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문제 정의
- 지표로 이용된다. 본 연구에서는 cTLI에 대한 신속 면역 크로마토그래피 진단 키트를 개발하기 위하여 cTLI를 인식하는 단클론 항체를 제작하였다.
- 정확한 진단과 더불어 보다 간편하고 저렴한 진단방법들이 많이 개발되고 있다. 본 연구에서는 개 췌장염 및 EPI의 진단법을 개발하기 위하여 개 트립신양 면역 반응성 단클론 항체를 제작하였다.
제안 방법
- (antigenic affinity)!: 알아보기 위해서 항원에 대한 친화 상수(affinity constant; Ka)< 구하였다n Ka 값은 해리상수 (dissociation constant; K)의 역수로서, 즉, Ka=이며 이들 匕 값은 Friquet 등(3) 고안한 간접적 경攻 ELISA (Indirect competitive ELISA)을 수행한 후, Klotz plot을 통해서 구하였다. Kd 값을 구하기 위해서 2배수로 희석된 단클론 항체 용액를 0.
- 간접 경쟁 ELISA를 이용하여 Klotz plot로 虬를 계산하였다. 그 결과는 Table 3에 나타내었다.
- 개 췌장으로부터 분리정제한 트립신양 면역활성 단백질과상층액 또는 복수로부터 정제한 단클론 항체를 Bradford assay를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의단백질 을 sample buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6.
- 개 췌장으로부터 키모트립신에 해당하는 약 23 kDa의 밴드, 양이온성 트립신과 음이온성 트립신에 해당하는 약 20 kDa 단백을 분리정제하였다. 이 트립신 유사 단백을 항원으로 사용하여 트립신 특이적 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 얻었다.
- 골수종 세포는 인공 배양시 계속적 배양을 가능하게 하는 기능을, 비장세포는 면역글로블린의 발현기능을 각각 분담하게 하였다. 골수종 세포(Sp2/0-Agl4)를 세포배양용 배지에서 배양하였으며 1회 세포융합에 필요한 세포수는 1 X IO, 개로 조정하였다.
- 65를 각각 나타내어 최초 췌장 균질화의 정제율에 비해 황산암모늄 분획단계에서는 4배 정제되었으며, 벤자미딘 친화 크로마토그래피를 수행한 이후에는 키모트립신은 108배, 양이온성 트립신은 128 배, 음이온성 트립신은 108배로 각각 정제되었다. 다음은 정제된 트립신들을 SDS-PAGE를 실시하여 분자량을 확인하였다(Fig 1). 각 정제 단계에서 얻어진 단백을 전기 영동한 결과, 트립신에 해당하는 20 kDa의 밴드가 존재하였으며, 정제 키모트립신을 전기 영동한 6번 lanee 23 kDa을 나타내었다.
- 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의단백질 을 sample buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 25% glycerol, 1, 44 mM 2-mercaptoethanol, 0.1%bromophenol blue)와 1:5로 혼합하여 10(FC에서 5분간 끊여 변성시켰다(1). 그 후, 변성시킨 시료를 10% 아크릴아마이드(acrylamide) 겔에 주입하고 1시간 동안 100 volt 전기로 전기 영동하였다.
- 2 주 후에는 동량의 트립신과 Freund's incomplete adjuvant와1:1로 섞은 후 마우스의 복강 내에 주사하고, 2주 후에 다시 마우스의 꼬리 정맥에 한번 더 주사하였다. 마지막 접종 2 일후 꼬리에서 채혈하여 항체가를 확인하기 위해 인산염 완충액에 희석하여(1/1000) ELISA 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 2 주 후에 다시 면역시켰다.
-
4) 복수(ascites)에서 항체의 생산
생후 6-8 주 된 마우스(BALB/C) 복강에 pristane(0.5-lml) 처리 후 1 주일째 되는 날 항체를 생산하는 하이브리도마를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여 마우스 한 마리당1-5 X 1046 *세 포를 0.5 ml 인산염 완충액에 현탁하여 복강에주사하였다. 1-2 주 후 복수를 채취하여 -7(FC 냉동고에서 보관하였다.
- 그리고 100 g로 2분간 원심분리한 후 5 ml의 RPMI 1640을 3분에 걸 쳐 넣 고 또 다시 5 ml의 RPMI 1640을 2분간 걸쳐 첨가하였다. 세포가 들어있는 용기에 10% fetal bovine seram (FBS)(Gibco) 첨가 RPMI1640을 충분히 첨가하였다. 200 g로 2.
- 단백을 분리정제하였다. 이 트립신 유사 단백을 항원으로 사용하여 트립신 특이적 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 얻었다. 그 중에서 Klotz plot에 의해 하이브리도마G2H10G4와 2F4A11은 각각 4.
- 0과 혼합하여, 샘플에 존재하는 불활성의 트립시노겐을 활성화시 키기 위해 enterokinase 용액 (lmg/ml, Sigma- Aldrich Co, MO, USA)을 첨가한 후 3TC에서 120 분간 배양하였다. 이어, Schwerte Takenal요(7)에 의한 방법으로 모든샘플에 존재하는 트립신의 활성을 확인하였다.
- gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 트립신의 분자량 및 순도를 검사하였다. 전기영동 후 겔은 은염색으로단백질 밴드를 확인하여 트립신의 분리 및 순도를 분석하였다.
- 트립신 활성을 지닌 분획은 sodium dodecylsulfate-polya- crylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 트립신의 분자량 및 순도를 검사하였다. 전기영동 후 겔은 은염색으로단백질 밴드를 확인하여 트립신의 분리 및 순도를 분석하였다.
- 5 M NaCl)으로 제거하였다. 트립신의 용출은 세척용액을 pH 3.25까지 낮춤으로 분획을 모으고 모든 분획으로부터 트립신 활성을 상기의 방법으로 확인하였다.
- 하이브리도마가 자라고 있는 96 well 세포배양용 용기에서 배지를 조금 취하여 ELISA 방법으로 항체를 생산하는 well 을 확인하고, 그 well의 세포를 회수하여 24 well 세포배양용 용기로 옮겨 하루 동안 배양한 후 세포를 회수하여 세포 수를 계산하였다. 그리고 RPMI 1640으로 제한희석하여 80 세포/ml이 되게 만든 후 feeder세포(마우스 흉선세포)가 깔린96 well 배양용기에 100E씩 첨가하여(0.
대상 데이터
- 하였다. 골수종 세포(Sp2/0-Agl4)를 세포배양용 배지에서 배양하였으며 1회 세포융합에 필요한 세포수는 1 X IO, 개로 조정하였다. 트립신을 면역시킨 마우스에서 비장을 제거하여혈청을 첨가하지 않은 세포배양용- 배지 RPMI 1640 (Gibco, Island, NY, USA)에 비장을 넣어 으깬 후 세포 혼탁액을용기에 담고 세포 잔해를 침전시켰다.
데이터처리
- 상온에서 1시간 반응시킨 후 이 반응 용액을 ELISA plate에 넣어 다시 37>C에서 1시간 반응시켰다. ELISA Reader로 A”o을 측정하여 값을 구하였다' 다음, ELISA 결과를 바탕으로 아래 식을 이용하여, Klotz plot을 실시하였다.
이론/모형
- 0) 용액을 용출액의 1/10 부피로 첨가해 주어 pH를 보정했으며 용출된 항체액을 농축한 후 150 mM 인산염 완충액에서 투석하였다. 투석이 끝나면 Bradford assay (iNtron Biotechnology)로 단백질의 양을 결정한 후 사용하였다.
성능/효과
- 다음은 정제된 트립신들을 SDS-PAGE를 실시하여 분자량을 확인하였다(Fig 1). 각 정제 단계에서 얻어진 단백을 전기 영동한 결과, 트립신에 해당하는 20 kDa의 밴드가 존재하였으며, 정제 키모트립신을 전기 영동한 6번 lanee 23 kDa을 나타내었다.
- 8x109의 값을 나타내었으며양이온성 및 음이온성 트립신 모두에 특이적이었다. 따라서5G2H10G4 및 2F4A11은 신속 면역크로마토그래피 진단 키트 개발시 capture 용 또는 conjugate 용으로 사용할 수 있을 것으로 보인다’ 특히 5F9H3은 개 양이온성 트립신에만 특이성이 높게 나타내어서 트립신의 양이온성 및 음이온성의 물리생화학적 분석에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다. Williams와 Batt(19)는 TLI 키트를 개발할 때 양이온성 트립신을 이용하였다.
- 본 연구에서 분리정제된 트립신 유사물질 중 양이온성 및 음이온성 트립신은 20 kDa의 밴드를 나타냈었으나 키모트립신은 23 kDa의 밴드를 보였다. 이것은 28 kDa의 키모트립신이 정제과정에서 자가활성화(autoactivation)에 의해 단백의 일부가 분해 되어 나간 것으로 추정된다.
- 즉 친화 상수는 해리상수(#)의 역수로써 K, 값이 #에서 #까지는 고친 화성을 나타내어서 면역반응에 적용이 기능하며, K값이 106에서 IO, 사이가 되면 낮은 친화성을 나타내어서 면역정제에 적용이 가능하다. 본 연구에서의 하이브리도마 중 5G2H10 G4 는 4.1 xlO9, 2F4A11은 1.8x109의 값을 나타내었으며양이온성 및 음이온성 트립신 모두에 특이적이었다. 따라서5G2H10G4 및 2F4A11은 신속 면역크로마토그래피 진단 키트 개발시 capture 용 또는 conjugate 용으로 사용할 수 있을 것으로 보인다’ 특히 5F9H3은 개 양이온성 트립신에만 특이성이 높게 나타내어서 트립신의 양이온성 및 음이온성의 물리생화학적 분석에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.
- 분비되는 것을 이용히-여 혈청내 트립신 농도를 방사 면역분석법으로 측정하는 TU를 소개한 것을 토대로(19)하여 최근까지 Waritani 등(12, 14)에 의해 TLI 측정기법이 개발되었다. 본연구 결과는 개 췌장으로부터 음이온성 트립신, 양이온성 트립신 및 키모트립신을 분리정제하여 이것을 항원으로 하여 고친 화성을 가진 단클론 항체를 제작에 성공함으로써 개 췌장염과 EPI에 대한 진단 키트를 제작할 수 있는 길을 열고 있다.
- 특히 TLI의현저한 증가는 개와 고양이의 급성 췌장염의 좋은 지표가 될 수 있어 진단적 가치가 높다(10). 이상의 관찰에서 혈액 중의 트립신과 트립시노겐의 농도를 측정하는 TLI 측정은 EPI 및 췌장염 진단에 매우 신뢰 있는 방법임을 보여준다.
- 제작된 개 트립신에 특이적인 항체를 분비하는 하이브리도마는 Table 2에 나타내었다. 하이브리도마 5G2H10G4는 IgG class를 보였으며 흡광도 450에서 단백 mg당 음이 온성 트립신 활성은 2.58, 양이온성 트립신 활성은 1.73을 나타내었으며 키모트립신 활성은 낮았다(0.38). 마찬가지로 2F4A11 는 IgGs였으며 음이온성 트립신 활성은 1.
- 006 정도의 특이 활성을 보였다. 황산암모늄으로 분획한 후에는 0.025의 활성을 나타내었으며, 벤자미딘 친화성 colum 을 통과 한 후의 키모트립신 활성은 0.65, 양이온성 트립신 활성은 0.77, 음이온성 트립신 활성은 0.65를 각각 나타내어 최초 췌장 균질화의 정제율에 비해 황산암모늄 분획단계에서는 4배 정제되었으며, 벤자미딘 친화 크로마토그래피를 수행한 이후에는 키모트립신은 108배, 양이온성 트립신은 128 배, 음이온성 트립신은 108배로 각각 정제되었다. 다음은 정제된 트립신들을 SDS-PAGE를 실시하여 분자량을 확인하였다(Fig 1).
후속연구
- 결론적으로 혈액중의 트립신 농도를 측정하는 TLI 기법을 활용함은 개 췌장염 진단에 가장 좋은 진단방법이며, 고친화상수를 가지고 있는 5G2H10G4, 2F4A11 및 5F9H3 항체는 췌장염 진단 키트에 유용하게 응용될 수 있을 것으로 보이며 이들을 이용하여 신속 면역크로마토그래피법 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 본 연구에서 제작된단 클론 항체를 이용하여 진단 키트를 개발하려면 그것의 감수성과 정확성을 평가하는 것은 물론, 실제 췌장염 및 EPI 개에 임상적용을 실시하는 중요한 과제가 남아있다.
- 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 본 연구에서 제작된단 클론 항체를 이용하여 진단 키트를 개발하려면 그것의 감수성과 정확성을 평가하는 것은 물론, 실제 췌장염 및 EPI 개에 임상적용을 실시하는 중요한 과제가 남아있다.
- 특히 5F9H3 항체는 양이온성 트립신에 특이적으로 반응하였으며 친화상수는 #이었다. 본 연구에서 제작한 cTLI에 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 이용하여 신속면역크로마토그래피 진단 키트를 개발하게 된다면 개 췌장염과 EPI의 진단에 매우 유용하게 적용될 것으로 기대된다.
- Williams와 Batt(19)는 TLI 키트를 개발할 때 양이온성 트립신을 이용하였다. 본 연구에서도 5F9H3로부터 양이온성 트립신을 분리정제하여 단클론 항체를 생산하였으며 이는 개 양이온성 트립신 진단 키트 개발에 활용할 수 있을 것으로 보인다. 사람에 있어서는 요중에 검출되는 음이 온성 트립신을 급성 췌장염의 지표로 활용하고 있기 때문에(4) 5G2H10G4 및 2F4A11의 단클론 항체를 이용하여 급성 췌장염 진단 키트 개발을 하면 개의 요중 TLI 측정도 췌장염 진단에 도움이 될 것으로 보인다.
- 본 연구에서도 5F9H3로부터 양이온성 트립신을 분리정제하여 단클론 항체를 생산하였으며 이는 개 양이온성 트립신 진단 키트 개발에 활용할 수 있을 것으로 보인다. 사람에 있어서는 요중에 검출되는 음이 온성 트립신을 급성 췌장염의 지표로 활용하고 있기 때문에(4) 5G2H10G4 및 2F4A11의 단클론 항체를 이용하여 급성 췌장염 진단 키트 개발을 하면 개의 요중 TLI 측정도 췌장염 진단에 도움이 될 것으로 보인다.
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