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문제 정의
- 본 연구는 한우 번식우 사육 농가의 사육 기반을 저해하고 경제적인 손실을 입히는 번식장애 질환을 대상으로 번식장애 의 유형별 렙틴과 인슐린의 수치를 조사하고, BCS와 렙틴 및 인슐린의 상관 관계를 확인하며, 난소낭종이 있는 난소에서 난 포액의 인슐린 호르몬 농도 변화를 조사하고자 실시하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 한우 번식장애 질환과 신체충실지수에 따른 렙틴 및 인슐린의 농도변화를 확인하고, 렙틴 유전자형을 분석하여 번식장애, 신체충실지수와 관련성을 조사하였으며, 도 축된 한우 난소에서 난포의 크기에 따른 난포액의 인슐린 농 도 변화를 확인하였다.
- 렙틴 호르몬을 측정하기 위한 혈액은 항응고제가 첨가되지 않은 진공채혈관을 이용하여 경정맥으로 채취하였다. 채취된 혈 액은 원심분리기(Union5KR, Hanil, Korea)를 이용하여 3,000 rpm(222xg)에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석 시 까지 -20 에서 냉동보관하였다.
- 이후 Streptavidin-HRP Conjugated solution을 100 ul씩 첨가한 후 300 rpm으로 흔들어주면 서 실온에서 30분간 두었다. 세척용액으로 3번 세척 후 직접 적으로 빛에 노출되지 않도록 주의하면서 기질 용액을 100 ul 씩 첨가하였다. 플레이트는 10분간 실온에 놓아둔 후 100 ul 의 stop solution을 100 ul씩 첨가하였다.
- 플레이트는 10분간 실온에 놓아둔 후 100 ul 의 stop solution을 100 ul씩 첨가하였다. 이후 450 nm의 파장 에서 플레이트의 흡광도를 측정한 후 standard값을 이용하여 각 샘플의 렙틴 값을 구하였다. 인슐린 농도의 측정은 위에서 기술한 ELISA(Mercodia bovine insulin ELISA, MercodiaAB, Uppsala, Sweden) 방법 과 함께 형 광면 역 분석 법(DELFIA kit, PerkinElmer, Truku, Finland)을 제조사의 실험 과정에 따라 시 행하였다.
- 한우 렙틴 유전자의 exon 영역을 포함하는 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 이를 통해 검출된 SNP 부위를 인지 하는 제한 효소가 존재하는 exon 영역의 SNW에 대한 PCR-RFLP 분석을 실시하였다
- 정상적인 번식주기를 가진 후 임신된 개체를 정상축으로 하 고, 번식장애 질환인 저수태우, 난포낭종, 황체낭종, 난소위축, 미약발정을 가진 한우의 렙틴 농도와 신체충실지수에 따른 렙틴 농도는 Fig. 1과 같이 조사되었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 공시축은 농촌진흥청 축산과학원 가축유 전자원시험장에서 사육하고 있는 한우 번식우를 대상으로 하였으며, 번식장애의 유형은 저수태우, 난소낭종, 난소위축, 미 약발정 등으로 구분하였다.
- 난포액의 인슐린 농도 측정은 도축장에서 회수한 한우 난소에서 채취한 난포액을 냉동보관 후 측정 시 실온에서 융해하여 형광면역분석법(DELFIA* kit, PerkinElmer, Truku, Finland)을 이용하여 호르몬 농도를 측정하였다. 난포액의 구분은 직경 3-10 mm 내 • 외의 난포로부터 채취된 난포액은 정상 난포액, 11 —24 mm의 난포로부터 채취된 경증의 난포낭종(mild cystic follicle) 난포액, 25 mm 이상은 중증의 난포낭종 난포 액으로 규정하고(Einspanier 등, 1993) 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계학적 분석은 Student's /-test를 이용하여 처리구간의 유의성을 검정하였고3<0.05), 결과들은 평균 표 준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 채취된 혈 액은 원심분리기(Union5KR, Hanil, Korea)를 이용하여 3,000 rpm(222xg)에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석 시 까지 -20 에서 냉동보관하였다. 측정은 ELISA 방법(Mouse and Rat Leptin ELISA, BioVendor, Modrice, Czech Republic) 을 이용하였는데, 간략히 설명하면 각각의 well에 제공되어진 standards와 quality control을 100 ul씩 넣고 즉정하고자 하는 샘플은 희석 용액으로 10배 희석하여 100 ul씩 넣은 후 300 rpm 으로 교반시키면서 실온에서 1시간 두었다. 이후 플레이트는 각 well당 350 ul씩의 세척 용액을 넣어 3번을 세척한 후 희석 된 biotin이 결합된 렙틴 항체를 각 well당 100 ul씩 첨가하였다.
- 이후 450 nm의 파장 에서 플레이트의 흡광도를 측정한 후 standard값을 이용하여 각 샘플의 렙틴 값을 구하였다. 인슐린 농도의 측정은 위에서 기술한 ELISA(Mercodia bovine insulin ELISA, MercodiaAB, Uppsala, Sweden) 방법 과 함께 형 광면 역 분석 법(DELFIA kit, PerkinElmer, Truku, Finland)을 제조사의 실험 과정에 따라 시 행하였다.
- 난포액의 인슐린 농도 측정은 도축장에서 회수한 한우 난소에서 채취한 난포액을 냉동보관 후 측정 시 실온에서 융해하여 형광면역분석법(DELFIA* kit, PerkinElmer, Truku, Finland)을 이용하여 호르몬 농도를 측정하였다. 난포액의 구분은 직경 3-10 mm 내 • 외의 난포로부터 채취된 난포액은 정상 난포액, 11 —24 mm의 난포로부터 채취된 경증의 난포낭종(mild cystic follicle) 난포액, 25 mm 이상은 중증의 난포낭종 난포 액으로 규정하고(Einspanier 등, 1993) 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 신 등(2006)은 렙틴 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism) marker와 한우 도체 및 육질 관련 연관성을 분석하여 exon 2 영 역내 C1180T SNP가 한우 근내 지방도 및 등지방 두께와 유의적인 연관성을 가지고 있는 것으로 보고하였다. 즉, C/C 유전자형을 가진 개체들이 C/T 또는 T/T 유전자형을 가진 개체들에 비해 근내 지방도와 등지방 두께가 높은 값을 나타내었다. Kong 등(2006), Shin과 Chung (2007)도 C/C가 T/T보다 등지 방 두께 가 높고, 근내 지 방도도 C/C가 C/T와 T/T에 비해 높게 나타났다고 보고하였다.
- 임신 중인 한우와 비교하여 번식장애를 앓고 있는 한우에서 렙틴 농도는 유의한 차이를 보이지 않았지만3>0.05), 저수 태우는 임신우보다 렙틴 농도가 높은 경향을 보였고, 낭종성 질환(난포낭종, 황체낭종)이나 난소의 기능이 미약(난소위축, 미약발정)한 경우는 렙틴의 농도가 다소 낮은 경향을 보였다.
- BCS가 낮은 허약한 한우는 82.3%가 #형을 나타내는 반 면 비만한 한우는 62.5%가 C/C형을 나타내었으며, 보통의 BCS를 보이는 한우는 C/T 60%, C/C 20%, T/T 20%로 허 약하 거나 비만한 개체에 비해 비교적 고른 분포를 보였다
- 난포의 직경이 커짐에 따른 난포액의 인슐린 농도가 증가하는 경향을 보였으며, 특히 낭종성 난포에서는 유의적으로 높은 수치를 나타내었다3<0.05).
- 렙틴은 번식 기관의 영양상태를 알려주는 중요한 호르몬으로 서, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)을 활성화 시키고, 뇌하수체에서 황체호르몬(LH)의 분비를 자극하며(Smith 등, 2002), 임신 및 성성숙 관련 인자로서 작용하는 것으로 보고 되고 있다(Small 등, 2002; Chen, 2003). 본 실험에서도 번식 장애 질환의 종류별 렙틴의 혈중 농도가 약간씩 달리 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- Ciccioli 등(2003) 은 증체 량이 높은 육우는 BCS가 높아지면서 렙틴과 인슐린 의 수치도 올라간다고 보고하였고, Cavestany 등 (2008)은 분 만전 충분한 에너지 공급은 BCS를 높일 뿐만 아니라 렙틴과 인슐린의 수치도 높인다고 하였다. 본 실험에서도 위와 비슷한 결과를 나타내어 허약한 한우는 혈중 렙틴의 농도가 현저 히 떨어지는 것을 확인하였다.
- 본 실험에서는 C/T 유전자형이 미약발정에서 100%, 난소낭종에서 50%를 나타내어 이형접합형인 C/T 유전 자형의 번식장애 비율이 비교적 높게 나타내어 Heravi Moussavi 등(2006)의 결과와는 상이한 경향을 띄었고, 신체충실지수는 허 약한 한우는 이 형 접합체인 C/T형, 비만한 한우는 동형 접합 체인 C/C형이 높게 나타났다. 그러나 정 P&C 연구소(Sungnam, Gyeonggi, Korea)의 연구결과에 의하면 마블링이 높은 한우에서 동형접합 TT의 비율이 높게 나타났는데, 본 연구에서는 임신과 BCS 3.0~3.5에서 TT의 비율이 높게 나타났다. Seufert 등(1999)은 렙틴이 췌장 베타세포로부터 인슐린 분 비와 식습관을 통제하며 생산을 자극한다고 하였는데, 이는 비만증에서는 인슐린 저항성에 의한 고인슐린 혈증이 동반되어 있으며, 이러한 상태가 장기간 지속될 때는 렙틴 농도에 영향을 미친다고 하였다.
- 임신중인 한우와 번식장애가 있는 한우의 렙틴 농도는 수치 의 변화는 있으나 유의적인 차이를 나타내지는 않은 반면, 신 체충실지수가 낮아지면서 렙틴의 농도도 유의적으로 낮게 나타나는 것을 확인하였다(p<0.05). BCS에 따른 렙틴 유전자형 은 hetero 형인 C/T가 허약한 한우에서 83.
- 05). BCS에 따른 렙틴 유전자형 은 hetero 형인 C/T가 허약한 한우에서 83.3%를 나타낸 반면, 비 만인 한우에서는 반대로 homo 형 인 C/C가 62.5%로 높게 나 타났는데, 이는 신체충실지수와 비만유전자형과는 어느 정도 상관관계가 있는 것으로 추정할 수 있다. 난소의 기능이 미약 한 난소위축이나 미약발정을 보이는 한우의 경우 인슐린의 농도가 임신우나 저수태, 난소낭종을 보이는 한우에 비해 유 의적으로 낮게 나타났다3<0.
- 5%로 높게 나 타났는데, 이는 신체충실지수와 비만유전자형과는 어느 정도 상관관계가 있는 것으로 추정할 수 있다. 난소의 기능이 미약 한 난소위축이나 미약발정을 보이는 한우의 경우 인슐린의 농도가 임신우나 저수태, 난소낭종을 보이는 한우에 비해 유 의적으로 낮게 나타났다3<0.05). 난소에서 난포의 직경에 비 례하여 인슐린의 농도도 상승하는 것을 확인하였는데, 특히 난포낭종이 있는 난포액 의 인슐린 농도는 정상 수치 난포의 난 포액에 비해 유의적으로 높은 수치를 보였다(p<0.
- 05). 난소에서 난포의 직경에 비 례하여 인슐린의 농도도 상승하는 것을 확인하였는데, 특히 난포낭종이 있는 난포액 의 인슐린 농도는 정상 수치 난포의 난 포액에 비해 유의적으로 높은 수치를 보였다(p<0.05).
- 이상의 결과 한우 번식장애 질환의 종류에 따라 렙틴과 인 슐린의 수치가 다르며, 소의 영양상태를 판가름하는 신체충실 지수의 변화에 따라 렙틴과 인슐린의 농도가 상당한 변화를 보이고, 렙틴의 유전자형도 허약하거나 비만한 정도에 따라 그 분포가 달리 나타나는 것을 확인하였다.
- Heravi Moussavi 등(2006)은 이형 접합(heterozygous) 유전 자형이 동형접합(homozygous) 유전자형에 비해 번식성적이 뛰어난 반면, 신체중실지수(body condition score, BCS)와 체 중은 동형접합 유전자형이 이형접합 유전자형보다 약간 높은 수치를 나타낸다고 하였고, Chebel 등(2008)은 C/T 유전자형 을 가진 젖소가 낮은 BCS를 보이며, 질병발생 위험도 가장 낮게 나타나며, 우유 생산은 C/C 유전자형이 C/C와 C/T보다 적다고 하였다. 본 실험에서는 C/T 유전자형이 미약발정에서 100%, 난소낭종에서 50%를 나타내어 이형접합형인 C/T 유전 자형의 번식장애 비율이 비교적 높게 나타내어 Heravi Moussavi 등(2006)의 결과와는 상이한 경향을 띄었고, 신체충실지수는 허 약한 한우는 이 형 접합체인 C/T형, 비만한 한우는 동형 접합 체인 C/C형이 높게 나타났다. 그러나 정 P&C 연구소(Sungnam, Gyeonggi, Korea)의 연구결과에 의하면 마블링이 높은 한우에서 동형접합 TT의 비율이 높게 나타났는데, 본 연구에서는 임신과 BCS 3.
후속연구
- 본 연구에서 렙틴의 혈중 농도와 번식장애 사이에 유의한 차이를 보이지는 않았으나, 저수태우의 렙틴 농도가 비교적 높은 경향을 나타내고 있으므로, 비 만과 번식 장애 의 상관성 에 대해서는 좀 더 폭넓은 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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