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문제 정의
- 영향에 대하여 rats를 통하여 확인하였다. 법제 유황을 투여한 쥐의 몸무게 간무게지수와 혈액학적인 검사, 조직학적인 검사를 통해 법제 유황의 안정성에 대하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 분리된 혈청으로 Y-GTP, GOT, GPT, Total bilirubin, BUN, LDH, ALP, Al bumin, Phosphorus, Total protein, Total cholesterol, Triglyceride를 측정하였으며, 측정하기 전까지는 -70 "t 에 보관하였다. Y-GTP 는 diagnostic kits (AM158-K, Asan, Korea)을 사용하여 spectrophotometer (Unikon922, Kontron, Italy)로 635 nm 파장에서 측정하였으며, GOT는 GOT-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, GPT는 GPT-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, Total bilirubinfe T.
- 에 보관하였다. Y-GTP 는 diagnostic kits (AM158-K, Asan, Korea)을 사용하여 spectrophotometer (Unikon922, Kontron, Italy)로 635 nm 파장에서 측정하였으며, GOT는 GOT-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, GPT는 GPT-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, Total bilirubinfe T.bilirubin-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 546 nm 파장에서 측정하였으며, BUNe BUN diagnostic kits (AM158-K, Asan, Korea)을 사용하여 spectrophotometer (Unikon922, Kontron, Italy)로 580 nm 파장에서 측정하였으며, LDH는 LDH-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, ALP는 ALP-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 405nm 파장에서 측정하였으며, Al bumine Al bumin-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 546 nm 파장에서 측정하였으며, Phosphorus는 Phosphorus-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하였으며, Total proteine Total protein-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 546 nm 파장에서 측정하였으며, Total cholesterol는 T.cholesterol-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 546 nm 파장에서 측정하였으며, Triglyceride는 Triglyceride-SL Kit (ELITech, France)를 이용하여 505 nm 파장에서 측정하였다. y-GTP를 제외한 혈청분석은 photometer (5010, Robert Riele GmbH & Co.
- 각 군들의 Mice는 28일째에 단두하여 얻어진 혈액검사를 위하여 Whole blood 1 을 EDTA bottle에 담아 곧바로 혈구 측정기 (K-800, Sysmax, Japan)에 주입하여 white blood cell(WBC), red blood cell(RBC), hemoglobin(HGR), Hematocrit(Hct) 등을 각각 측정하였다.
- 각 군들의 Rats의 체중은 1주에 한번씩 4주간 4회에 걸쳐 측정되었고, 치료가 끝난 후에 다음날 단두하여 혈액을 채취하고 난 후 whole liver의 무게를 죽정하였으며 간 무게 지수는 다음과 같은 식에 의하여 산출되었다.
- 간 기능 지표로서 혈중 al bmin과 총 단백질량, 그리고 혈중빌리루빈의 변화를 측정하였다. 혈중 빌리루빈과 총 단백질은 여러 인자 - 간장해의 정도, 특성과 기간, 영양상태, 순환장애 및 아미노산 흡수 등에 의하여 달라질 수 있다.
- 경구투여는 각 실험 군들을 대상으로 contr이군은 saline 0.8 를, 유황경구투여 군들은 각 농도별로 saline 0.8 에 유황을 희석하여 2일 간격으로 1회씩 총 14회를 4주간 시행하였다.
- 광학현미경 관찰을 위하여 각 군들의 Rats를 희생시켜 whole livei를 적줄하여 무게를 즉정한 다음/ 간 조직을 적줄하여 이를 venin solution을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 70%, 80%, 90%, 100%, 어:anol/xylol(l:2)액에 각각 2시간 통과 시켜 탈수하고 55 C incubator에서 xylol/hard paraffin(2:l), xylol/hard paraffin(l:2), 및 hard paraffin 용액으로 3시간 씩 처리한 후 paraffin 포매하였다. 이를 microtome을 사용하여 5 /im 두께로 절편을 제작한 후 Hematoxylin-eosin 으로 염색하고, 200배율로 광학현미경 (Olympus BX51TF, Japan)을 이용하여 관찰하였다
- 군의 분류는 saline을 경구투여한 군(ContiC, n=6), 6 mg /200 g/day의 농도로 유황을 경구 투여한 유황 1군(SI, n=6), 30 mg/200 g/day의 농도로 유황을 경구 투여한 유황 2군(S2, n=6), 60 nig/200 g/1 일의 농도로 유황을 경구 투여한 유황 3군(S3, n=6) 등 모두 4개 군으로 분류하였고, 경구투여 후 14일째에 60 mg/200 g/day(S3) 군에서 1마리가 사망하였으며 다른 모든 Rats는 생존하였다.
- 독성이 있다고 생각되는 약물의 경우 사람에 투여하여 실험을 할 수 없기에 그 안정성을 알아보고자 법제 유황을 쥐에게 투여하여 실험을 진행하였다.
- 본 시험에서는 Biliary dysfunction이나 Cholestasis가 유발되었는지를 보기 위하여 ALP와 r-GPT의 변화를 측정하였으며, 간세포의 손상여부를 보기 위하여 AST, ALT와 LD버의 변화를 측정하였다. r-GTP의 변화는 실험군의 6 mg/20 g/day group 헤서 감소경향이 나타났으나 30 mg/200 g/day group과 60 mg/200 g/day group에서는 모두 통계적인 유의성이 없었고 (Fig3), ALP의 변화에 있어서는 6, 30, 60 mg/200 g/day group 이 모두 감소경향을 보였지만 통계적으로 유의하지는 않았다 (Fig.
- 본 실험에서 법제 유황의 투여량은 대조군과 실험군으로 나누어 실험군은 6 mg/200 g/day의 농도로 유황을 경구 투여한 6 mg/200 g/day group, 30 mg/200 g/day의 농도로 유황을 경구투여한 30 mg/200 g/day group, 60 mg/200 g/day을 투여한 60 mg/200 g/day group, Control group까지 모두 4개군으로 분류하였고, 경구투여 후 14일후에 60 mg/200 g/day group에서 1 마리가 사망하였고, 실험은 4주간 진행하였다.
- 후 paraffin 포매하였다. 이를 microtome을 사용하여 5 /im 두께로 절편을 제작한 후 Hematoxylin-eosin 으로 염색하고, 200배율로 광학현미경 (Olympus BX51TF, Japan)을 이용하여 관찰하였다
- 이에 본 실험에서는 유황을 법제하여 유황이 간 독성에 미치는 영향에 대하여 rats를 통하여 확인하였다. 법제 유황을 투여한 쥐의 몸무게 간무게지수와 혈액학적인 검사, 조직학적인 검사를 통해 법제 유황의 안정성에 대하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 유황은 광물성 법제유황으로 설폰라이프 (주)에서 구입하여 사용하였으며 이는 나복자에 24시간동안 법제하는 전통적 방법을 사용하였다.
- 이에 법제를 하여 사용하거나 동물을 이용하여 사용하였다. 법제를 하는 방법으로는 # 등이 있다.
- 체중이 약 200 - 220 g의 Sprague Dawley계의 Rats를 사육장 (실내온도, 24~26T?)내에서 물과 사료를 충분히 섭취하게 하면서 사육하였다가 실험에 사용하였다.
데이터처리
- )로 표시하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(version 10.05, SPSS)를 이용하여, 비모수적 방법 중 Mann-Whitney U test를 시행하였다. 전체 실험의 통계적인 유의성은 신뢰구간 P<0.
- 실험 성적은 평균값과 표준오차(mean-S.E.)로 표시하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(version 10.
성능/효과
- 6 mg/200 g/day group(Sl)에서는 control group에 비하여 간세포 핵 주변의의 염색도가 낮았으며 조직 및 핵 밀도 또한 낮았으나 간세포 핵은 비교적 동굴하고 뚜렷이 관찰되었다(Fig. 16C).
- r-GTP의 변화는 실험군의 6 mg/20 g/day group 헤서 감소경향이 나타났으나 30 mg/200 g/day group과 60 mg/200 g/day group에서는 모두 통계적인 유의성이 없었고 (Fig3), ALP의 변화에 있어서는 6, 30, 60 mg/200 g/day group 이 모두 감소경향을 보였지만 통계적으로 유의하지는 않았다 (Fig. 9). 그러나 김2)의 다른 실험에 있어서 ALP는 유의성이 있지는 않았으나 증가하였다는 보고도 있어서 이에 대한 검증이 필요하리라 사료된다.
- 66 (mg/dl)를 나타내었다. 각 군별의 변화 비교에서 control group에 비하여 6 mg/200 g/day group (SI), 30 mg/200 g/day group(S2)과 60 mg/200 g/day group (S3) 모두 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 13).
- 61 (g/dl)를 나타내었다. 각 군별의 변화 비교에서 control group에 비하여 6 mg/200 g/day group(Sl), 30 mg/200 g/day group(S2)과 60 mg/200 g/day group(S3) 모두 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 12).
- 각 군별의 변화 비교에서 control group에 비하여 WBC와 HGB의 변화는 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았으며, RBC의 변화는 6 mg/200 g/day group(Sl), 30 mg/200 g/day group(S2)과 60 mg/200 g/day group(S3) 모두 증가경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았고, Het의 변화는 30 mg/200 g/day group(S2)에서 감소경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 15).
- 11 (g/dl)를 나타내었다. 각 군별의 변화 비교에서 control 군에 비하여 6 mg/200 g/day group(Sl), 30 mg/200 g/day group(S2)과 60 mg/200 g/day group(S3) 모두 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 10).
- 농도별 유황의 경구 투여 후 간조직을 적출하여 광학현미경으로 관찰한 결고b contr이 group에서는 동 모 양 혈관(sinusoid)의 형태가 뚜렷하게 관찰되었고, 간세포의 핵은 대부분 둥글게 관찰되었으며, 조직의 밀도도 높았다(Fig. 16A).
- Zimmerman과 Seeff는 간 독성 지표로 서의 혈중 효소를 4부류로 분류하였는데, 첫 번째는 cholestasis의 지표로 ALP, r-GPT, 5'-nucleotidase가 있다. 두 번째는 간세포 손상의 지표로서 간 손상에만 특이적이지 않고 다른 조직이 손상된 경우에도 혈중농도가 증가되는 AST, LDH가 있고, 간세포에 주로 많이 존재하는 ALT와 간세포에만 거의 특이적으로 존재하는 Ornithine carbamyl transferase, SDH가 있다. SDH는 특히 화학 물질에 의한 간세포 손상에 민감한 지표로 알려져 있다.
- 법제 유황이 간독성에 미치는 영향을 실험적으로 증명하고자 Rats에게 법제 유황을 4주간 투여한 후 혈액학적 검사, 조직학적 검사, 체중 등을 측정하여 얻은 결론을 종합해 보면 체중, 간무게 지수, x-GTP, GPT, BUN, ALP, Al bumin, Total Protein, Tot시 cholesterol, WBC, RBC, 버GB, Het등에서 control group에 비하여 유의한 변화를 보이지 않았고 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), 혈청 중 bilirubin, LDH는 감소하는 경향이 있었으나 간 장애나 혈액학적인 변화를 참고할 때 의미 있는 변화로 보기는 어려웠다.
- phosphorus의 증가는 PTH결핍, 감수성저하, vitamin D 과잉, 성장호르몬 과잉, 골 흡수항진, 요 중 배설감소 등으로 생긴다. 본 연구에서는 대조군에 비하여 6, 30 mg/200 g/day group의 유의한 증가를 보였다(P<0.05)(Fig. 11). 이는 김찌의 실험에서 나타난 것과 연관이 있는 것으로 보이며 칼슘, Osteocalcin과 Estrogen이 증가하였다는 것을 보아서 유황의 골 질환에 대한 이용 가능성을 보여준 예라고 할 수 있겠다.
- 담도결석/ 담도암, 급성 용혈성/ 빈혈/ 수혈 부작용, 간염, 수은중독 시에 증가된다. 실험결과, al bumin(Fig. 10)과 총 단백질(Fig. 12)은 모두 통계적으로 유의성 있는 변화를 나타내지 않았고 혈중 bilirubine 30, 60 mg/200 g/day group 에서 유의한 감소를 보였다(Pv0.01)(Fig. 6). 이는 용혈성 빈혈 이외의 심한 빈혈로 인한 hemoglobin 대사가 저하로 인한 감소가 있을 수 있으나 혈액학적 변화를 참고한다면 일정한 의의는 없다고 사료된다.
- 이상과 같이 조직병리 및 혈액의 생화학적 검사 결과 모두 특기할 만한 독성이 나타나지 않았고 본 실험에서 사용된 60 mg/200 g/day의 용량까지는 Rats에 간독성을 유발하지 않는 것으로 확인되므로 실험에 쓰인 법제 유황은 사용된 용량까지는 안전성이 확보되는 것으로 사료되어 진다.
- 필요하리라고 사료된다. 조직학적 관찰에서 핵의 밀도와 핵 주변의 염색도가 6 mg/200 g/day group에서 60 mg/200 g/day group으로 갈수록 감소하는 경향이 나타났다.
후속연구
- 9). 그러나 김2)의 다른 실험에 있어서 ALP는 유의성이 있지는 않았으나 증가하였다는 보고도 있어서 이에 대한 검증이 필요하리라 사료된다. AST, ALT 중 ALT는 유의한 변화를 보이지 않았고(Fig.
- 이는 김찌의 실험에서 나타난 것과 연관이 있는 것으로 보이며 칼슘, Osteocalcin과 Estrogen이 증가하였다는 것을 보아서 유황의 골 질환에 대한 이용 가능성을 보여준 예라고 할 수 있겠다. 그러나김의 실험에서는 phosphorus가 약간 감소하는 경향을 보여서 혈중 Phosphorus와 법제 유황과의 상관관계에 대한 심도 있는 기전 연구가 필요하리라 사료된다.
- 2, ). 본 실험에서는 급성 간장해시에 나타나는 변화는 볼 수 없었으나 핵의 밀도와 핵 주변의 염색도가 6 mg/200 g/day group어서 60 mg/200 g/day group으로 갈수록 밀도와 염색도가 떨어지는 경향이 나타나 급성 간장해로는 볼 수 없으나 간 실질에 대한 자세한 장기간에 걸친 연구가 필요하리라 사료된다(Fig. 16BZ Cz D).
- Triglyceride 감소는 여러 질환 중 간질환에 의하면 간경변증 등 광범위한 간 실질 장애로 간에서 VLDL합성이 감소하여 나타나게 된다. 본 연구에서는 대조군에 비하여 30, 60 mg/200 g/day group에서 유의한 감소를 보였는데(P<0.01)(Fig. 14), 이는 조직학적 관찰에서도 나타나듯 약간의 간 실질의 장애에 따른 것이라고 사료되며 이에 대한 기전은 차후 더 자세한 연구가 필요하리라고 사료된다.
- 혈중 Phosphorus는 control group에 비하여 6, 30 mg/200 g/day groupo] 유의한 증가를 보였고 이에 대한 심도 있는 기전 연구가 필요하리라 생각되며, Triglyceride는 30, 60 mg/200 g/day group이 유의한 감소를 보였는데, 약간의 간 실질의 장애에 따른 것이라고 사료되며 이에 대한 기전은 차후 더 자세한 연구가 필요하리라고 사료된다. 조직학적 관찰에서 핵의 밀도와 핵 주변의 염색도가 6 mg/200 g/day group에서 60 mg/200 g/day group으로 갈수록 감소하는 경향이 나타났다.
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