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문제 정의
- 본 연구에서는 UVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit를 이용해 치은열구 상피세포를 특수 DNA 형광 염색하여, 건강한 치은과 치주질환에 이환된 치은에서치은열구 상피에 부착된 세균의 수에 차이가 있는지를 알아보고자 하였다. 아울러, 부착되거나 함입된 세균 중 살아있는 세균과 죽어있는 세균의 수를 비교해 보고자 하였다
- 하였다. 아울러, 부착되거나 함입된 세균 중 살아있는 세균과 죽어있는 세균의 수를 비교해 보고자 하였다
제안 방법
- 멸균된 22gauge 바늘의 5 ml 주사기(신창메디컬 대한민국를 이용해 tube에 있는 치은세포의 부유물을 흡인하고 뿜어내는 것을 수 차례 반복하여 뭉쳐있는 세포와 세균 덩어리를 분산시켰다. 그다음 tube를 18500 Xg에서 5분간 원심분리시킨 후 바닥에 침전된 pellet을 50% Percoll (Sigma-Aldrich Corporation, USA)과 phosphate-buffered saline(Sigma-Aldrich Corporation, USA)을 9 :1 로섞은 용액이 담긴 tube에 옮겼다.
- 삼성서울병원 치주과에 내원한 환자를 검사하여 치주상태가 건강한 사람과 치주질환을 가진 사람을 구분하였다. 피험자들을 검사하여 건강한 치은 부위와 질환이 있는 치은부위를 구분하였다 건강한 부위는 치은연이 얇고 표면이 단단하며 임상적 부착 상실이나 탐침 시 출혈이 일어나지 않는 곳을 선택하였다.
- 선택된 부위에 타액이 닿지 않게 커튼 롤로 격리시킨 후, 공기로 가볍게 건조시키고 cotton pellet이나 거즈를 이용해 치은연상치태를 제거하였다. 그 후 멸균된 Gracey cur-ette(Hu-Friedy, USA)을 이용해 치은열구상피를 가볍게 2 회 소파하여 멸균된 phosphate-buffered saline 0.
- 반면, 질환 부위는 변연이 둥글고 색조가 인접 부착치은보다 붉으며, 변연과 치간유두가 연하고, 치주탐침 시 4 mm 이상의 치주낭을 보이며 탐침 시 출혈이 발생하는 곳을 선택하였다. 이러한 기준으로 50명의 피험자들을 건강한 치은을 갖는 군과 치주질환에 이완된 치주 질환자군로 구분하여, 전체 25개의 건강한 부위와 25개의 질환 부위로부터 상피세포를 채취하였다.
- 피펫으로 염색된 세포 5“1를 분리하여 슬라이드 글라스에 옮기고 커버 글라스를 덮은 후표준 형광 장비가가 연결된 현미경(Nikon ECLIPSE 80i, Japan)을 이용해 관찰하였다. 관찰부위는 저배율에서 무작위적으로 5개 부위를 선택하여, 고배율에서 관찰한 후에 영상기록 프로그램인 Image-Pro Plus® v5.
- 구분하였다. 피험자들을 검사하여 건강한 치은 부위와 질환이 있는 치은부위를 구분하였다 건강한 부위는 치은연이 얇고 표면이 단단하며 임상적 부착 상실이나 탐침 시 출혈이 일어나지 않는 곳을 선택하였다. 반면, 질환 부위는 변연이 둥글고 색조가 인접 부착치은보다 붉으며, 변연과 치간유두가 연하고, 치주탐침 시 4 mm 이상의 치주낭을 보이며 탐침 시 출혈이 발생하는 곳을 선택하였다.
데이터처리
- 관찰하였다. 관찰부위는 저배율에서 무작위적으로 5개 부위를 선택하여, 고배율에서 관찰한 후에 영상기록 프로그램인 Image-Pro Plus® v5.0(MediaCybernetics, USA)를 이용하여 정지화면을 기록하여 분석하였다. 화면에 전체 세포가 다 보이는 상피세포만 세균 개수 계산에 포함시켰으며, 살아있는 세균과 죽은 세균의 수는 세어진 세균의 수를 상피세포의 수로 나누어 세포 하나당 세균 수로 계산하였다 각 그룹에서의 살아있는 세균 수와 죽은 세균 수의 차이 및 비율의 차이가 유의성이 있는지 알아보기 위해 Mann-Whitney U-test를 적용하였다
- 0(MediaCybernetics, USA)를 이용하여 정지화면을 기록하여 분석하였다. 화면에 전체 세포가 다 보이는 상피세포만 세균 개수 계산에 포함시켰으며, 살아있는 세균과 죽은 세균의 수는 세어진 세균의 수를 상피세포의 수로 나누어 세포 하나당 세균 수로 계산하였다 각 그룹에서의 살아있는 세균 수와 죽은 세균 수의 차이 및 비율의 차이가 유의성이 있는지 알아보기 위해 Mann-Whitney U-test를 적용하였다
이론/모형
- 본 연구에서는 상피부착 세균과 비 부착성 세균을 분리하기 위한 방법으로 Percoll density gradient를 이용하였다. 채취한 상피세포 및 세균을 50% Percoll 용액에 넣고 18500 Xg에서 10분간 원심분리하면 상층부에는 얇은 띠가 형성되며 하방에도 띠가 형성된다.
- 분리해 낸 상피세포를 다시 phosphate-buffered saline 0.5 ml가 담긴 tube로 옮겨 담고, UVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, USA)를 이용해제조사의 사용법에 따라 상피세포를 염색하였다.
성능/효과
- 이상 무리를 지어 관찰되기도 하였다. 고배율에서 관찰 시 상피세포에 부착되어 있는 세균들을 명확하게 관찰할 수 있었다. 세포당 세균의 수는 세균이 하나도 관찰되지 않는 경우부터 백여 개 이상 다수가 관찰되는 경우까지 다양하게 나타났으며, 관찰돠는 세균의 대부분이 구균이었다(Fig.
- 비교할 수 있었다. 그 결과 건강한 치은 부위에서는 소수의 녹색으로 발광하는 세균(1.4±1.5)만 관찰될 뿐 적색으로 발광하는 세균(0.1 ±0.3)이 거의 관찰되지 않았으나, 치주질환에 이환된 부위에서는 거의 모든 상피에서 상당수의 녹색으로 발광하는 세균(48.2±30.5)과 적색으로 발광하는 세균(10.4±9.2)이 함께 관찰되었다. 상피에 부착한 전체 세균 중 죽은 세균의 비율이 건강한 치은부위에서는 2.
- 0개였다. 또한 건강한 치은 부위에서는 9개의 샘플에서는 어떤 세균도 관찰되지 않았으며, 발견된 세균도 대부분이 녹색으로 발광하는 세균이었으며, 발견된 녹색으로 발광하는 세균의 수(1.4±1.5)도 치주질환에 이환된 부위 (48.2±30.5)와 비교하여 매우 작은 수치였다(p<0.05). 치주질환에 이환된 부위에서는 거의 모든 상피에서 녹색으로 발광하는 세균(48.
- 본 연구에서는 염색 빙법으로 immunolabeling이나 Giemsa stain이 아닌 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit를 이용하였으므로, 전체적인 상피부착 세균의 수 비교 외에도 부착 세균 중 살아있는 것과 죽은 것의 수 또한 비교할 수 있었다. 그 결과 건강한 치은 부위에서는 소수의 녹색으로 발광하는 세균(1.
- 본 연구의 결과에 따르면, 치주질환에 이환된 부위의 치은열구 상피세포에서 전강한 부위의 치은열구 상피세포에서보다 통계학적으로 유의성 있게 많은 수의 세균이 관찰되며, 죽은 세균 역시 치주질환에 이환된 부위에서 통계학적으로 높은 수 및 비율로 관찰된다. 건강한 치은부위와 치주 질환에 이환된 부위에서 죽은 세균 비율의 차이가 왜 나타나는지, 이 차이가 치주질환 진행에 영향을 미치는 인자인지 치주질환의 결과인지, 영향을 미치는 인자라면 치주질환의 진행 과정에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없으며, 차후 이에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
- 2)이 함께 관찰되었다. 상피에 부착한 전체 세균 중 죽은 세균의 비율이 건강한 치은부위에서는 2.0±5.8%인 반면 치주질환에 이환된 부위에서는 17.5±11.2%로, 치주질환에 이환된 부위에서의 죽은 세균 비율이 건강한 치은부위에서보다 통계학적으로 유의성 있게 높게 관찰되었다. 이러한 결과는 치주질환에 이환된 숙주가 침입한 세균을 제거하기 위해 작동시킨 면역 체계의 작용으로 여겨진다.
- 고배율에서 관찰 시 상피세포에 부착되어 있는 세균들을 명확하게 관찰할 수 있었다. 세포당 세균의 수는 세균이 하나도 관찰되지 않는 경우부터 백여 개 이상 다수가 관찰되는 경우까지 다양하게 나타났으며, 관찰돠는 세균의 대부분이 구균이었다(Fig. 1, 2).
- 전반적으로 치주질환에 이환된 부위에서 건강한 치은 부위보다 현저히 많은 수의 세균이 관찰되었다. 건강한 치은부위에서 관찰된 총 세균 수의 평균이 1.
- 05). 치주질환에 이환된 부위에서는 거의 모든 상피에서 녹색으로 발광하는 세균(48.2±30.5)과 적색으로 발광하는 세균 (10.4±9.2)이 함께 관찰되어 건강한 치은부위에서 발견된 세균수와 비교하여 통계학적으로 유의성 있게 높은 수치를 보였다 정상 치은 부위와 치주질환에 이환된 부위에서의 적색으로 발광하는 세균의 비율은 각각 2.0±5.8%, 17.5 ±11.2%였다(Table 1).
후속연구
- 수 및 비율로 관찰된다. 건강한 치은부위와 치주 질환에 이환된 부위에서 죽은 세균 비율의 차이가 왜 나타나는지, 이 차이가 치주질환 진행에 영향을 미치는 인자인지 치주질환의 결과인지, 영향을 미치는 인자라면 치주질환의 진행 과정에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없으며, 차후 이에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
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