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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 어시장에서 판매되고 있는 해산 어류에 감염되어 있는 고래회충 유충을 육안검사법과 중합효소연쇄 반응-제 한효소절 편 길 이 다형 성 (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP) 검사법으로 검출하고, 고래 회충 검출에 대한특이도를 비교 연구하고자 하였다.
제안 방법
- DNA product 8ul와 10X reaction buffer 1 ul, Hinfi 또는 HhaI(W\J; Bioneer, Daejeon, Korea) 1 ul를 혼합하고 37 ℃조건에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 산물은 0.1% Ethidium bromide 를 첨가한 1% agarose gel(Qbiogene, CA, U.S.A)로 100V에서 60분간 전기영동을 실시하였고 UV 영상분석기를 통해 분절의 크기를 확인하였다.
- 선행연구가 일부 이루어진 바 있다. 본 연구에서는 ITS-1, 5.8S ribosomal DNA, ITS-2 등을 포함한 전체 internal transcribed spacer (ITS)를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하였다8-9). 고래 회충에 특이적인 DNA를 증폭하기 위한 프라이머와 PCR mixture 조성은 다음과 같다.
- 육안검사법에 의하여 확인된 고래회충의 유충을 새로운 eppendorf tube에 옮겨 담고, 500 ul Phosphate-Buffered Saline(PBS)를 첨가하여 세척 후 제거한 다음 500 ul 0.1N NaOH를 첨가하고 steal floating rack에 결합하여 10분간 끓는 물에 가열 후 냉각하였다. Phenol(Bioneer, Daejeon, Korea) 500 ul 를 첨가한 후 vortex시키고 5분 후, microcentrifuge (VS-15000N, Vision, Kyoimggi, Korea) 에 넣고 14, 000rpm에서 30분간 원심분리 하였다.
- 육안검사법에서 고래 회충 유충으로 확인된 개체를 대상으로 DNA를 추출하고 아니사키스 종에 특이적으로 반응하는 프라이 머 를 사용하여 중합효소연쇄 반응을 수행 하였다. 중합효소연쇄반응 결과에서 고래회충의 유전자 중 ITS-1, 5.
- 중합효소연쇄반응에서 얻어진 DNA fieagment를 제한 효소 절편 길이 다형성 분석에 사용하였다. DNA product 8ul와 10X reaction buffer 1 ul, Hinfi 또는 HhaI(W\J; Bioneer, Daejeon, Korea) 1 ul를 혼합하고 37 ℃조건에서 2시간 동안 반응시켰다.
대상 데이터
- 고래 회충 유충의 감염 여부를 조사하기 위하여 총 94 마리의 해산 어류를 2007년 9월부터 10월까지 수집하여 검사에 사용하였다. 어종별로는 갈치 18마리, 고등어 11마리, 오징어 65마리였으며, 서울, 경기도, 울진 등의 어시장 또는 소매시장에서 구매하여 육안검사에 사용하였다.
- 사용하였다. 어종별로는 갈치 18마리, 고등어 11마리, 오징어 65마리였으며, 서울, 경기도, 울진 등의 어시장 또는 소매시장에서 구매하여 육안검사에 사용하였다. 폭 0.
- 어종별로는 갈치 18마리, 고등어 11마리, 오징어 65마리였으며, 서울, 경기도, 울진 등의 어시장 또는 소매시장에서 구매하여 육안검사에 사용하였다. 폭 0.5~lmm X 15~20mm 길이를 가지는 유충을 육안으로 확인하여 채취하였으며 고래 회충의 유충과 특징이 동일한 개체를 분자생물학적 검사에 사용하였다(Table 1).
성능/효과
- bp의 2개 분절이 확인되었다. HinfI과 HhaI을 이용한 제한 효소 절편 길이 다형성 분석 결과에 따르면 본 연구에서 검출된 고래 회중의 유충은 Anisakis simplex complex 중에서 Anisakis pegreffii인 것으로 확인할 수 있었다8-9). 일본과 이탈리아에서는 A.
- 고등어 검체에 대한 육안검사법을 수행한 결과 총 11개체 중에서 10개체에서 Anisakis 유충이 발견되어 90.9%의 감염률을 보였다. 우 등10)의 연구조사에 의하면 고등어 20 개의 샘플 중 20개가 감염되어 100%의 감염률을 보였으며 이는 본 실험과 마찬가지로 상당히 높은 감염률을 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
- 고래 회충에 대한 육안검사법에서 고등어 또는 갈치의 감염률이 오징어보다 더 높음을 확인할 수 있었다. 특히 오징어의 경우 어시장에서 직접 구매한 가검물에서는 고래 회충의 감염을 확인할 수 없었으나 대형마트와 같은 소매시장에서 판매되는 경우 고래 회충 유충의 발견 빈도가 상대적으로 높은 양상을 관찰할 수 있었다.
- 있었다. 그러나 본 연구에서 사용된 중합 효소 연쇄반응은 고래회충과에 속하는 다른 유충들과는 반응하지 않기 때문에 음성반응을 보인 것으로 추정할 수 있었다. 따라서 중합효소연쇄반응에서 고래 회충 유충이 아닌 것으로 판명된 개체의 경우 어류에서 자주 검출되는 Pseudoterranove decipiens, Anisakis physeteris (향유고래회중) 등과 같은 종의 기생충으로 추정되며 이에 대한 추가적인 연구조사가 필요하다고 생각된다.
- 본 연구에서 수행된 고래 회충 육안검사법과 중합 효소 연쇄반응 검사법을 비교하였을 때 육안검사법에 의한 검출률이 보다 높게 나타났다. 그러나 고래 회중의 경우Anisakis pegreffii, Anisakis simplex sensu stricto, Anisakis simplex C를 포함하여 Anisakis simplex complex라고 통칭하며, 그 밖에 Anisakis typica, Anisakis ziphidarum, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi 등 형태적 특성 이매우 유사한 종들이 다수 존재하기 때문에 육안검사를 전적으로 신뢰하기는 어려운 점이 있었다또한 Anisakis spp.
- 5%)가 감염되어 있다고 보고하였으며, 조사대상 어류 중에서 가장 낮은 감염률을 보였다고 하였다. 본 연구에서도 오징어를 대상으로 한 아니사키스 유충 검출 빈도가 갈치, 고등어에 비하여 상대적으로 낮았는데, 우 등의 선행연구 결과와 유사한 경향을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 시중에서 판매되고 있는 갈치, 고등어, 오징어에 대한 고래 회충 감염정도를 육안검사법으로 조사하였는데, 총 94마리의 개체 중에 47마리(50.0%)의 개체에서 고래 회충으로 추정되는 유충이 관찰되었다(Table 1). 대부분의 고래 회충 유충은 어체의 소화기 장기에 부착된 형태로 발견되었고 일부는 소화기 장기의 내부에서 관찰되었으며, 근육에 이행한 경우는 관찰할 수 없었다.
- 오징어 65마리를 대상으로 육안검사를 수행한 결과 종 21마리에서 고래 회충으로 추정되는 유충이 발견되어 32.3% 의 감염률을 보였다. 이 중에서 어시장에서 가져온 개체에서는 Anisakis 유충이 발견되지 않았으며 경기도 안양시장과 서울 반포시장에서 획득한 샘플은 60%의 감염률을 보였다.
- 8%에서만 고래 회충의 유충으로 확인되었다. 오징어의 경우 육안검사법과 중합효소연쇄반응 검사법에서 각각 32.3%, 26.1%가 고래 회충 감염을 보이는 것으로 확인되어 두 검사법 간의 검출율이 상이한 것으로 확인되었다.
- 육안검사에 사용한 18개의 갈치 검체의 경우 총 16개체에서 아니사키스 유충이 검출되어 88.9%의 감염률을 보였다. 갈치 검체는 대형마트와 경기도 안양시장에서 수집되었는데 육안검사법에 의한 고래 회중 유중의 검줄율은각각 88.
- 8S rDNA subunit, ITS-2 region을 포함하는 Internal transcribed spacer에서 약 l, 000bp 길이의 특이적인 DNA 분절을 확인하였다. 육안검사에서 고래 회충으로 추정되는 유충 47개체 중에서 40개체가 PCR 양성반응을 보임으로써 추정된 개체대비 85%가 고래 회충으로 확인되었으며, 총 검체수 대비 43%의 해산어류에서 고래 회충 유충이 검출되었다(Table 2).
- 3% 의 감염률을 보였다. 이 중에서 어시장에서 가져온 개체에서는 Anisakis 유충이 발견되지 않았으며 경기도 안양시장과 서울 반포시장에서 획득한 샘플은 60%의 감염률을 보였다. 우 등10)은 선행연구에서 다양한 종류의 해산어류를 대상으로 아니사키스 유충의 감염 실태를 조사하였는데, 11개의 오징어 검체를 대상으로 육안검사를 실시하여 총 6개체(54.
- 중합효소연쇄반응 결과에서 고래회충의 유전자 중 ITS-1, 5.8S rDNA subunit, ITS-2 region을 포함하는 Internal transcribed spacer에서 약 l, 000bp 길이의 특이적인 DNA 분절을 확인하였다. 육안검사에서 고래 회충으로 추정되는 유충 47개체 중에서 40개체가 PCR 양성반응을 보임으로써 추정된 개체대비 85%가 고래 회충으로 확인되었으며, 총 검체수 대비 43%의 해산어류에서 고래 회충 유충이 검출되었다(Table 2).
- 중합효소연쇄반응에서 양성반응을 보인 40개의 PCR product를 제한효소 과 반응시킨 제한 효소 절편 길이 다형성 분석에서는 370, 300, 250bp 크기를 가지는 3개의 분절이 확인되었으며, Hhal과 반응시킨 결과에서는 550, 430 bp의 2개 분절이 확인되었다. HinfI과 HhaI을 이용한 제한 효소 절편 길이 다형성 분석 결과에 따르면 본 연구에서 검출된 고래 회중의 유충은 Anisakis simplex complex 중에서 Anisakis pegreffii인 것으로 확인할 수 있었다8-9).
후속연구
- pegreffii에 의한 감염 환자가 발생한 것으로 보고된 바 있으나, 국내에서는 아직 보고된 바가 없다"-'2). 그러나 국내에서 판매되는 어류에 A. pegreffii 의 존재가 확인됨으로써 식품위생학적측면 및 공중보건학적 측면에서도 관심을 기울일 필요가 있을 것으로 사료된다.
- 이는 유통경로에 의한 감염이라고는 볼 수 없으나, 유통 단계가 길어짐에 따라서 고래 회충 유충이 소화기 내강 또는 근육 장기로의 이동이 증가하여 검출빈도가 높아지는 것으로 추정하였다. 따라서 소매시장에서 구입한 고등어, 갈치 등을 섭취할 경우 고래 회충의 감염 또는 검출 빈도가 높으므로, 해산어류의 섭취시 내장을 제거하고 충분한 가열 조리를 하는 것이 고래회충유충증 예방을 위하여 필요할 것으로 보인다.
- 그러나 본 연구에서 사용된 중합 효소 연쇄반응은 고래회충과에 속하는 다른 유충들과는 반응하지 않기 때문에 음성반응을 보인 것으로 추정할 수 있었다. 따라서 중합효소연쇄반응에서 고래 회충 유충이 아닌 것으로 판명된 개체의 경우 어류에서 자주 검출되는 Pseudoterranove decipiens, Anisakis physeteris (향유고래회중) 등과 같은 종의 기생충으로 추정되며 이에 대한 추가적인 연구조사가 필요하다고 생각된다.
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