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문제 정의
- 본 연구는 외래 유전자의 성공적인 전이를 위한 효율적인 retrovirus vector system을 구축하여 고가의 생리활성물질인 hTPO를 생산하는 생체 반응기로서의 형질전환 닭을 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서는 stage X (Eyal-Giladi와 Kochav, 1976) 시기의 배반엽층에 virus를 미세주입한 후 대리난각 방법 (Petitte와 Mozdziak, 2002)을 이용하여 배아를 배양하고자 하였다. 먼저 대리난각으로 이용하기 위한 계란 은둔 단부를 직경 3.
- 등이 있다. 본 연구에서는 이 방법 중 기술적인 용이성과 높은 유전자 전이의 효율성을 가진 retrovirus vector system을 이용하여(Kwon 등, 2004) 형질전환 닭을 생산하는 방법을 확립하고 나아가 사람의 TPO를 발현하는 형질전환 닭의 생산에 최종 목적을 두었다. Virus vector에 의한 유전자 전이에 있어서 가장 문제시되는 생물학적 안정성의 확보는 oncogene 서열이 완전히 제거된 virus vector를 사용하고 표적세포의 genome에 삽입 되었을 경우에 발생할 수 있는 homological recombination0] 일어나지 않도록 상이한 종의 virus vector를 사용하였다(Kim, 2002).
제안 방법
- ELISA 분석은 2월령의 형질전환 닭에서 채취한 혈액의 혈장만을 분리하여 원액에서부터 2배수로 단계적으로 희석한 후 Human Tpo Quantikine ELISA kit (R&D systems, USA)을 사용하여 실시하였다. 분석 과정은 세포에서 발현된 "TP。의 측정과 동일한 방법으로 진행하였다.
- transfection하였다. PT67에서 생산된 virus는 Moloney murine leukemia virus의 과 pol 유전자가 발현되는 GP2 293 (Clontech, USA) 세포에 감염시켜서 G418 (800 ug/m1) 이 첨가된 배양액에서 2주간 배양하여 GP2 293-LNCTPOW 세포주를 구축하였다. 이 세포주에 VSV- G 유전자를 가진 pVSV-G (Clontech, USA) plasmid를 일시적으로 transfection하여 48시간 후에 virus 배양액을 수확하였다.
- 부화를 시작하지 않은 stage X 시기의 배아를 가진 종란을파각하여 내용물을 대리난각으로 옮긴 후 본 연구실에서 개량한 manipulator와 특수가공한 microinjection pipette (SIGMA, pipette, microcapillary, 50 pl, 100 mm length)을 이용하여 10 ug/ml 농도로 polybrene0] 첨가된 virus stock 3 μ1를 계란의 배반엽증에 미세 주입하였다. Virus의 주입이 끝난 후 배양 전날 준비해 둔 가온한 수 양성 난백으로 대리난각을 완전히 채운 후 vinyl wrap 으로 밀봉하여 37.5℃의 온도와 상대 습도 60% 조건의부화기에 입란하여 15분 주기로 90° 각도로 전란 시키면서 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 종란의 무게보다 약 25g 정도 더 무거운 계란을 선별하여 둔단부를 4 cm 직경으로 절단한 대리난각으로 내용물을 모두 옮겼다.
- hTPO 의 생물학적 활성 측정에 주로 사용되는 거핵모구세포주 (megakaryoblastic cell line) 인 Mo7e (Avanzi 등, 1988) 세포를 96 well microplate의 각 well에 3x10, 개씩 seed- ing한 후 대조구로 사용하기 위한 재조합 hTPO 단백질 (R&D system, USA)과 동량의 hTPO가 포함된 각 세포의 배양액을 2배씩 단계적으로 희석하여 각 well에 50 μ1씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. hTPO에 의한 Mo7e 세포의 증식 활성을 확인하기 위하여 Cell Proliferation Kit I (Roche, Germany)를 사용하여 MIT assay를 실시하였다.
- 구축한 각 세포주의 배양액을 수확하여 0.22 um의 pore size를 가진 cellulose acetate filter로 여과한 후 100 μ1를 덜어내어 2배씩 단계적으로 희석하여 Human Tpo Quantikine ELISA kit (R&D systems, USA)을 사용해서 정량을 실시하였다. 먼저 여러 단계의 농도로 희석한 standard 와 각 sample을 plate 의 각 well 에 200 μ1씩 넣어서 실온에서 3시간 방치한 후 wash buffer로 4회 수세하였다.
- 하였다. 먼저 대리난각으로 이용하기 위한 계란 은둔 단부를 직경 3.4 cm로 절단하여 증류수로 수세한 후건 조 시켜 두었다. 본 실험에 사용된 유정란은 하이 브라운 산란계종으로, 60±3g 무게의 종란을 선택하였다.
- 각 well에 10 μ1의 MTT labelling reagent를 더해준 후 4시간동안 반응시킨 후 100 μ1의 solubilization solution을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 16시간 방치하였다. 반응이 종결된 plate를 microplate reader를 이용하여 595 run의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 본 실험은 3회 반복 실시하였다.
- 19일째부터는 계란을 37℃의 온도와 상대 습도 75% 조건의 발생기로 옮긴 후전란하지 않는 상태에서 부화할 때까지 배양하였다. 배양하는 동안 3U 18일, 21일째에 계란의 발생 진행 여부와 부화율을 관찰하였다.
- 본 실험에서 사용한 pLNCTPOW vector는 CMV pro- moter의 조절 하에 hTPO 유전자가 위치하고 외래 유전자의 발현 촉진을 위한 WPRE 서열이 보완된 구조로서 다음과 같은 과정에 의해 구축되었다. 본 연구실에서 보유하고 있는 pGEM-hTPO vector를 EcoR I 과 Klenow fragment 그리고 HindHI로 처리하여 hTPO 단편을 분리한 후 이를 Hpa I 과 HindⅢ를 처리한 pLNCXW와 재조합하였으며 전체적인 구조는 Fig.
- 각 well에 200 ill의 anti-hTPO-HRP conjugate 를 더한 후 실온에서 1시간 방치한 후 wash buffer로 4 회 수세하였으며, 200 μ1의 tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution을 각 well에 더하여 빛을 차단시킨 상태로 실온에서 30분간 방치한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험은 3회 반복 실시하였다.
- 같은 과정에 의해 구축되었다. 본 연구실에서 보유하고 있는 pGEM-hTPO vector를 EcoR I 과 Klenow fragment 그리고 HindHI로 처리하여 hTPO 단편을 분리한 후 이를 Hpa I 과 HindⅢ를 처리한 pLNCXW와 재조합하였으며 전체적인 구조는 Fig. [과 같다.
- 본 실험에 사용된 유정란은 하이 브라운 산란계종으로, 60±3g 무게의 종란을 선택하였다. 부화를 시작하지 않은 stage X 시기의 배아를 가진 종란을파각하여 내용물을 대리난각으로 옮긴 후 본 연구실에서 개량한 manipulator와 특수가공한 microinjection pipette (SIGMA, pipette, microcapillary, 50 pl, 100 mm length)을 이용하여 10 ug/ml 농도로 polybrene0] 첨가된 virus stock 3 μ1를 계란의 배반엽증에 미세 주입하였다. Virus의 주입이 끝난 후 배양 전날 준비해 둔 가온한 수 양성 난백으로 대리난각을 완전히 채운 후 vinyl wrap 으로 밀봉하여 37.
- 부화한 병아리로부터 채취한 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리는 G-DEX II genomic DNA extraction kit (Intron Biotechnology, Korea)을 이용하여 실시하였다. PCR 반응에 사용한 각 primer의 서열은 다음과 같다.
- 이 세포주에 VSV- G 유전자를 가진 pVSV-G (Clontech, USA) plasmid를 일시적으로 transfection하여 48시간 후에 virus 배양액을 수확하였다. 생산된 virus는 소의 태아섬유아세포인 BFF, 닭의 배아섬유아세포인 CEF, 사람의 자궁경 부암세포인 HeLa, 생쥐의 배아섬유아세포인 NIH3T3, 그리고 돼지의 태아 섬유아세포인 PFF 세포에 감염시켜서 600 ug/ml의 G418이 첨가된 배양액으로 2주간 선별하여 외래 유전자가 전이된 각각의 세포주를 확립하였다.
- 2). 이 양을 기준으로 대조 구인 재조합 hTPO와 동량의 hTPO가 포함되도록 각 세포배양액을 희석하여 Mo7e 세포 배양에 공급한 후 세포의 증식 촉진 정도를 측정하여 생물학적 활성을 조사하였다. 대조구와 세포 배양액의 hTPO는 모두 0.
대상 데이터
- 4 cm로 절단하여 증류수로 수세한 후건 조 시켜 두었다. 본 실험에 사용된 유정란은 하이 브라운 산란계종으로, 60±3g 무게의 종란을 선택하였다. 부화를 시작하지 않은 stage X 시기의 배아를 가진 종란을파각하여 내용물을 대리난각으로 옮긴 후 본 연구실에서 개량한 manipulator와 특수가공한 microinjection pipette (SIGMA, pipette, microcapillary, 50 pl, 100 mm length)을 이용하여 10 ug/ml 농도로 polybrene0] 첨가된 virus stock 3 μ1를 계란의 배반엽증에 미세 주입하였다.
- 이 WERE 서열은 본 연구자의 발표 논문에서 이미 단백질 발현의 촉진에 큰 영향을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, GFP 유전자가 전이된 형질전환 닭의 생산 연구에도 사용되었다(Koo 등, 2006; Kwon 등, 2008). 본 연구의 수행에 있어서 외래 유전자가 전이될 표적세포는 기술적인 용이성 때문에 갓 산란된 계란(stage X)의 배반엽세포로 한정하였다. 조류의 수정란은 수정 후부터 산란 직후까지 계속 분열하기 때문에 stage X 계란의 배반엽은 이미 60, 000개 이상의 세포로 구성되어 있는데(Eyal- Giladi 등, 1981), 고농도의 virus stock을 사용하지 않을 경우 높은 mosaicism으로 인해 형질전환 닭의 생산율은 현저히 낮아지게 된다.
- 실험에 사용한 모든 세포들은 37笆, 5% CCh 조건에서 배양하였으며, 4.5 g/1 glucose (GibcoBRL, USA), 10% fetal calf serum (Hyclone, USA), 100 U/ml 의 penicillin 과 100 pg/ml 의 streptomycin (Hyclone, USA) 이 포함된 Dul- becco's Modified Eagle Medium (DMEM; Hyclone, USA) 배지에서 배양하였다.
- 이와 같이 미미한 성공 사례의 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현되므로 인해 발생하는 형질전환 동물의 생리적인 부작용 때문으로 요약할 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 연구에서는 생체 반응기의 대상으로 포유류 대신 가금을 선택하였다. 생체 반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성 성숙 기간과 세대 간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300여개의 계란을 생산) 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다(Han 등, 1994; Naito 등, 1994).
이론/모형
- Retrovirus를 생산하기 위하여 구축한 vector는 Gibbon ape leukemia virus의 피막 유전자가 발현되는 PT67 (Clontech, USA) 포장세포에 calcium phosphate 방법으로 transfection하였다. PT67에서 생산된 virus는 Moloney murine leukemia virus의 과 pol 유전자가 발현되는 GP2 293 (Clontech, USA) 세포에 감염시켜서 G418 (800 ug/m1) 이 첨가된 배양액에서 2주간 배양하여 GP2 293-LNCTPOW 세포주를 구축하였다.
- Quantification of hTPO levels secreted from bovine fetal fibroblasts (BFFs), chicken embryonic fibroblasts (CFFs), human cervical carcinoma cells (HeLa), mouse embryonic fibroblasts (NIH- 3T3), and porcine fetal fibroblasts (PFFs) infected with LNCIPOW. The concentration of the hTPO released into the medium was determined by ELISA as described in the Materials and Methods. The data were obtained from experiments performed in triplicate and are presented as the mean+SD.
- hTPO 의 생물학적 활성 측정에 주로 사용되는 거핵모구세포주 (megakaryoblastic cell line) 인 Mo7e (Avanzi 등, 1988) 세포를 96 well microplate의 각 well에 3x10, 개씩 seed- ing한 후 대조구로 사용하기 위한 재조합 hTPO 단백질 (R&D system, USA)과 동량의 hTPO가 포함된 각 세포의 배양액을 2배씩 단계적으로 희석하여 각 well에 50 μ1씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. hTPO에 의한 Mo7e 세포의 증식 활성을 확인하기 위하여 Cell Proliferation Kit I (Roche, Germany)를 사용하여 MIT assay를 실시하였다. 각 well에 10 μ1의 MTT labelling reagent를 더해준 후 4시간동안 반응시킨 후 100 μ1의 solubilization solution을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 16시간 방치하였다.
- 조류의 수정란은 수정 후부터 산란 직후까지 계속 분열하기 때문에 stage X 계란의 배반엽은 이미 60, 000개 이상의 세포로 구성되어 있는데(Eyal- Giladi 등, 1981), 고농도의 virus stock을 사용하지 않을 경우 높은 mosaicism으로 인해 형질전환 닭의 생산율은 현저히 낮아지게 된다. 이를 해결하기 위하여 본 연구에서는 1, 000배 이상의 농도로 virus의 농축이 가능하고 감염성의 손실이 전혀 없는 것으로 확인된 VSV-G pseudotyped retrovirus vector system (Bums 등, 1993)을 사용하였다.
- hTPO 유전자의 전이를 위한 retrovirus vector는 MoMLV 유래의 vector로서 초기 배 발달에 있어서 cytosine 잔기의 de novo methylation에의한 LTR promoter의 불활성에 의하 유전자 발현의 silencing이 문제시되고 있다(Jalmer 등, 1982; Mizuarai 등, 2001). 이를 해결하기 위하여 본 연구에서는 internal promoter인 CMV promoter를 사용하였으며, 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE (Zufferey 등, 1999) 서열을 도입하였다. 이 WERE 서열은 본 연구자의 발표 논문에서 이미 단백질 발현의 촉진에 큰 영향을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, GFP 유전자가 전이된 형질전환 닭의 생산 연구에도 사용되었다(Koo 등, 2006; Kwon 등, 2008).
성능/효과
- 이러한 현상은 배아에 배지를 주입하는 과정에서 생기는 물리적인 충격에 의한 발생 효율의 저하에 의한 것으로 추정된다. LNC- TPOW virus를 주입한 실험군에서는 약 8.3%의 저조한 부화율을 나타내었는데(Table 1), 이는 virus의 미세주입에 의한 물리적인 영향뿐만 아니라 전이된 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용도 원인으로 작용한 것으로 보인다.
- LNChTPOW virus에 감염된 각 세포 배양액을 수확하여 ELISA를 이용하여 hTPO 농도를 측정한 결과, CEF 에서 13.5 iig/ml의 가장 높은 농도를 나타내었으며, 다른 일차 배양세포인 BFF오+ PFF에서는 각각 0.98 pg/ml 와 0.88 ug/ml의 상대적으로 저조한 농도를 보였다(Fig. 2). NIH3T3에서는 7.
- hTPOS[ neomycin 저항성 유전자, 그리고 GAPDH 유전자에 대한 PCR을 실시한 결과, 부화한 11마리 중 4마리의 병아리가 형질전환 개체로 확인되어 약 36.4%의 형질 전환율을 나타내었다(Table 1; Fig. 4). 4마리(No.
- 1 ng/ml 이상의 농도에서 Mo7e 세포의 증식을 촉진하기 시작하는 것으로 확인되었다. 대부분의 세포에서 생산된 hTPO는대조구로 사용한 재조합 hTPO보다 생물학적 활성이 우월한 것으로 확인되었으며, 특히 CEF-LNCTPOW에서 발현된 hTPO는 현저하게 높은 활성을 나타내었다(Fig. 3). 즉, 가장 높은 생물학적 활성을 나타낸 CEF-LNCTPOW 의 hTPO와 대조구로 사용한 재조합 hTPO를 동량으로 첨가하여 Mo7e 세포의 증식 촉진 정도를 비교해 본 결과, 대조구 hTPO에 비해 세포에서 발현된 hTPO가 매우 높은 증식 촉진 현상을 보였다(Fig.
- 이 양을 기준으로 대조 구인 재조합 hTPO와 동량의 hTPO가 포함되도록 각 세포배양액을 희석하여 Mo7e 세포 배양에 공급한 후 세포의 증식 촉진 정도를 측정하여 생물학적 활성을 조사하였다. 대조구와 세포 배양액의 hTPO는 모두 0.1 ng/ml 이상의 농도에서 Mo7e 세포의 증식을 촉진하기 시작하는 것으로 확인되었다. 대부분의 세포에서 생산된 hTPO는대조구로 사용한 재조합 hTPO보다 생물학적 활성이 우월한 것으로 확인되었으며, 특히 CEF-LNCTPOW에서 발현된 hTPO는 현저하게 높은 활성을 나타내었다(Fig.
- 본 연구에서 발현시킨 hTPO의 생물학적 활성은 시판되고 있는 대조구에 비해 매우 우월한 활성을 나타내는 것으로 확인된데 비해 Kodama 등(2008)이 보고한 형질전환 닭에서 발현시킨 cytokine 일종인 hEPO의 생물학적 활성 측정에 관한 연구 결과에서는 시판되고 있는 재조합 hEPO에 비해 거의 유사하거나 조금 우월한 정도의 활성을 나타내었다.
- 여러 조건에서 부화한 각 병아리들의 부화율을 확인한 결과, 대리난각만 실시한 대조군에서는 90%의 부화율을 나타내었으며, DMEM 배지만을 주입한 실험군에서는 약 30%의 부화율을 나타내었다(Table 1). 이러한 현상은 배아에 배지를 주입하는 과정에서 생기는 물리적인 충격에 의한 발생 효율의 저하에 의한 것으로 추정된다.
- 3). 즉, 가장 높은 생물학적 활성을 나타낸 CEF-LNCTPOW 의 hTPO와 대조구로 사용한 재조합 hTPO를 동량으로 첨가하여 Mo7e 세포의 증식 촉진 정도를 비교해 본 결과, 대조구 hTPO에 비해 세포에서 발현된 hTPO가 매우 높은 증식 촉진 현상을 보였다(Fig. 3-A). 이는 동일한정 도의 Mo7e 세포 증식 촉진을 유도할 경우 세포에서 발현된 hTPO가 대조구 hTPO에 비해 훨씬 적은 양이 요구됨을 의미한다.
후속연구
- 이와 유사한 현상으로는 본 연구실에서 생산한 hG-CSF 형질전환 닭의 경우에도 부화 후 1개월 내에 폐사하였으며 (Kwon 등, 2008), hEPO가 발현된 형질전환 토끼에서도 여러가지 비정상적인 생리적 현상이 보고되었다(Mass oud 등, 1996). 따라서 앞으로의 연구에서는 외래 유전자의 발현을 시기적, 조직적, 인위적으로 조절하기 위한 발현 조절 system의 구축에 주안점을 두어야 할 것으로 사료된다. 이상의 여러가지 인자들이 포함된 hTPO 형질전환 닭의 생산에 관한 여러 연구 결과는 차후 형질전환 가금을 비롯한 여러 동물의 생산에 있어서 매우 중요한 분자생물학적, 생리학적 정보와 기술을 제공할 수 있을 것이다.
- 생산된 형질전환 닭 4마리 중에서 3마리가 생후 1개월 내에 특이한 병인이 나타나지 않고 폐사를 하였는데, 이는 기존의 특정 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 생리적인 부작용에 원인이 있거나(Ebert 등, 1988) 개체에 대한 사양 관리의 미비에 의한 것으로 추정되며 보다 정확한 폐사 원인은 추가적인 실험을 통해 알 수 있을 것이다. 이와 유사한 현상으로는 본 연구실에서 생산한 hG-CSF 형질전환 닭의 경우에도 부화 후 1개월 내에 폐사하였으며 (Kwon 등, 2008), hEPO가 발현된 형질전환 토끼에서도 여러가지 비정상적인 생리적 현상이 보고되었다(Mass oud 등, 1996).
- 따라서 앞으로의 연구에서는 외래 유전자의 발현을 시기적, 조직적, 인위적으로 조절하기 위한 발현 조절 system의 구축에 주안점을 두어야 할 것으로 사료된다. 이상의 여러가지 인자들이 포함된 hTPO 형질전환 닭의 생산에 관한 여러 연구 결과는 차후 형질전환 가금을 비롯한 여러 동물의 생산에 있어서 매우 중요한 분자생물학적, 생리학적 정보와 기술을 제공할 수 있을 것이다.
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