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문제 정의
- 본 연구에서는 돼지 0-casein을 이용한 EGFP 발현 knock-in 벡터을 구축하고 HC11 세포에서 정상적으로 EGFP를 발현하는지 검정하여 Knock-in 벡터의 이용 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 돼지 P-casein 유전자 영역을 이용하여 EGFP을 발현시킬 수 있는 knock-in 벡터를 구축하였고 이 벡터가 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에서 EGFP을발현시킴을 확인하였다. 일반적인 형질전환동물의 발현은 유전자 도입 위치 및 발현 벡터의 구조 등에 따라 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Houdebine 등, 2002).
제안 방법
- 5U i-Max II DNA polymerase(Intron, Korea), IxPCR-buffer, 200 uM dNTP 조성으로 denaturation 94 ℃ 30초, annealing 63 ℃ 30초, extension 72 ℃ 7분 30초, 30 cycle의 반응 조건으로 long PCR을 수행하였다. PCR 산물은 0.8% agarose gel에서 전기영동하" 확인하였으며 pGEM T-easy 벡터 (Promega, USA)에 subcloning 하여 염기배열을 결정하였다.
- EGFP 유전자 뒤에 SV40poly A를 연결하기 위해 PCR에 의해 subcloning 되어 있는 SV40- poly A plasmid를 Xhol - EcoRV로 절단하여 insert를 준비하였고, pBSK+5' arm+EGFP plasmid을 Notl - Sull으로 절단하由 insert를 준비한 후 pBSK+/NofI-EcoRV 벡터에 3 fragment ligation을 하여 pBSK+5' arm+EGFP+poly- A plasmid를 구죽하였다.。-casein 3' 부분을 knock-in 벡터에 이용하기 위해 B-casein genomic DNA의 intron 4 에 존재하고 있는 PstI과 intron 7에 존재하고 있는 Xbal enzyme site를 이용하였다. p -casein 3' 부분을 PstI과 Xbal로 절단하여 생성된 약 2.
- PCRe 동정된 돼지。-casein genomic DNA 을 주형으로 이용하여 genomic DNA 동정과 동일한 조건의 PCR 조건을 사용하였다.
- 이렇게 준비된 단편은 pBSK+/NotI-Sall 벡터에 3 fragment ligation을 실시하여 pBSK+5' arm+EG- FP plasmid를 얻었다. EGFP 유전자 뒤에 SV40poly A를 연결하기 위해 PCR에 의해 subcloning 되어 있는 SV40- poly A plasmid를 Xhol - EcoRV로 절단하여 insert를 준비하였고, pBSK+5' arm+EGFP plasmid을 Notl - Sull으로 절단하由 insert를 준비한 후 pBSK+/NofI-EcoRV 벡터에 3 fragment ligation을 하여 pBSK+5' arm+EGFP+poly- A plasmid를 구죽하였다.。-casein 3' 부분을 knock-in 벡터에 이용하기 위해 B-casein genomic DNA의 intron 4 에 존재하고 있는 PstI과 intron 7에 존재하고 있는 Xbal enzyme site를 이용하였다.
- EGFP 유전자는 pEGFP-N3 벡터 (Clontech, USA)를 이용하여 PCR에 의하여 동정하였다. PCRe pEGFP-N3 벡터 DNA 10 pg, 20 pmol 의 sense (AAGCTTCGAATTC- TGCAGTC) primer와 antisense(CTCGAGTTACTTGTA- CAGCT) primer, bPCR-buffer, 0.
- Subcloning된 DNA를 PstL으로 절단 후 blunuting 시키고 Sall Linker를 연결한 후 Xg으로 절단하여 이 fragment# pBSK +/Sa/I - Xbal 벡터에 연결하였다. Enzyme site가 Psfl에서 Sall로치환된 것을 확인한 후 Xbal site를 XTsI으로 치환하는 과정을 수행하였다. 이 과정을 통해 pBSK +/SalI - Xhd 벡터에 |3-casein 3'가 연결된 plasmid를 얻었다.
- Transfection 24시간 후에 G- 418 300 ug/ml가 포함된 배지로 교체하였고, 3일마다 배지를 교체하면서 EGFP가 발현하는 것을 형광현미경을 통해 확인하였다. Knock-in 벡터의 transfection 효율을 확인하기 위한 control DNA로 pEGFP-N3(Clontech/ USA) 를 사용하여 EGFP 발현을 형광현미경을 통해 확인하였다
- AY452035) 과 c- DNA 분석 결과를 바탕으로 primer를 제조하여 long PCR을 수행하였다. PCR primer는 돼지 p -casein promoter 상류 sense (CCCACTATTrCCTGATTCITGATrA- ACTTT) primer, beta-casein exon 6으로 주정되는 anti- sense(TGTTGTTCCTCCCGCTTTAGCTTCTCAATT) primer, exon 2를 포함하는 sense(GACTTGATCGCCAT- GAAGCTCCTCATCCTT) primer와 마지막 exon 9를 포함하는 antisense(GCCTAAGGATTAATTrATrGAAATG- ACTGG) primer를 사용하였다. PCRe 돼지의 태아섬유아세포어[서 회수된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 10 pmol의 sense 및 antisense primer, 0.
- 5 U Taq polymerase (Promega, USA), 각 200 uM dNTP 조성으로 denaturation 94 ℃ 30초, annealing 60 ℃ 30초, extension 72 ℃ 1 분, 35cycle의 반응 조건에서 수행하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였으며, pGE- M T-easy 벡터(Promega, USA)에 subcloning 하1셔 염기 배열을 결정하였다.
- 5U Taq polymerase(Promega, USA), 각 200 uM dNTP을 이용하여 실시하였으며 PCR 반응 조건은 denaturation 94 ℃ 30초, annealing 50 ℃ 30초, extension 72 ℃ 40 초, 40 cycle 수행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였으며, 염기서열 결정을 위하여 pGEM T-easy 벡터(Promega, USA)에 subcloning 하였다.
- 의하여 동정하였다. PCRe NCBI에 보고된 돼지 p casein promoter region(accession No. AY452035) 과 c- DNA 분석 결과를 바탕으로 primer를 제조하여 long PCR을 수행하였다. PCR primer는 돼지 p -casein promoter 상류 sense (CCCACTATTrCCTGATTCITGATrA- ACTTT) primer, beta-casein exon 6으로 주정되는 anti- sense(TGTTGTTCCTCCCGCTTTAGCTTCTCAATT) primer, exon 2를 포함하는 sense(GACTTGATCGCCAT- GAAGCTCCTCATCCTT) primer와 마지막 exon 9를 포함하는 antisense(GCCTAAGGATTAATTrATrGAAATG- ACTGG) primer를 사용하였다.
- 동정하였다. PCRe pCMV-Tagl 벡터 DNA는 10 pg, 20 pmol 의 sense (AAGCTTATCGATACCGTCGA) primer 와 antisense (GGGCCCTTAAGATACATTGATGAG) primer, bPCR- buffer, 0.5U Taq polymerase(Promega, USA), 각 200 uM dNTP을 이용하여 실시하였으며 PCR 반응 조건은 denaturation 94 ℃ 30초, annealing 50 ℃ 30초, extension 72 ℃ 40 초, 40 cycle 수행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였으며, 염기서열 결정을 위하여 pGEM T-easy 벡터(Promega, USA)에 subcloning 하였다.
- PCR primer는 돼지 p -casein promoter 상류 sense (CCCACTATTrCCTGATTCITGATrA- ACTTT) primer, beta-casein exon 6으로 주정되는 anti- sense(TGTTGTTCCTCCCGCTTTAGCTTCTCAATT) primer, exon 2를 포함하는 sense(GACTTGATCGCCAT- GAAGCTCCTCATCCTT) primer와 마지막 exon 9를 포함하는 antisense(GCCTAAGGATTAATTrATrGAAATG- ACTGG) primer를 사용하였다. PCRe 돼지의 태아섬유아세포어[서 회수된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 10 pmol의 sense 및 antisense primer, 0.5U i-Max II DNA polymerase(Intron, Korea), IxPCR-buffer, 200 uM dNTP 조성으로 denaturation 94 ℃ 30초, annealing 63 ℃ 30초, extension 72 ℃ 7분 30초, 30 cycle의 반응 조건으로 long PCR을 수행하였다. PCR 산물은 0.
- SV40 polyA 신호서열은 pCMV-Tagl 벡터 (Stratagene, USA)를 주형으로 사용하여 PCR에 의하여 동정하였다. PCRe pCMV-Tagl 벡터 DNA는 10 pg, 20 pmol 의 sense (AAGCTTATCGATACCGTCGA) primer 와 antisense (GGGCCCTTAAGATACATTGATGAG) primer, bPCR- buffer, 0.
- Transfection에 사용된 DNA 농도는 knock-in 벡터와 G418(Gibco, BRL Co, USA) 선별을 하기 위해 pSV2neo plasmid DNA의 몰비를 5:2로 하여 total 4 ug을 사용하였다. Transfection 24시간 후에 G- 418 300 ug/ml가 포함된 배지로 교체하였고, 3일마다 배지를 교체하면서 EGFP가 발현하는 것을 형광현미경을 통해 확인하였다. Knock-in 벡터의 transfection 효율을 확인하기 위한 control DNA로 pEGFP-N3(Clontech/ USA) 를 사용하여 EGFP 발현을 형광현미경을 통해 확인하였다
- HC11 세포의 배양에는 10%의 FBS(Hyclon, USA) 와항생제가 포함된 RPMI 1640(WelGENE, Korea)을 사용하였다. Transfectione HC11 cell을 3 cm dish에 2.4x10, cell 접종한 다음 16시간 후에 jetPEI tmasfection rea- gent(Polyplus Transfection, US為을 이용하여 실험설명서에 따라 실시하였다. Transfection에 사용된 DNA 농도는 knock-in 벡터와 G418(Gibco, BRL Co, USA) 선별을 하기 위해 pSV2neo plasmid DNA의 몰비를 5:2로 하여 total 4 ug을 사용하였다.
- PGK - neo 유전자는 enzyme site를 치환하는 과정을 통해 p- BSK +/EcoRV - Sall vector에 연결하였다. p -casein 3' 부분과 PGK - neo를 연결하기 위해 B-casein 3' 부분이 연결되어 있는 plasmid를 EcoRV - 9用으로 절단하여 벡터로 이용하고 PGK-neo plasmid는 EcoRV - Sull로 절단하여 insert를 준비하여 이 두 개의 fragment를 ligation 하여 pBSK+/EcoRV - X加I에 PGK-neo와 0-casein 3' 부분이 연결된 pBSK+neo+3' arm plasmid를 얻었다. pBSK +5' arm+EGFP+polyA plasmid와 pBSK+neo+3' arm plas- mid을 최종적으로 연결하기 위해 pBSK+neo+3' arm plasmid을 EcoRV - X/湖으로 절단하허 insert를 준비하였고, pBSK+5' arm+EGFP+polyA plasmid를 EcoRV - X/zoI으로 절단하여 벡터로 이용하여 이 두 fragment를 ligation하였다.
- p -casein 3' 부분과 PGK - neo를 연결하기 위해 B-casein 3' 부분이 연결되어 있는 plasmid를 EcoRV - 9用으로 절단하여 벡터로 이용하고 PGK-neo plasmid는 EcoRV - Sull로 절단하여 insert를 준비하여 이 두 개의 fragment를 ligation 하여 pBSK+/EcoRV - X加I에 PGK-neo와 0-casein 3' 부분이 연결된 pBSK+neo+3' arm plasmid를 얻었다. pBSK +5' arm+EGFP+polyA plasmid와 pBSK+neo+3' arm plas- mid을 최종적으로 연결하기 위해 pBSK+neo+3' arm plasmid을 EcoRV - X/湖으로 절단하허 insert를 준비하였고, pBSK+5' arm+EGFP+polyA plasmid를 EcoRV - X/zoI으로 절단하여 벡터로 이용하여 이 두 fragment를 ligation하였다. 이렇게 하여 pBSK+5\arm+EGFP+polyA+ neo+3' arm plasmid를 얻었다.
- 구축된 knock-in 벡터는 약 3 kb의 promoter 영역을 포함하고 있으므로 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에 벡터를 도입하여 EGFP의 발현 여부를 다음과 같이 검증하였다. HC11 세포의 배양에는 10%의 FBS(Hyclon, USA) 와항생제가 포함된 RPMI 1640(WelGENE, Korea)을 사용하였다.
- 돼지의 beta-casein genomic DNA를 이용하여 얻은 PCR product 5' arm과 3' arm 그리고 벡터 구죽에 필요한 유전자들을 이용하여 Fig. 2에서 나타낸 바와 같이 pMC- DT-PCEGFP knock-in 벡터를 구축하였다. Knock-in 벡터의 전체 길이는 13.
- 하여 안정적으로 EGFP가 발현될 수 있음을 나타내고 있다. 본 연구에서는 P-casein 유전자 영역을 이용하고, positive selection marker로 neo 유전지■를, negative selection marker로 diphtheria toxin A 를 이용한 벡터를 구축하였다. 이 벡터가 체세포에 도입되어 상동유전자 재조합이 일어나게 되면 G418 선별에 의해 세포는 생존하게 되고 vector가 비특이적으로 삽입되면 diphtheria toxin A가 발현하여 세포는 사멸하게 되는 특징을 가지고 있다.
- 이렇게 PCR 증폭된 Knock-in 벡터의 5' arm 부분은 Notl - Ncol 제한 효소 처리에 의하여 약 5 kb의 insert 를 제조하였고, 과발현시킬 유전자인 EGFP 유전자는 Ncol - Sall 제한 효소 처리를 하여 연결할 DNA 단편을 준비하였다. 이렇게 준비된 단편은 pBSK+/NotI-Sall 벡터에 3 fragment ligation을 실시하여 pBSK+5' arm+EG- FP plasmid를 얻었다.
대상 데이터
- HC11 세포의 배양에는 10%의 FBS(Hyclon, USA) 와항생제가 포함된 RPMI 1640(WelGENE, Korea)을 사용하였다. Transfectione HC11 cell을 3 cm dish에 2.
- 본 연구에서 제작된 EGFP 발현 knock-in 벡터는 돼지 B-casein의 promoter 약 3 kb가 5' arm 에 포함되어 있으며, EGFP는 원래 p-casein 유전자의 ATG 위치에 정확하게 치환되어 삽입되도록 고안되어 있다. 따라서 본 벡터를 생쥐 유선 세포주인 HC11 세포에 도입하면 EG- FP는 발현하게 된다.
성능/효과
- 1(B)), SV40 polyA(Fig. 1(C))도 PCR 을 이용하여 동정하였고 염기배열을 결정하여 상동성을 확인한 결과, 모두 100% 일치하는 것을 확인하였다(결과제시 안함). 특히 돼지 beta-casein genomic DNAe 9개의 exon과 8개의 intron으로 구성되어 있었다(Fig.
- 따라서 본 벡터를 생쥐 유선 세포주인 HC11 세포에 도입하면 EG- FP는 발현하게 된다. Fig. 3B에 제시한 바와 같이 knock-in 벡터를 HC11 세포에 도입하고 48시간 후 안정적으로 EGFP가 발현함을 확인하였다. 또한, G418 선별한 결과 세포 colony에서도 EGFP을 발현함을 확인할 수 있었다(Fig.
- 돼지의 beta-casein genomic DNA를 cloning 하기 위해 돼지의 태아섬유아세포에서 추출한 genomic DNA를 이용하여 long PCR을 수행한 결과 5' 부분 약 6.8 kb와 3' 부분 5 kb의 PCR 산물을 얻었다(Fig. 1(A)).
- 3B에 제시한 바와 같이 knock-in 벡터를 HC11 세포에 도입하고 48시간 후 안정적으로 EGFP가 발현함을 확인하였다. 또한, G418 선별한 결과 세포 colony에서도 EGFP을 발현함을 확인할 수 있었다(Fig. 3(C)).
- 이러한 Q-casein의 특성에 의하여 유즙을 통한 animal bio- reactor의 생산에는 0-casein promoter가 주로 사용되고 있다(Ko 등, 2000; Brophy 등, 2003). 본 연구에서는 구축된 knock-in 벡터는 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에 도입하였을 경우, 안정적으로 EGFP가 발현됨을 확인하였다. 이러한 결과는 knock-in 벡터의 5' arm에는 약 3 kb의 promoter 영역을 가지고 있기 때문에 기본적인 전사에 의하여 EGFP가 발현하고 있는 것으로 생각된다.
후속연구
- 이 벡터가 체세포에 도입되어 상동유전자 재조합이 일어나게 되면 G418 선별에 의해 세포는 생존하게 되고 vector가 비특이적으로 삽입되면 diphtheria toxin A가 발현하여 세포는 사멸하게 되는 특징을 가지고 있다. Positive selection marker로 neo 유전자, negative selection marker로 diphtheria toxin A을 이용한 gene targeting vector는 생취 ES cell을 이용한 gene targeting에 이용되어져 왔으며 (Yanagawa 등, 1999), 본 연구에서 구축된 벡터도 돼지 체세포에서 정상적으로 기능할 것으로 생각된다.
- 따라서 본 연구에서 구축된 EGFP 발현 knock-in 벡터는 돼지 체세포에 도입하여 knock-in된 체세포를 선별하는데 이용될 수 있으며, knock-in된 체세포가 확보되면 이들 세포를 이용하여 EGFP가 유선에서 안정적으로 발현하는 복제 형질전환 돼지를 생산할 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 고가의 의약품 생산을 위해서 특정한 유전자를 knock-in 벡터에 삽입하여 복제 동물을 생산한다면 복제된 돼지의 유즙에서 안정적이며 다량의 의약품이 생산될 것으로 기대된다.
- 또한, 고가의 의약품 생산을 위해서 특정한 유전자를 knock-in 벡터에 삽입하여 복제 동물을 생산한다면 복제된 돼지의 유즙에서 안정적이며 다량의 의약품이 생산될 것으로 기대된다.
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