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문제 정의
- 또한 pH와 수소생산 효율에 대한 관계를 단순히 기질 이용 및 유기산 생성 특성에 따라 규명하였기 때문에 수소 생산율에 미치는 미생물 군집에 관한 정보가 매우 열악하였다. 따라서 본 연구에서는 분자생물학적 기법의 하나인 PCR-DGGE (polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis)를 이용하여 pH를 3에서 10까지 단계적으로 변화시킨 상태에서 수소 생산과 미생물 군집변화를 해석하고자 하였으며 이를 통하여 수소생산 공정에서 미생물의 활용에 기본적 정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 뒤 30 µL의 1X TAE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다. 17) 분리된 DNA를 341f와 518r를 primer로 하여 PCR을 재실시하고 이때 생성된 PCR product를 이용하여 sequence하였다.
- DGGE는 40∼60%의 변성제 농도 구배(변성제 농도 100%는 7 M Urea, 40% Formaide)를 가지는 8% Polyacrylamide Gel을 만든 후(Bio-Rad Ltd. Co., Model 475 Gradient delivery system) 실시하였다.
- DNA 추출여부는 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- Fig. 1은 본 연구에 사용된 회분식 반응기로 배지11)와 탄소원으로 sucrose 1% (v/v)을 첨가한 후 N2 가스로 purging 시켜 혐기성 상태로 만들고 가스의 유출입이 없도록 완전 밀폐 시켰다. 균주로는 E하수처리장 활성 슬러지조의 반송 슬러지를 접종하여 단계 배양시킨 배양액을 실험 전 24시간 동안 배양시켜 균의 활성화를 도모한 후 주입하였다.
- , Model 475 Gradient delivery system) 실시하였다. Polyacrylamide Gel을 1X TAE buffer를 채운 DGGE 전기영동 기기(Bio-Rad D-code system, Hercules, CA, USA)에 부착시킨 후 GC clamp를 부착한 primer로 PCR을 실시하여 얻은 약 200 bp의 동일한 크기의 PCR product을 gel에 Loading 한 후 200 V, 300 min(runing time)10)으로 전기영동을 실시하였다. UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 뒤 30 µL의 1X TAE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다.
- UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 뒤 30 µL의 1X TAE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다.
- pH는 3에서 10까지 pH를 1만큼 변화시키면서 반응기 내 미생물의 군집변화를 살펴보았다.
- 1은 본 연구에 사용된 회분식 반응기로 배지11)와 탄소원으로 sucrose 1% (v/v)을 첨가한 후 N2 가스로 purging 시켜 혐기성 상태로 만들고 가스의 유출입이 없도록 완전 밀폐 시켰다. 균주로는 E하수처리장 활성 슬러지조의 반송 슬러지를 접종하여 단계 배양시킨 배양액을 실험 전 24시간 동안 배양시켜 균의 활성화를 도모한 후 주입하였다. 12,13) 실험은 30±3℃의 온도 조건에서 수행되었으며 미생물의 배양기간 동안 반응기 내 pH는 온도 센서가 연결된 pH 자동조절장치에 의해 일정하게 유지하였다.
- 으로 발색시킨 후 UV-Visible spectrophotometer(UV-1601, SHIMADZU)로 흡광도 파장 490 nm에서 측정하였다. 균체량(volatile suspendid solids)의 측정은 일정량의 배양액을 취하여 600 m에서 흡수된 광량을 기존에 건조중량으로 검량된 곡선에 대입하여 환산 측정하였다.15,16)
- 먼저 Bacteria의 16S rDNA 증폭을 위하여 EUB10f와 EUB1400r primer를 사용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 이때 생성된 PCR product를 이용하여 V3 region을 증폭하고자 341f와 518r primer로 2차 PCR을 수행하였다. 또한 DGGE 수행을 위해 341f에 GC clamp를 부착하여 2차 PCR을 다시 수행하였다.
- 0 software의 neighbor-joining method을 이용하였으며 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura2-parameter Model을 이용하였다. 또한 신뢰성 확보를 위해 1,000회의 bootstrap을 시행하였다. 17∼21)
- 8) 실험에 사용된 primer (Bionics, Korea)의 sequence은 Table 1과 같다. 먼저 Bacteria의 16S rDNA 증폭을 위하여 EUB10f와 EUB1400r primer를 사용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 이때 생성된 PCR product를 이용하여 V3 region을 증폭하고자 341f와 518r primer로 2차 PCR을 수행하였다. 또한 DGGE 수행을 위해 341f에 GC clamp를 부착하여 2차 PCR을 다시 수행하였다.
- 반응기의 총 가스는 2%(v/v) H2SO4을 담은 포화식염수에 포집하며 그 중 수소함량 측정은 열전도도 검출기를 장착한 가스 크로마토그래피(GOW-MAC series 350)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 혐기성 발효에 의한 수소 생산 시 배양기간 동안의 pH를 3에서 10까지 변화시키면서 각 pH에 따른 수소생산 효율과 미생물의 군집 변화를 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 수소생산 최대의 시점에서 채취된 각 시료를 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제외한 침전물을 약 0.25g이 되도록 한 후, Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.)를 사용하여 DNA 추출을 하였다. DNA 추출여부는 1.
- 염기서열 분석은 염기서열 분석 전문기관(Bionics, Korea)에서 수행되었으며, 계통분류학적 확인을 위한 16S rDNA의 염기서열 결과는 NCBI BLAST Search Database에서 검색된 염기서열 정보를 이용하였다. phylogenetic tree의 작성 작업은 Mega 4.
- pH 4를 제외한 모든 pH 조건(pH 5∼pH 9)에서 거의 같은 양의 기질(sucrose) 소비 및 균체 성장을 보였음에도 불구하고 수소생산 효율은 pH 5와 6에서 두드러지게 높게 나타났다. 이는 각 pH 조건에서 미생물의 군집에 변화가 있어 수소생산 효율도 영향을 미친 것으로 사료되며, 이러한 상관관계를 파악하기 위해서 미생물의 군집 해석을 실시하였다.
- 추출한 DNA template에서 16S rDNA의 가변 부위인 V3 region 증폭을 위해 서로 다른 2개의 primer sets을 사용하여 nested PCR을 실시하였다.
대상 데이터
- 사용된 칼럼은 6'×1/8'' stainless steel SS 350A (Molesieve 13X(80/100 mesh))이였으며 GC의 운전조건은 칼럼온도 80℃, injector 온도 100℃, 그리고 detector 온도는 100℃였으며, carrier gas는 질소이고 flow rate는 30mL/min로 유지하였다.
이론/모형
- Phylogenetic tree showing the relationship among the closest relatives in the GenBank databases and the isolates. The tree was produced using a neigbor-joining method. The bar indicates 5% sequence divergence.
- 염기서열 분석은 염기서열 분석 전문기관(Bionics, Korea)에서 수행되었으며, 계통분류학적 확인을 위한 16S rDNA의 염기서열 결과는 NCBI BLAST Search Database에서 검색된 염기서열 정보를 이용하였다. phylogenetic tree의 작성 작업은 Mega 4.0 software의 neighbor-joining method을 이용하였으며 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura2-parameter Model을 이용하였다. 또한 신뢰성 확보를 위해 1,000회의 bootstrap을 시행하였다.
- 배양액 내에 잔존하는 탄수화물을 정량하기 위하여 페놀-황산법14)으로 발색시킨 후 UV-Visible spectrophotometer(UV-1601, SHIMADZU)로 흡광도 파장 490 nm에서 측정하였다. 균체량(volatile suspendid solids)의 측정은 일정량의 배양액을 취하여 600 m에서 흡수된 광량을 기존에 건조중량으로 검량된 곡선에 대입하여 환산 측정하였다.
성능/효과
- 1) 혐기성 발효에 의한 수소 생산 시 최대 수소 생산량은 pH 5에서 관찰되었으며 이 때 수소 가스 생성량은 약 1.8 mol H2/mol substrate로 나타났다.
- 2) pH 3과 10에서 미생물의 성장은 관찰되지 않았으며 pH 5에서 pH 9까지는 기질의 소비 및 균체 성장이 비슷하게 진행되었음에도 불구하고 수소생산 효율은 pH 5와 6에서 두드러지게 높게 나타났다.
- 3) 16S rDNA의 PCR-DGGE 결과, 각 pH 조건에 따라 DGGE band pattern이 다양하게 나타났고 NCBI BLAST을 이용하여 분석한 결과 대부분 Klebsiella 속 미생물로 규명되었으며 pH 5와 6에서 독특하게 뚜렷하게 생성되었던 band는 Clostridium 속과 Streptococcus 속 미생물로 규명되었다.
- 4) 수소생산에 관여하고 있는 미생물로 Klebsiella 속 미생물과 Clostridium 속 미생물은 기존의 연구 결과에서 이미 보고되어 있었고 또 후속 연구가 진행되고 있으나 Streptococcus 속 미생물 또한 수소 생성에 미치는 영향이 크다는 것은 본 실험을 통하여 알 수 있었다. 따라서 수소의 생물학적 생산에 있어서 Klebsiella 속과 Clostridium 속 미생물과 더불어 Streptococcus 속 미생물에 후속 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 4는 DGGE 밴드로부터 판명된 미생물의 계통발생학적 유연관계를 도시한 결과이다. Klebsiella 속 미생물은 프로테오박테리아(Proteobacteria)에 속하며, Clostridium 속 미생물과 Streptococcus 속 미생물은 피르미쿠트(Firmicutes)에 속하는 세균인 것으로 분석되었다.22)
- pH 4를 제외한 모든 pH 조건(pH 5∼pH 9)에서 거의 같은 양의 기질(sucrose) 소비 및 균체 성장을 보였음에도 불구하고 수소생산 효율은 pH 5와 6에서 두드러지게 높게 나타났다.
- 2에 도식되지 않았다. pH 5와 6에서 비교적 왕성한 수소 발생 양상을 보였으며, 그 중 pH 5에서 최대 수소 생산을 보여 누적 수소 발생량은 총 1,182 mL로 나타났다.
- 결론적으로 본 실험에서 나타난 미생물 군집의 대부분의 종류는 Klebsiella 속 미생물이였으며, 그 중 수소생산 수율에 중요한 역할을 담당하는 미생물로는 Clostridium 속과 Streptococcus 속 미생물로 나타났다.
- 다양하게 분포되어 가시화된 DGGE band의 미생물 군집을 파악하기 위해 선명도가 높은 11개의 band를 sequence하여 NCBI BLAST을 이용하여 GenBank database와 비교 분석하여 가장 유사도가 높은 종을 검색한 결과 DGGE band로부터 얻은 clone 대부분은 Klebsiella 속(B, C, E, F, G, I, J 그리고 K) 미생물로 규명되었으며, 그 외 Escherichia coli (D) 미생물도 관찰되었으며 검색 결과를 Table 2에 요약 정리하였다.
후속연구
- 4) 수소생산에 관여하고 있는 미생물로 Klebsiella 속 미생물과 Clostridium 속 미생물은 기존의 연구 결과에서 이미 보고되어 있었고 또 후속 연구가 진행되고 있으나 Streptococcus 속 미생물 또한 수소 생성에 미치는 영향이 크다는 것은 본 실험을 통하여 알 수 있었다. 따라서 수소의 생물학적 생산에 있어서 Klebsiella 속과 Clostridium 속 미생물과 더불어 Streptococcus 속 미생물에 후속 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
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