 이후에 inhibitory zone이 생기는 최소 농도의 항생제 및 MBT-01108 물질의 양을 결정한 후 내성 균주들에 대해 위와 동일한 방법으로 항균 활성을 시험하고 inhibitory zone을 관찰하였다.
- 멸균된 paper disc를 넣고, 항생제 및 MBT-01108 물질의 각각의 농도별 로 100 gl/disc (농도 ; 10 mg/ml)가 되도록 흡수시 킨 다음 37C 에서 24시간 동안 배 양한 후 disc 주위의 inhibitory zone을 관찰하였다. 이후에 inhibitory zone이 생기는 최소 농도의 항생제 및 MBT-01108 물질의 양을 결정한 후 내성 균주들에 대해 위와 동일한 방법으로 항균 활성을 시험하고 inhibitory zone을 관찰하였다.
- 있다(data not shown). MBT-01108 물질을 사용해 각 wild type 균주별로 MIC test를 한 결과와 이것을 control로 두고 소독제로부터 내성을 획득한 균주들과 소독제, 항생제 모두에 내성을 획득한 균주 및 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VRE, E. coll 0157을 사용해서 MIC test를 시행하였고, 그 결과는 Table 4에서 볼 수 있듯이 동일한 MIC 값을 나타내었다.
- 각 시험 균주의 wild type에 대해 MBT-01108 물질을 사용해서 paper disc로 항균 활성을 측정한 결과를 control로 두었다. 이 control과 비 교해서 paper disc 방법으로 내성 균주를 사용해서 inhibitory zone의 생성 유무와 크기를 비교한 결과 소독제 및 항생제에 내성인 균주는 동일한 항균 활성을 가짐을 확인할 수 있었다 (Fig.
대상 데이터
- 시중에서 시판되는 일반 소독제를 분류에 따라서 과산화제, 염소제, glutaraldehyde, diguanide 유도체, 4급 암모늄 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 요오드제 각 한 가지씩 사용하였고 (Table 1), penicillin, aminoglycoside, chloramphenicol, rifampin, tetracycline 계 항생제를 선별해서 사용하였다 (Table 1).
- 본 연구실에서는 Opwitia속 선인장 중에 손바닥 선인장 (Opuntia ficus-indica var. Sabo ten Makino, 원산지 : 멕시코)을 사용해서 추출 . 분획하였고, 획득한 물질 중에서 항균 활성이 높은 MBT-01108 물질을 본 실험에 사용하였다.
- Sabo ten Makino, 원산지 : 멕시코)을 사용해서 추출 . 분획하였고, 획득한 물질 중에서 항균 활성이 높은 MBT-01108 물질을 본 실험에 사용하였다.
- 1과 같다. 손바닥 선인장 추출물의 항균 활성을 시험하기 위하여 임상 분리 균주인 MRSA (Metliicillin Resistant Staphylococcus aureus), Resistant Pseudomonas aeruginosa, VRE (Vancomycin Resistant Enterococcus), Esherichia coli0157은 환자로부터 분리된 균주를 사용하였다.
- 항균 활성을 검토하기 위하여 wild type Salmonella enteritidis ATCC 13076, Streptococcus faecalis ATCC 10541, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Escherichia coli KCTC 1039 다섯 균주를 시험 균주로 선택해서 Luria-Bertani (LB, Ventech bio, Korea) broth 에 접종해 37℃, 200 rpm으로 16시간 배양하였다. ODe에서 흡광도를 측정 후 CFU/ml이 되도록 희석을 하여 스코테린®, 푸드세프, 와이덱스액®, 헥시덱스액, 동인염화벤잘코뇸액, 동인테고, Iodo 175 등의 소독제 별로 최소 생육 억제 농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) test를 하였다[1, 14].
- 제주도 손바닥 선인장을 추출 . 분획한 물질 중에서 가장 항균 활성이 높은 물질인 MBT-01108 물질을 이용하였다.
- 제주도 손바닥 선인장을 추출 . 분획한 물질 중에서 가장 항균 활성이 높은 물질인 MBT-01108 물질을 이용하였다. 일곱 가지 소독제와 일곱 가지 항생제에서 선별된 내성균과 환자로부터 분리한 균주인 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VREZ E.
이론/모형
- 45 ㎛ filter (Sartorius, Germany)로 여과 제균시켰다. 그 다음 각각의 배지가 들어있는 96-well plate에 MBT-01108 물질의 최고 농도가 25 mg/ml이 되도록 첨가한 후에 두 배 연속 희석법 (two-fold serial dilution method)으로 0.05 mg/ml 농도까지 희석하여 사용하였다.
- 각 항생제 및 MBT-01108 물질의 항균 실험은 먼저 공시 균주를 이용하여 paper disc 방법으로 관찰하였다. 평판 배지에 각 균주의 단일 colony를 한 백금이 취해 각각의 액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 전배양하여 활성화시킨 후 고체 배지에 배양액 100 μ1를 떨어뜨려 균일하게 도말한다.
성능/효과
- 2에 나타내었다. 각 소독제에 대한 대부분의 사용 균주들이 MIC 값의 변화를 나타내었고, control 수치보다 높은 농도의 MIC 값을 갖는 균주들을 내성균으로 간주하고 빈도를 측정하였을 때 약 30%가 내성 획득을 가짐을 볼 수 있었다. 이 중에서 푸드세프 (산화제 중 할로겐 계 소독약)와 동인테고 (양성 계면 활성제) 및 Iodo 175 (요오드제)는 병원미생물에 대해 낮은 감수성을 나타내었을 뿐 아니라 시험에 사용된 다른 소독제에 비하여 높은 내성 빈도를 나타내었다.
- 항생제에 대해 대부분의 사용 균주들이 MIC 값의 변화를 나타내었고, 보다 높은 농도의 MIC 값을 갖는 균주들을 내성균으로 간주하고 빈도를 측정한 결과 30%가 내성 획득을 가짐을 볼 수 있었다. 다른 항생제에 비해 aminoglycoside 계의 항생 제 인 gentamycin, kanamycin, streptomycin에서 높은 내성 빈도, 즉 cross resistance를 나타냄을 확인할 수 있었을 뿐 아니라, 다른 계열의 항생제에도 내성을 가지는 associated resistance를 보임을 확인할 수 있었다[4].
- 항생제에 대해 대부분의 사용 균주들이 MIC 값의 변화를 나타내었고, 보다 높은 농도의 MIC 값을 갖는 균주들을 내성균으로 간주하고 빈도를 측정한 결과 30%가 내성 획득을 가짐을 볼 수 있었다. 다른 항생제에 비해 aminoglycoside 계의 항생 제 인 gentamycin, kanamycin, streptomycin에서 높은 내성 빈도, 즉 cross resistance를 나타냄을 확인할 수 있었을 뿐 아니라, 다른 계열의 항생제에도 내성을 가지는 associated resistance를 보임을 확인할 수 있었다[4].
- 이 control과 비 교해서 paper disc 방법으로 내성 균주를 사용해서 inhibitory zone의 생성 유무와 크기를 비교한 결과 소독제 및 항생제에 내성인 균주는 동일한 항균 활성을 가짐을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 또한 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VRE, E.
- 1). 또한 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VRE, E. coll 0157을 사용해서 항균활성을 측정한 결과 MBT-01108 물질에 대해 이 균들의 생육이 저지됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
- 이상의 결과로 볼 때, 사용된 소독제와 항생제에 내성을 보이는 균주들도 MBT-01108 물질에 대해서는 내성이 나타나지 않는 것으로 볼 수 있다. 이것은 MBT-01108이 전혀 새로운 방식의 항균활성 작용 기작이 있을 가능성이 있기 때문에 매우 흥미로운 물질로 생각된다.
후속연구
- 소독제는 대개 병원성 세균이나 다른 유해한 미생물들을 사멸시키거나 바이러스를 불활성화 시키는 화학 물질을 의미하고, 일반적으로는 성장 중인 세균을 죽이지만, 포자를 형성하는 세균을 반드시 사멸시키지 않는 물질을 말한다[19]. 이상적인 소독제로서 갖추어야 할 조건은 ① 모든 병원 미 생물에 대하여 매우 낮은 농도로도 효과가 있을 것, ② 균체 이외의 단백질이나 그 밖의 유기물의 존재에 의해 효럭의 저하가 없고 효과가 빠를 것, ③ 소독해 야 할 기물을 손상시 키 지 않을 것, ④ 사람이 나 가축에 대하여 전혀 해가 없을 것, ⑤ 화학적으로 안정할 것, ⑥ 착색되지 않고 무취일 것, ⑦ 값이 싸고 사용법이 간단할 것 등이다. 병원에서는 의료기구 .
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