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제안 방법
- 0.3% 제초제를 살포하여 형질전환체로 확인된 76개체 중에서 pMOG6-Bar 17개체와 pCK-Bar 17개체를 대상으로 T1종자 파종하여 분리비와 유전자의 후대 유전여부를 확인하였다. 각 계통마다 100개체의 종자를 파종하였으며 발아된 개체를 대상으로 잎이 4-6엽 정도 되었을 때 0.
- 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다. To 식물체로부터 유도된 T1 들깨 종자들은 후대로의 안정된 유전자 전이를 확인하기 위하여 0.3% 바스타 제초제 살포로 확인하였다.
- 2, 1% BSA, 7% SDS, 100 ml salmon-sperm DNA)에 3 시간 동안 prehybridi ion 한 후reioactive probe 혈)를 이용하여 하루 동안 hybridization 하였다. mbe는 specific prim&를 이용하여 hptt nptH와 bar 유전자를 PCR로 증폭한 후 elution 하여 사용하였다 Hybridization 이 끝난 membra은 2 x SSC / 0.1% SDS (65℃)용액에서 10분 I X SSC /0.1% SDS용액 (65'C)에서 20분 세척 한 후 Bio-imaging analyzer (BAS-2000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 분석하였다.
- 운반체는 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 삽입하여 항생제 선발 농도 및 들깨 형질전환에 사용하였다. 기존에 알려진 들깨의 재분화 조건을 기초로 하여 항생제의 선발농도를 규명하였으며 pMOG6-Bar와 pCK-Bar 운반체를 이용하여 각각 hygromycin과 kanamycin선발농도를결정하였으며 적정 항생제 선발 농도는hygromycine 15 mg/L 와 kanamycine 125 mg/L 였다.
- 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부 터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다. 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다. To 식물체로부터 유도된 T1 들깨 종자들은 후대로의 안정된 유전자 전이를 확인하기 위하여 0.
- 접종하여 20시간 정도 배양하였다. 배양된 AmbacfeFium을 (OD=1) 5,000 rpni에서 5분 정도 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 호르몬이 없는 액체배지로 약 20배 희석한 후 6-8 일 배양한 들깨 배축과 아그로박테리움을 1시간 감염시켰다. 세균을 감염 후 멸균된 filter paper에 배축을 놓고 건조 후 공동 배양 배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3 mg/L BAP, 0.
- 본 실험에서는 hygromycin과 kanamycin을 1차 형질 전환선발 마커로 사용하고 2차 선발마커로는 basta제초제를 이용하여 들깨형질전환을 실시하고 유전자의 삽입과 발현을 확인하고 형질전환체의 특성을 확인하였다
- 분리하였다. 분리된 DNA를 Hindlll 제한효소로 절단하여 0.8% agarose gel에 전기 영동 하고 전기 영동이 끝난 gele capillary transfer 방법으로 nylon membrane| 전이시켰다, Membrane을 65℃ 에서 hybridization 용액 (0.5 M Na2PO4 pH 7.2, 1% BSA, 7% SDS, 100 ml salmon-sperm DNA)에 3 시간 동안 prehybridi ion 한 후reioactive probe 혈)를 이용하여 하루 동안 hybridization 하였다. mbe는 specific prim&를 이용하여 hptt nptH와 bar 유전자를 PCR로 증폭한 후 elution 하여 사용하였다 Hybridization 이 끝난 membra은 2 x SSC / 0.
- 3% 바스타 제초제 처리시 생존개체를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 Southern blot을 실시하였다. 분리한 genomic DNA를 H로 절단한 후에 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 항생제 유전자 (hygromycin, kanamycin)를 probe로 사용하여 1차로 hybridization을 실시하였으며 같은 membrane 을 deprobing한 후 bar 유전자를 probe로 2차 hybridization을실시하였다.
- 선발마커로 두종류의 항생제 (#와 #)와 제초제(bar) 유전자를 사용하여 아그로박테리움을 이용한 수정된 들깨 형질전환 방법을 개발하였다. 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가신 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다.
- 6)에 옮겨서 형질전환된 배축에만 shoot 가 유도되도록 하였다. 선발배지는 2주 또는 3주마다 새로운 배지로 계대배양을 하면서 형질 전환된 shoot 부분만을 절단하여 2차 선발배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3 mg/L BAP, 0.4% gelrite, 1.2 mg/L PPT, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에서 선발한 후에 뿌리 유도배지 (1/2 MS 기본배지, pH 5.8)에서 뿌리의 형성을 유도하였다. 위와 같은 방법들을 이용하여 선발한 재분화개체들 중 뿌리가 발달된 개체들은 배양 병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 수세하여 플라스틱의 순화용기에서 멸균된 질석 (venniculite)에 이식하여 순화하고 온실에서 재배하였다
- 배양된 AmbacfeFium을 (OD=1) 5,000 rpni에서 5분 정도 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 호르몬이 없는 액체배지로 약 20배 희석한 후 6-8 일 배양한 들깨 배축과 아그로박테리움을 1시간 감염시켰다. 세균을 감염 후 멸균된 filter paper에 배축을 놓고 건조 후 공동 배양 배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3 mg/L BAP, 0.4% gelrite)에서 25℃, 3일간#과 식물체를 공동배잉등였다, 공동 배잉힌Rxpl에서 표면에 Agrobacterium 을 제거하기 위하여 cefotaxime 250 mg/1 가 첨가된 MS 배지 (Murashige et al. 1962)에서 세척한 후 멸균된 종이에 올려 외부의 수분을 제거한 뒤 shoot를 유도하는 선발배지 (MS기본배지, 3% sucrose, 3 mg/L BAP, 0.01 mg/L NAA, 0.4% gelrite, 125 mg/L kanamycin 또는 15 mg/L hygromycin, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에 옮겨서 형질전환된 배축에만 shoot 가 유도되도록 하였다. 선발배지는 2주 또는 3주마다 새로운 배지로 계대배양을 하면서 형질 전환된 shoot 부분만을 절단하여 2차 선발배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3 mg/L BAP, 0.
- 운반체 pMOG6KB 유전자가 들어있는tumefaciens EHA 05를 rifampicin (50 //g/ml)과 kanamycin (501)과 이 포함된 YEP 배지에서 seedre한 후 1% 배양액을 접종하여 20시간 정도 배양하였다. 배양된 AmbacfeFium을 (OD=1) 5,000 rpni에서 5분 정도 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 호르몬이 없는 액체배지로 약 20배 희석한 후 6-8 일 배양한 들깨 배축과 아그로박테리움을 1시간 감염시켰다.
- 8)에서 뿌리의 형성을 유도하였다. 위와 같은 방법들을 이용하여 선발한 재분화개체들 중 뿌리가 발달된 개체들은 배양 병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 수세하여 플라스틱의 순화용기에서 멸균된 질석 (venniculite)에 이식하여 순화하고 온실에서 재배하였다
- 유전자도입과 발현이 확인된 들깨 형질전환체의 T1 종자를 100개체씩 온실에 파종하여 잎이 4-6엽 정도 되었을 때 0.3%의 바스타 제초제를 살포하였으며 형질전환체의 생존 여부에 따라서 제초제에 대한 저항성개체와 감수성 개체로 판별하였으며 분리비는 f 검정에 준하여 추정하였다.
- 재분화된 식물체의 유전자 도입여부를 확인하기 위하여 0.3% 바스타 제초제 처리시 생존개체를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 Southern blot을 실시하였다. 분리한 genomic DNA를 H로 절단한 후에 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 항생제 유전자 (hygromycin, kanamycin)를 probe로 사용하여 1차로 hybridization을 실시하였으며 같은 membrane 을 deprobing한 후 bar 유전자를 probe로 2차 hybridization을실시하였다.
- 파종 후 6-7일된 들깨의 배축을 이용하여 아그로박테리움과 공동배양으로 형질전환을 실시하였으며 pMOG6-Bar를 가진 균주는 hygromycin 15mg/L의 항생제를 이용하여 shoot를선발하였으며 pCK-Bar를 가진 균주는 kanamycin 125mg/L 로 형질전환 shoot를 1차로 선발하였다. 두 운반체를 가진 Agrobacterium을 배축과 공동배양 한 후 선발배지에 치상하였으며 치상한 배축은 2-3주 간격으로 새로운 배지로 옮겨주었으며 1개월이 경과하면 shoot가 형성되었으며 일부에서는 callus도 형성되었다.
대상 데이터
- 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가신 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다. 1차로 형성된 신초는 하이그로마이신(15 mg/L) 이나 카나마이신(125 mg/L)을 사용하여 선발하였고 재분화된 신초들은 확실한 형질 전환 체를 얻기 위해서 포스피노트리신(1.2 mg/L)에서 한번 더 선발하였다. 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부 터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다.
- pCK-Bar 운반체를 이용한 형질전환체의 경우 kanamycin 유전자가single copy로 삽입된 것이 확인된 개체는 1개체 였으며, 2 copy이상의 multicopy로 삽입된 12개체와 유전자 삽입이 확인되지 않는 개체가4개체였다. 그 중에서 53번과 54 번, 64번과 66번 개체는 서로 같은 밴드 패턴을 지니고 있어서 형질전환시에 같은 shoot에서 유래할 수도 있음을 알 수 있다.
- 이용하였다. pMOG6-Bar 운반체는 연구소에서 사용하던 것을 이용하였으며 (Lee et al. 2000) pCK-Bar 운반체는 pMOG6-Bar 운반체의 bar 유전자를 Hindlll로 절단 한 후 pCambia 2300에 클로닝하여 kanamycin 저항성 npt와 제초제 저항성 bar 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 만들었다 (Figure 1). 작성된 형질전환용 운반체DNA는, 4groZ>ac/er tumefaciens EHA105에 삽입하여 들깨 형질전환용으로 사용하였다.
- 개발하였다. 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가신 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다. 1차로 형성된 신초는 하이그로마이신(15 mg/L) 이나 카나마이신(125 mg/L)을 사용하여 선발하였고 재분화된 신초들은 확실한 형질 전환 체를 얻기 위해서 포스피노트리신(1.
- 2 mg/L)에서 한번 더 선발하였다. 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부 터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다. 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다.
- 선발 마커로 hygromycin 저항성 유전자 f와 제초제 저항성 유전자인 bar를 가진 pMOG6-Bar 운반체와 kanamycin 저항성 유전자 npt와 제초제저항성 bar 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 이용하였다. pMOG6-Bar 운반체는 연구소에서 사용하던 것을 이용하였으며 (Lee et al.
- 온실에서 재배한 엽실들깨 (Perilla frutescens var japonica H. var Yeupsil)를 형질전환의 재료로 사용하였다. 들깨 (엽실) 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지하고 멸균수로 3회 세척한 후 50% 락스에 20분간 침지한 다음에 멸균수로 3-4회 세척하였다.
- 이용하였다. 운반체는 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 삽입하여 항생제 선발 농도 및 들깨 형질전환에 사용하였다. 기존에 알려진 들깨의 재분화 조건을 기초로 하여 항생제의 선발농도를 규명하였으며 pMOG6-Bar와 pCK-Bar 운반체를 이용하여 각각 hygromycin과 kanamycin선발농도를결정하였으며 적정 항생제 선발 농도는hygromycine 15 mg/L 와 kanamycine 125 mg/L 였다.
- 않았다. 자엽을 이용하여 형질전환한 경우가 형질전환체의 형성이 양호하여서 자엽을 이용하여 pMOG6-Bar 운반체를 이용하여 PPT 선발로 200여 개체의 재분화 식물체를 획득하였다. 재분화 식물체의 형질전환여부를 확인하기 위하여 03%의 바스타 제초제를 살포시 모든 개체가 고사하여 형질전환체를 확인할 수 없었다 (data not shown).
- 2000) pCK-Bar 운반체는 pMOG6-Bar 운반체의 bar 유전자를 Hindlll로 절단 한 후 pCambia 2300에 클로닝하여 kanamycin 저항성 npt와 제초제 저항성 bar 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 만들었다 (Figure 1). 작성된 형질전환용 운반체DNA는, 4groZ>ac/er tumefaciens EHA105에 삽입하여 들깨 형질전환용으로 사용하였다.
- 항생제 (hygromycin, kanamycin)와 PPT로 이 중 선발 후생존 개체를 순화하여 온실에 재배하였으며 재분화 개체수는pMOG6-Bar와 pCK-Bar 운반체가 각각 40개체였다. pMOG6-Bar 운반체를 이용한 형질전환율은 1.
- 형질전환체 선발을 위한 운반체로 #와 bar 유전자가 포함된 pMOG6-bar와 #와 bar 유전자가 포함된 pCK-Bar 운반체를 이용하였다. 운반체는 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 삽입하여 항생제 선발 농도 및 들깨 형질전환에 사용하였다.
이론/모형
- 분리된 total RNA 10 ng을 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동 한 다음 capillary transfer 방법으로 nylon menane에 전이시켰다. Hybridization 반응과 tnembrane의 세척은 Soufliem 분석과 같은 방법으로 실* 시하였다
- 유전자를 사용하였다. 분리된 total RNA 10 ng을 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동 한 다음 capillary transfer 방법으로 nylon menane에 전이시켰다. Hybridization 반응과 tnembrane의 세척은 Soufliem 분석과 같은 방법으로 실* 시하였다
- 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여 Northern 비ot을수행하였으며 형질전환된 들깨 잎으로부터 total RNA의 분리는 Smith 등 (1986)의 방법에 따라 수행하였으며 probe로는 bar 유전자를 사용하였다. 분리된 total RNA 10 ng을 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동 한 다음 capillary transfer 방법으로 nylon menane에 전이시켰다.
- 재분화개 체의 형질전환여부를 확인하기 위하여 Southern blot을 수행하였으며 (Southern 1975) 들깨의 genomic DNA 는 mCTAB 방법 (Hwang and Kim 2000)에 따라 분리하였다. 분리된 DNA를 Hindlll 제한효소로 절단하여 0.
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