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문제 정의
- 본 연구에서는 새로운 종 특이적 molecular marker를 개발하기 위해 B. cinerea와 유전적으로 매우 유사한 Botrytis속내 다른 종들과 Sclerotinia속 종들의 pyruvate carboxylase(pyc) 유전자 내부의 변이 영역을 비교 분석하였으며, 개발된 B. cinerea 종특이적 primer를 PCR 기법을 이용하여 병 진단 및 종 동정에 활용하기 위해 그 민감도 및 특이성을 조사하였다.
제안 방법
- GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 공개된 Botryotinia fuckeliana(XM_001556508), Sclerotinia sclerotiorum (XM_001586211), Podospora anserine(XM_001913025), Gibberella zeae(XM_387251), Magnaporthe grisea(XM_367852) 등과 JGI(http://www.jgi.doe.gov/)에 공개된 Mycosphaerella graminicola(scaffold_10:33663-38012)와 Nectria haematococa(scaffold_10:34021-37633)의 pyruvate carboxylase(pyc) 유전자의 DNA 염기서열들을 비교 분석하여그 일부를 공통적으로 증폭할 수 있는 변형된 universal primer set PYCUF1(5'-GGACHACNTTCACGA-3')/ PYCUR5(5'-GGNGTYACCTTGAC-3')와 PYCUF(5'- CACTTCTGTGAGCAAGC-3')/PYCUR(5'-GATGTTGGAGTGACCTTG-3')를 설계하였다.
- 유전자의 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 5분간 실시한 후 denaturation 94o C/30초, annealing 55℃/90초, extension 72℃/90초로 35 cycles을 실시하고 final extension을 72℃/10분 실시하였다. MJ Research사의 PTC-100을 이용하여 PCR 증폭을 하였으며 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 100 V에 30분간 전기영동하여 ethidium bromide 로 염색한 후 관찰하였다.
- PCR 증폭 산물은 PCR prep kit(iNtRon Biotechnology) 로 정제하고, BigDye teminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Forster City, CA, U.S.A)를 이용, template 40 ng, primer(PYCUF1, PYCUR5, PYCUF, PYCUR)를 각각 3.2 pmol, teminator ready reaction mixture 8 µl에 물을 첨가하여 20 µl volume으로 조절한 뒤 96℃/10초, 50℃/5초, 60℃/4분으로 25 cycle의 PCR 반응을 수행한 후 ABI prismTM 3730 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems)를 이용하여 sequencing을 실시하였다.
- Sclerotiorum과 함께 EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk)에서 clastralW 프로그램을 이용해 분석되어졌으며, Oligonucleotide Properties Calculator(http://www.basic.northwestern.edu)를 이용하여 B. cinerea 종 특이적 primer BTNF1; 5'-GCT TGA CCC AGG CTT GAA C-3'와 BTNR1 5'-TGG GTC TGG TCC CGT GTA A-3'를 설계했다.
- 각 유전자의 증폭을 위한 반응 mixture 는 total volume을 50 µl로 하고 template DNA 2~10 ng, 각 primer set 10 pmole, 250 µM dNTPs, 10×PCR buffer 5 µl, 2 mM MgCl2, Taq DNA Polymerase 2 unit(Solgent Co.)을 첨가하여 PCR을 수행하였다.
- 개발된 primer의 종 특이성을 조사하고자 10개의 다른 기주식물에서 분리한 B. cinerea 13균주, 6종의 다른 Botrytis 속, 4종의 Botryotinia속, 7종의 Sclerotinia 속 및그 이외의 16속 식물병원균 16균주들에 대해서 BTNF1/ BTNR1 primer set을 이용해 PCR 반응을 실시하였다. 또한 민감도를 알아보고자 B.
- 거의 모든 생명체의 미토콘드리아 내에 존재하며 당 신생합성에 관여하는 촉매효소로 알려져 있는 pyc 유전자 (Jitrapakdee and Wallace, 1999)에 대한 Botrytis 속 균들의 종 특이적인 변이영역을 찾고자 GenBank에 공개된 DNA 염기와 아미노산 서열들을 비교 분석하였다(본문에 미보고). 이들 중 잿빛곰팡이병균 B.
- 공시균주들을 PDA 배지에 접종하여 각각 20~27o C에서 5일간 배양한 후 균사 소량을 PD broth에 접종한 후 5일간 진탕 배양한 균사체를 멸균된 2겹의 가아제로 걸러 effendorf 튜브에 넣고 −70o C에서 얼린 후 동결건조를 실시하였다.
- cinerea 13균주, 6종의 다른 Botrytis 속, 4종의 Botryotinia속, 7종의 Sclerotinia 속 및그 이외의 16속 식물병원균 16균주들에 대해서 BTNF1/ BTNR1 primer set을 이용해 PCR 반응을 실시하였다. 또한 민감도를 알아보고자 B. cinerea 균주(BC-TO)의 genomic DNA를 10배씩 연속적으로 희석시킨 후 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응 조건은 initial denaturation을 94o C에서 5분간 실시한 후 denaturation 94℃/30초, annealing 65℃/30초, extension 72℃/30초로 35 cycles을 실시하고 final extension을 72℃/5분 실시하였다.
- 병든 식물의 절편은 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 표면소독한 후 Streptomycin 300 ppm이 첨가된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 치상하였고, 병든 식물의 절편으로부터 자라나온 균사의 선단을 떼어서 병원균을 분리한 후 4o C 냉장고에 보관하면서 공시균주로 사용하였다. 또한 병든 식물과 분리된 병원균은 상기 기술된 방법에 따라 DNA 분리를 수행하였으며, 종특이적 primer의 특이성 조사에 사용된 동일한 조건으로 PCR 실험을 수행하였다.
- sclerotiorum (3,624 bp)가 서로 각각 90%, 94%의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열 유사도를 보이며 유전적으로 가장 가깝게 나타났다. 또한 이들과 pyc 유전자의 아미노산 상동성이 70%가 넘으며 분류학상으로 매우 유사한 진균들을 대상으로 DNA 염기서열들을 비교 분석한 후 대부분 진균들의 pyc 유전자를 증폭할 수 있으며 내부 변이영역을 포함하고 있으며 종 특이적 primer 설계가 가능한 PCR 증폭 산물을 생성시키는 universal primer를 만들었다.
- 토마토 포장에서 잿빛곰팡이병에 감염된 식물체를 채집 하여 병원균을 분리하였다. 병든 식물의 절편은 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 표면소독한 후 Streptomycin 300 ppm이 첨가된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 치상하였고, 병든 식물의 절편으로부터 자라나온 균사의 선단을 떼어서 병원균을 분리한 후 4o C 냉장고에 보관하면서 공시균주로 사용하였다. 또한 병든 식물과 분리된 병원균은 상기 기술된 방법에 따라 DNA 분리를 수행하였으며, 종특이적 primer의 특이성 조사에 사용된 동일한 조건으로 PCR 실험을 수행하였다.
- cinerea)은 비닐하우스에서 재배할 때 토마토의 꽃과 줄기의 감염을 통해 매우 심각한 피해를 입힌다. 이 연구에서 토마토에 발병하는 잿빛 곰팡이병균의 검출 및 종 동정을 위해 새로운 종 특이적 primer set가 개발되었다. 종 특이적 primer(BTF1/BTR1) 는 B.
- gov/)에 공개된 Mycosphaerella graminicola(scaffold_10:33663-38012)와 Nectria haematococa(scaffold_10:34021-37633)의 pyruvate carboxylase(pyc) 유전자의 DNA 염기서열들을 비교 분석하여그 일부를 공통적으로 증폭할 수 있는 변형된 universal primer set PYCUF1(5'-GGACHACNTTCACGA-3')/ PYCUR5(5'-GGNGTYACCTTGAC-3')와 PYCUF(5'- CACTTCTGTGAGCAAGC-3')/PYCUR(5'-GATGTTGGAGTGACCTTG-3')를 설계하였다. 이를 이용해 pyruvate carboxylase(pyc) 유전자의 DNA 염기서열들을 얻고자 B. cinerea, B. aclada와 B. fabae 균주들에 대해서 PCR 증폭을 실시하였다. 각 유전자의 증폭을 위한 반응 mixture 는 total volume을 50 µl로 하고 template DNA 2~10 ng, 각 primer set 10 pmole, 250 µM dNTPs, 10×PCR buffer 5 µl, 2 mM MgCl2, Taq DNA Polymerase 2 unit(Solgent Co.
- 종 특이적 primer의 반응민감도 한계는 대략 2 pg이었다. 자연상태에서 B. cinerea에 감염된 토마토 식물체와 인공적으로 접종된 식물체로부터 종 특이적 primer를 활용한 병원균의 PCR 검출이 이루어졌다. 이 연구결과로 미루어 새롭게 개발된 primer는 높은 반응민감도와 종 특이성을 나타내 추후 토마토 잿빛곰팡이병의 빠른 진단 및 병원균의 정확한 동정에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 자연적으로 B. cinerea에 의해 감염된 토마토 식물체와인공적으로 접종된 토마토 열매병반과 균핵으로부터 DNA 를 분리 후 종 특이적 primer를 이용한 PCR을 수행한 결과 병원균의 검출이 이루어졌다(Fig. 5). 또한 이들 이병 식물체로부터 B.
- 종 특이적 primer를 만들기 위해 B. cinerea와 유전적으로 매우 유사한 균들로 알려진 B. aclada와 B. fabae 균주 들에 대한 pyc 유전자의 일부 영역을 PCR 증폭한 후 DNA 염기서열 변이를 분석하였다. 437 bp 크기인 국내 토마토 분리균 B.
- 튜브내의 ethanol을 제거, 건조시킨 후 DNA를 100 µl의 TE buffer에 녹인 다음2 µl(10 mg/ml)의 RNase를 첨가하여 RNA를 제거 한 후 agarose gel에 전기영동하여 DNA를 확인 및 정량하였다. 토마토 재배 포장에서 수집한 잿빛곰팡이병에 감염된 식물체(100 mg)와 B. cinerea를 상처 접종시킨 후 얻어진 병든 토마토 병반(100 mg) 및 균핵(20 mg)으로부터의 genomic DNA 분리도 위와 동일하게 실시하였다.
- 토마토 포장에서 잿빛곰팡이병에 감염된 식물체를 채집 하여 병원균을 분리하였다. 병든 식물의 절편은 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 표면소독한 후 Streptomycin 300 ppm이 첨가된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 치상하였고, 병든 식물의 절편으로부터 자라나온 균사의 선단을 떼어서 병원균을 분리한 후 4o C 냉장고에 보관하면서 공시균주로 사용하였다.
- 튜브내의 ethanol을 제거, 건조시킨 후 DNA를 100 µl의 TE buffer에 녹인 다음2 µl(10 mg/ml)의 RNase를 첨가하여 RNA를 제거 한 후 agarose gel에 전기영동하여 DNA를 확인 및 정량하였다.
대상 데이터
- 공시균주로 사용된 B. cinerea와 기타 균주들은 충남대 (CNU)에 보관중인 것들과 강릉대(KNU), 생물자원센터 (KCTC) 그리고 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양받아 사용하였다(Table 1).
성능/효과
- cinerea와 유전적으로 매우 유사한 진균들의 pyruvate carboxylase(pyc) 유전자 내부의 변이영역으로부터 설계되 었다. 10개의 다른 기주식물에서 분리된 13균주의 모든 B. cinerea에서 112 bp 크기의 PCR 산물들이 만들어졌다. 그러나 6종의 다른 Botrytis 속균, 4종의 Botryotinia 속균, 5종의 Sclerotinia 속균 및 그 이외 16속의 다른 식물병원균들에 대해서는 PCR 반응이 나타나지 않았다.
- fabae 균주 들에 대한 pyc 유전자의 일부 영역을 PCR 증폭한 후 DNA 염기서열 변이를 분석하였다. 437 bp 크기인 국내 토마토 분리균 B. cinerea(BO-TO)의 PCR 증폭산물을 이미 염기서열 정보가 공개된 외국균주로 B. cinerea의 완전세대인 Botryotinia fuckeliana에서의 2,339번째부터 2,775번째까지 동일한 크기의 DNA 영역과 비교한 결과 이들간 염기 변이가 2,628번째 한 곳에서만 발견되어 이 영역이 종내 유전자 염기정보가 동일한 종 특성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(Fig. 1). 한편, Sc.
- B. cinerea와 유전적으로 매우 유사한 진균들의 pyc 유전자 내부 변이영역에 대한 DNA 염기서열 비교를 통해 112 bp의 증폭산물을 생성시키는 종특이적 primer(BTF1/ BTR1)가 만들어졌다(Fig. 2). 선발된 primer의 종 특이성을 조사하고자 국내의 토마토를 포함한 10가지의 다양한 기주식물에서 분리한 B.
- cinerea의 유성세대인 Botryotinia fuckeliana(3,630 bp)와 Sc. sclerotiorum (3,624 bp)가 서로 각각 90%, 94%의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열 유사도를 보이며 유전적으로 가장 가깝게 나타났다. 또한 이들과 pyc 유전자의 아미노산 상동성이 70%가 넘으며 분류학상으로 매우 유사한 진균들을 대상으로 DNA 염기서열들을 비교 분석한 후 대부분 진균들의 pyc 유전자를 증폭할 수 있으며 내부 변이영역을 포함하고 있으며 종 특이적 primer 설계가 가능한 PCR 증폭 산물을 생성시키는 universal primer를 만들었다.
- 한편, Sc. sclerotiorum (437 bp)의 2,495부터 2,686번째 DNA 영역을 437 bp 크기의 B. cinerea와 비교시 DNA 염기 길이의 변이는 나타나지 않았지만 염기내 88% 정도만의 유전적 상동성을 나타냈다. 하지만 B.
- sclerotiorum에 비해 각각 더높은 유전적 유사도를 나타냈다. 따라서 Botrytis 속 균들의 pyc 유전자는 동일한 종간에는 아주 안정적인 염기배열을 가지지만 유전자 내부에 종간 및 속간에 유전적 차이를 식별할 수 있는 변이 영역이 존재함을 알 수 있었다.
- 5). 또한 이들 이병 식물체로부터 B. cinerea를 배지상에서 모두 순수하게 분리하였으며 이들 DNA에 대한 PCR 반응에 있어서도 112 bp 크기의 증폭산물들을 모두 확인할 수 있었다. B.
- 2와 3). 또한 이들의 PCR 반응 민감도를 알아보고자 B. cinerea(BC-TO) genomic DNA 를 10배씩 연속적으로 희석시킨 후 PCR 증폭을 실시한결과 반응민감도 한계는 대략 2 pg임을 알 수 있었다(Fig. 4). Real time PCR은 본 연구에서와 같이 전기영동을 통해 결과를 확인하는 conventional PCR에 비해 PCR 반응 민감도가 약 10~100배 이상 높게 나타나는 것으로 알려져 있지만 보다 정밀한 결과분석을 위해 작은 크기의 증폭산물을 만드는 종 특이적 primer가 우선적으로 요구되며, 증폭산물 내부에 probe의 제작이 가능한 종 특이적 변이영역을 필요로 하기도 한다(Minerdi et al.
- 2). 선발된 primer의 종 특이성을 조사하고자 국내의 토마토를 포함한 10가지의 다양한 기주식물에서 분리한 B. cinerea 13균주와 6종의 Botrytis 속균, 4종의 Botryotinia속균, 5종의 Sclerotinia 속 균 및그 이외 16속의 다른 식물병원균들에 대해서 BTNF1/ BTNR1 primer set을 이용해 PCR 반응을 실시한 결과 B. cinerea 균들에서만 종 특이적인 112 bp의 단일 증폭산물 들을 얻을 수 있었다(Fig. 2와 3). 또한 이들의 PCR 반응 민감도를 알아보고자 B.
후속연구
- , 2005). 따라서 본 실험에서 새롭게 개발된종 특이적 primer는 112 bp의 최적 크기의 단일 증폭산물을 만들며 probe 제조시 필요한 증폭산물 내부의 종 특이적 변이영역이 존재해 real time PCR에서도 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
- 이러한 토마토 잿빛 곰팡이병 발생에 의한 피해를 최소화하기 위해서는 신속 정확한 병 진단 및 병 발생 예찰을 통한 적절한 병 방제 대책을 수립하는 것이 가장 필요할 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 새롭게 개발된 primer는 높은 반응민감 도와 종 특이성을 나타내 추후 토마토 잿빛곰팡이병의 병 발생전 빠른 진단 및 병원균의 정확한 동정에 활용될 수있을 것으로 판단된다.
- cinerea에 감염된 토마토 식물체와 인공적으로 접종된 식물체로부터 종 특이적 primer를 활용한 병원균의 PCR 검출이 이루어졌다. 이 연구결과로 미루어 새롭게 개발된 primer는 높은 반응민감도와 종 특이성을 나타내 추후 토마토 잿빛곰팡이병의 빠른 진단 및 병원균의 정확한 동정에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- , 1981; Droby and Lichter, 2004). 이러한 토마토 잿빛 곰팡이병 발생에 의한 피해를 최소화하기 위해서는 신속 정확한 병 진단 및 병 발생 예찰을 통한 적절한 병 방제 대책을 수립하는 것이 가장 필요할 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 새롭게 개발된 primer는 높은 반응민감 도와 종 특이성을 나타내 추후 토마토 잿빛곰팡이병의 병 발생전 빠른 진단 및 병원균의 정확한 동정에 활용될 수있을 것으로 판단된다.
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