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문제 정의
- 본 연구는 농촌진흥청 농업유전자원센터에 보존되고 있는 다양한 향미 유전자원의 성분 분석을 위한 신속, 정확한 평가 및 선발체계를 구축하고자 근적외선 분광분석법을 이용하여 현미 및 벼 상태의 향미자원으로부터 획득한 spectrum의 비교분석을 통해 비 파괴적으로 아밀로스 및 단백질 함량을 분석하고자 실시하였다.
- 본 연구는 향미 및 다면적 재래 벼 유전자원에 대하여 근적외선 분광분석법을 이용하여, 현미 및 벼 상태의 향미자원으로부터 spectrum을 획득 후, 아밀로스 함량과 단백질 함량 분석을 하고자 실시하였다. 75점의 향미 및 다면적 재래 유전자원의 현미로부터 측정한 단백질 함량의 범위는 3.
제안 방법
- 전체 자원중 75자원에 대한 이화학적 특성분석을 통한 검량식 작성을 위해, 향미 10 g씩을 실험실용 현미제현기(SY88-TH, Sangyong Machine Ind. Co. Ltd., Incheon, Korea)로 탈영시켜서 사미, 피해 립 등을 제거한 후, 현미상태로 NIR 스펙트럼을 작성 후, 동일한 샘플을 이화학적 분석에 이용하였다. 이화학적 특성 분석용 샘플은 현미를 분쇄기로 90초 간 분쇄하여 100 mesh의 채로 친 현미가루를 이용하여, 아밀로스 함량 및 단백질 함량을 농촌진흥청 쌀 품질 및 식미평가서에 의거하여 조사하였다.
- , Incheon, Korea)로 탈영시켜서 사미, 피해 립 등을 제거한 후, 현미상태로 NIR 스펙트럼을 작성 후, 동일한 샘플을 이화학적 분석에 이용하였다. 이화학적 특성 분석용 샘플은 현미를 분쇄기로 90초 간 분쇄하여 100 mesh의 채로 친 현미가루를 이용하여, 아밀로스 함량 및 단백질 함량을 농촌진흥청 쌀 품질 및 식미평가서에 의거하여 조사하였다.
- 실온에서 냉각 후 가스를 방출시키고 증류수를 300 mL 가하면서 분해병의 내벽을 세척 하고 45% NaOH 50 mL을 가하여 용액을 알칼리화 하여 Kjeldahl 증류장치로 75 mL까지 증류 한 후, 2% 붕산용액(H3BO4) 10 mL을 가하여 0.1 N H2SO4 표준용액으로 자동 분석 장치(Kjeltec 2400, Foss, Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 질소 함량(N)을 분석 후, 질소보정계수를 N×5.95(%)로 하여 단백질 함량으로 환산하였다.
- 분양받은 향미와 다면적 재래자원의 현미 및 벼 상태에 대한 NIR을 이용한 근적외선 스펙트럼을 측정하기 위해, 근적외선 분광분석기(NIRsystems 6500, Foss)를 사용하였으며, 시료를 half cup seed holder에 채운 후 실온에서 가시광선 및 근적외선 대역(400-2500 nm)에서 scanning 한 후 스팩트럼은 한 품종 당 3반복으로 얻은 원시 spectrum을 standard normal variance와 detrend로 입도 차이에서 오는 산란을 보정하였다.
- NIRS을 이용한 정량분석을 위해 우선 원시 spectrum을 파일로 작성한 후 검량 식을 얻어야 한다. 검량 식은 원시 spectrum을 4가지 수 처리(math treatment)방법을 통하여 spectrum을 영역별로 중첩에서 생기는 noise와 bias를 최소화하였다. 원시 spectrum을 가공하여 데이터 분석 및 아밀로스와 단백질에 대한 검량 식을 작성하고 이를 79자원의 현미에 적용하여 시료의 가상적인 아밀로스와 단백질 함량을 얻었다.
- 검량 식은 원시 spectrum을 4가지 수 처리(math treatment)방법을 통하여 spectrum을 영역별로 중첩에서 생기는 noise와 bias를 최소화하였다. 원시 spectrum을 가공하여 데이터 분석 및 아밀로스와 단백질에 대한 검량 식을 작성하고 이를 79자원의 현미에 적용하여 시료의 가상적인 아밀로스와 단백질 함량을 얻었다.
- 수 처리(math treatment)는 우선 1차 미분(1st derivative)을 이용한 1, 4, 4, 1(1st derivative, 4 nm gap, 4 point smooth, and 1 point second smooth))조건, 1, 10, 10, 1 조건과 2차 미분을 이용한 2, 4, 4, 1 조건 및 2, 10, 10, 1 조건을 사용하였다. 수 처리된 spectrum은 회귀분석을 통해 검량 식을 작성하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 벼 유전자원은 Table 1과 같이 2006년 농촌진흥청 국립농업유전자원센터로부터 활력이 80% 이상인 향미자원 65점과 다면적 재래자원 14점을 분양받아 2007년 증식한 재료를 사용하였다.
데이터처리
- 수 처리(math treatment)는 우선 1차 미분(1st derivative)을 이용한 1, 4, 4, 1(1st derivative, 4 nm gap, 4 point smooth, and 1 point second smooth))조건, 1, 10, 10, 1 조건과 2차 미분을 이용한 2, 4, 4, 1 조건 및 2, 10, 10, 1 조건을 사용하였다. 수 처리된 spectrum은 회귀분석을 통해 검량 식을 작성하였다.
- 회귀분석은 PLS(partial least squares), MPLS(modified partial least squares), PCR(principal component regression)법을 사용하여 검량 식을 산출하였으며, 작성된 검량식을 상호비교 분석하여 최적의 검량 식을 도출하였다.
- 실험치(lab data)와 NIR 데이터의 통계적인 모집단 분포의 해석과 그 상관관계에 관한 통계분석은 WINISI II software(Ver 1.50, Foss)를 사용하여 RSQ(R2; squared coefficient of multiple determination in calibration), SEC(standard error of calibration), 그리고 SEP(standard error of prediction) 값을 분석하였는데, SEC, SEP, Bias식은 다음과 같다.
- Table 3과 Table 4는 벼와 현미 상태로부터 획득한 NIRS spectrum으로부터 protein과 amylose 함량을 예측하기 위한 최적의 검량 식 작성을 위한 회귀분석(regression analysis)과 수 처리(math treatment)방법에 따른 상관계수(R2)값과 SEC(standard error calibration)값의 차이를 비교하였다.
이론/모형
- 단백질 함량은 Micro Kjeldahl 질소 정량 법(4)을 이용하여 다음과 같이 정량하였다. 현미 시료 500 mg을 500 mL Kjeldahl 분해병에 넣고 진한 황산(H2SO4) 20 mL을 가한 후 분해촉매제(Kjeltabs) 1 g을 넣고 400℃에서 2시간 동안 분해하였다.
- 아밀로스 함량 분석은 Juliano(26)의 비색 정량 법에 따라 100 mg의 현미가루에 95% ethanol 1 mL와 1 N NaOH 9 mL 가해 진탕항온수조에 10분간 호화시킨 후 20℃ 증류수로 100 mL을 채운 다음, 그 중 5 mL를 취해 1 N acetic acid 1 mL와 2% I2-KI(iodine solution) 2 mL를 가해 증류수로 100 mL까지 채우고 30℃에서 20분간 발색 반응시켜 620 nm의 파장에서 UV/Vis분광광도계(UV-2450, Shimadzu, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
성능/효과
- 75점의 향미 및 다면적 재래 유전자원의 현미로부터 측정한 단백질 및 아밀로스 함량 범위를 Table 2에서 살펴보면 단백질 함량의 범위는 3.8-9.3%였으며, 평균 단백질 함량은 7.1%이고 단백질 함량이 6.6-7.5%인 자원은 26점으로 전체의 32.9%를 차지하였다. 전체 자원의 아밀로스 함량의 범위는 8.
- 9%를 차지하였다. 전체 자원의 아밀로스 함량의 범위는 8.5-27.4%였으며, 평균 아밀로스 함량은 20.3%이고 아밀로스 함량이 12.5% 이하인 저 아밀로스 자원은 7점이었으며, 아밀로스 함량이 16.6-24.5%인 고아밀로스 자원은 58자원으로 전체의 73.4%를 차지하였다.
- 2, B와 D)은 비교적 좁은 범위에 고루 분포하였다. 단백질 함량에 대한 spectrum보다 아밀로스 함량의 spectrum이 공간적으로 고르게 분포하였지만 모두 정규분포의 양상을 보였으며, 이는 자연계에서 흔하게 나타나는 대표적인 시료군의 형태로서 실험치 분포(Table 1)과 비교할 때 거의 일치함을 알 수 있었다.
- Table 5은 향미자원으로부터 얻은 단백질과 아밀로스 함량의 실측 데이터(experimental data)와 NIR분석에 의한 예측 데이터(prediction data)에 대한 차이를 나타내었다. 습식분석 데이터와 예측 data의 평균 단백질 함량의 차이는 벼 상태의 경우 0.06이었고 현미상태의 경우 0.12 정도로 근소한 차이를 보였고 평균 아밀로스 함량 차이도 벼 상태의 경우 0.33이었고 현미상태의 경우 0.37로 근소한 차이를 보였다. 그러나 습식분석 데이터와 NIRS 분석에 의한 예측데이터의 최소값과 최대값의 변이 폭을 비교하였을 경우, 현미로부터 얻은 단백질의 습식분석 데이터는 4.
- 37로 근소한 차이를 보였다. 그러나 습식분석 데이터와 NIRS 분석에 의한 예측데이터의 최소값과 최대값의 변이 폭을 비교하였을 경우, 현미로부터 얻은 단백질의 습식분석 데이터는 4.4-9.3%의 나타내었으나, NIRS 분석에 의한 벼 상태에서는 3.3-10.8%, 현미상태에서는 4.0-10.4%로 습식분석 데이터에 비해 넓은 변이 폭을 나타내었다. 아밀로스의 경우도 습식분석 데이터는 8.
- 벼 상태에 대한 MPLS(1,4,4,1)방법에 의한 R2 및 SEC 값은 protein은 R2 값이 0.871, SEC 값이 1.37이었고, amylose는 R2 값이 0.815, SEC 값이 0.29이었으며, 현미상태의 경우 MPLS(2,4,4,1)방법에 의한 R2 및 SEC 값은 protein은 R2 값이 0.943, SEC값이 0.90이며 amylose는 R2 값이 0.859, SEC 값이 0.37로 높은 유의성을 나타내었다.
- 본 연구는 향미 및 다면적 재래 벼 유전자원에 대하여 근적외선 분광분석법을 이용하여, 현미 및 벼 상태의 향미자원으로부터 spectrum을 획득 후, 아밀로스 함량과 단백질 함량 분석을 하고자 실시하였다. 75점의 향미 및 다면적 재래 유전자원의 현미로부터 측정한 단백질 함량의 범위는 3.8-9.3%였으며, 평균 단백질 함량은 7.1%이고 아밀로스 함량의 범위는 8.5-27.4%였으며, 평균 아밀로스 함량은 20.3%이었다. 79점의 향미 및 다면적 재래 유전자원에 대한 벼 상태 및 현미상태에서의 NIR 원시 spectrum을 나타낸 것으로 1,490 nm 이상의 파장범위에서 큰 차이를 보였다.
- 79점의 향미 및 다면적 재래 유전자원에 대한 벼 상태 및 현미상태에서의 NIR 원시 spectrum을 나타낸 것으로 1,490 nm 이상의 파장범위에서 큰 차이를 보였다. NIR 원시 spectrum을 MPLS방법에 의해서 벼 상태로부터 얻은 spectrum은 1,4,4,1 수 처리 방법, 현미상태로부터 얻은 spectrum은 2,4,4,1 수 처리 방법의 결과가 유의성이 높았다. 벼 상태에 대한 MPLS(1,4,4,1)방법에 의한 R2 및 SEC 값은 protein은 R2 값이 0.
- 37로 높은 유의성을 나타내었다. 습식 분석 데이터와 NIR 예측 data에 대한 차이를 살펴보았더니, 평균 단백질 함량의 차이는 벼 상태는 0.06, 현미상태는 0.12 였고, 평균 아밀로스 함량 차이도 벼 상태는 0.33이었고 현미상태는 0.37로 근소한 차이를 보였다.
- 75점의 향미 및 다면적 재래 유전자원의 시료에 대한 단백질 및 아밀로스 함량에 대한 분석 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 비교적 정규분포에 가까운 양상을 나타내고 있으므로 근적외선 분광 분석기를 이용한 현미의 아밀로스 함량 및 단백질 함량에 대한 검량식 작성에 사용될 샘플집단으로 무리가 없을 것으로 판단된다. 이와 유사한 결과를 쌀의 분석 결과에서 보고한 바 있다(19,21).
후속연구
- NIR의 분석방법은 시료의 추출, 여과, 희석 등의 일련의 과정 없이 측정된 시료를 비 파괴적으로 회수가 가능한 장점이 있지만, 습식분석 데이터의 정확성에 의존하여 분석하는 2차적인 분석방법이기 때문에 정확도가 무엇보다 중요하다(33-35). 따라서 본 실험에서는 탈영하지 않은 벼 상태로부터 얻은 NIR spectrum과 습식분석에 이용한 현미로부터 얻은 NIR spectrum을 비교분석하여 시료의 상태에 따른 예측데이터의 변화를 비교분석한 것으로 근적외선스펙트럼을 이용한 벼 유전자원의 화학적 특성을 평가하는데 보다 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 판단되며, 품질 평가시스템을 구성하기 쉽고, 분석 시 숙련된 기술을 요하지 않으며, 결과의 해석이 용이할 뿐만 아니라 저비용으로 평가 시스템을 구성할 수 있는 장점을 가지고 있는 것 같다.
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