[논문]Edwardsiella tarda에 대한 미꾸라지의 항체 특성과 PS-K의 면역증강효과 분석

전려진; 이영; 김명석; 정현도

Edwardsiella tarda에 대한 미꾸라지의 항체 특성과 PS-K의 면역증강효과 분석
Characterization of Antibody and Enhanced Immune Response by PS-K against Edwardsiella tarda in Loach Misgurnus mizolepis 원문보기

韓國養殖學會誌 = Journal of aquaculture, v.21 no.4, 2008년, pp.325 - 330

전려진 (부경대학교 수산생명의학과) , 이영 (국립수산과학원 고성수산사무소) , 김명석 (국립수산과학원 병리연구팀) , 정현도 (부경대학교 수산생명의학과)

초록
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본 연구에서는 우리나라에서 분리된 E. tarda KFE와 일본에서 분리된 E. tarda Edk-2 두 균주의 항혈청을 만들어 생산된 항체의 특성과 방어효과를 분석하고자 하였다. 우리나라에서 많이 양식되어지고 있는 담수어인 미꾸라지를 사용하여 위의 두 가지 분리균주의 항원성에 있어서의 차이점을 조사하고자 하였다. 미꾸라지를 E. tarda 두 균주의 FKC로 각각 면역시킨 후의 혈청내 특이 항체량은 E. tarda KFE 균주로 면역시켰을 때에 비해 E. tarda Edk-2 균주로 면역시켰을 때 훨씬 높은 수치를 나타내었다. 그리고 교차반응 분석에서는 두 균주 간에 공통 항원이 미약하게 존재하는 것을 확인하였으며 미꾸라지 항혈청의 살균효과를 보았을 때에는 두 종류의 항혈청 모두에서 항체의 살균 능력이 있음을 확인하였다. 감염 예방 효과를 가지고 있는 polysaccharide-bound protein (PS-K)을 미꾸라지에 주사한 후 1주째에 E. tarda KFE 분리균주로 공격 실험을 실시하여 본 결과 누적 폐사율이 감소하였으므로, PS-K의 투여는 E. tarda를 포함한 세균성 감염에 대한 효과적인 감염 대책 방안의 하나가 될 수 있음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Two different Eelwardsiella tarda isolates, KFE and Edk-2, were obtained from Korea and Japan respectively. On the base of the previous results showing higher pathogenicity of E. tarda KFE compared to that of E. tarda Edk-2 isolate, we tried to determine the differences of antigenicities of these two isolates in loach which is one of the important species in freshwater aquaculture in Korea. Concentration of specific antibody in the serum appeared to be much higher in loach immunized with FKC of E. tarda Edk-2 than those found in loach immunized with FKC of E. tarda KFE. Cross-reaction analysis using agglutination test with normal and antigen-absorbed antisera implied the differences epitopes in the antigens of these E. tarda isolates. For the comparison of bactericidal activity of the produced antibody with different antigens, absorption analysis was performed and confirmed the presence of critical epitopes in the FKC of E. tarda KFE strain. The prophylactic agent, polysaccharide-bound protein (PS-K) injected 1 week before the artificial infection with E. tarda KFE isolates decreased the cumulative mortality in loach and would be on effective method to prevent the occurrence of bacterial infection including E. tarda.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

각 균주의 항원을 제작하여 미꾸라지에 접종한 후 응집항체와 각 균주에 대한 미꾸라지 항혈청의 교차반응 및 살균 능력 등을 관찰함으로써 병원성과 항원의 변화 그리고 이에 대응하는 미꾸라지의 방어체계 변화를 분석하였다. 동시에 E. tardd八 미꾸라지에 대해서도 병원성이 있다면 그에 대한 예방책으로, 세균병에 대한 저항력 증강효과가 있다고 보고되어 있는 PS-K의 투여효과를 분석하고자 하였다.
본 연구에서는 미꾸라지를 사용하여 면역혈청학적 방법£로 각기 다른 병원성을 갖고 있는 두 종의 E. tarda 분리균주에 대한 항원성을 비교하고자 하였다. 항원 투여 후 면역반응 분석은 체액성 면역반응 분석을 위해 응집항체가를 실시하였다.
본 연구에서는 우리나라에서 분리된 E. tarda KFE와 일본에서 분리된 E. tarda Edk-2 두 균주의 항혈청을 만들어 생산된 항체의 특성과 방어효과를 분석하고자 하였다.
우리나라에서 많이 양식되어지고 있는 담수어인 미꾸라지를 사용하여 위의 두 가지 분리균주의 항원성에 있어서의 차이점을 조사하고자 하였다. 미꾸라지를 E.

제안 방법

tarda 항체의 측정은 儷 96 well plate에 연속적으로 2배 희석된 항혈청을 각 well에 50 叫씩 가하고 준비된 항원을 4mg/mL로 50(1L씩 첨가하여 습윤기에서 실온, overnight 동안 반응시킨 후 응집괴가 형성되는 최대 희석 배수를 응집항체가로 결정하였다. E. tarda Edk-2와 E. tarda KFE에 대한 미꾸라지, 넙치 및 토끼 항혈청과 E tarda Edk-2, E. tarda KFE, Vibrio anguillarum HUFP5001, Yersinia ruckeri 11-4, E. tarda H-4의 FKC로 응집 항체가를 측정하여 교차반응을 비교하였다.
, 1989)에 따라 제조하여 미꾸라지를 면역시키는 항원과 항혈청의 응집 항체가 즉정 시 항원으로 사용하였다. E. tarda Edk-2와 E. tarda KFE의 FKC를 PBS로 3번 washing한 후 동량의 FCA (Freund's Complete Adjuvant, Sigma)와 혼합하여 어 체중 1 kg 당 10 mg의 농도로 0.1 mL씩 복강 주사하였다. 넙치와 토끼의 항혈청은 실험실에서 제작되어 보관하고 있는 것을 사용하였다.
E. tarda KFE와 E. tarda Edk-2의 FKC (10 mg/Kg body weight)를 미꾸라지의 복강내에 접종 후 혈청내 특이 응집 항체 가를 분석하였斗. 접종 후 2주째부터 두 그룹 모두 응집항체가가 증가하기 시작하여 3주째에 최고 수준에 도달하였으며 그 후 서서히 감소하였으나 7주째까지 검출되어졌다.
PS-K의 세균성 질병 예방효과를 보기 위하여서는 PS-K를 0.1 mg/g 당 어체중의 농도로 복강주사한 후 1주째에 E. tarda KFE를 배양, 세척한 후 106 cfu/fish 농도로 실험구당 10 개체에 각각 0.1 mL씩 복강 주사하여 7일간의 누적 폐사율을 조사하였다. 대조구로는 실험어에 PBS를 0.
일본의 뱀장어에서 분리한 £. tarda Edk-2와 우리나라의 넙치에서 분리한 E. tarda KFE를 API 20E kit를 사용하여 E. 切da임을 확인한 후 사용하였다.
tarda 세균 부유액과 1:1로 혼합하여 실험하였다. 세균과 희석된 혈청 혼합액을 25。。로 조정된 진탕 배양기로 반응시키면서 0, 1, 3, 6 시간 경과할때마다 단계 희석하여 Bosnea et al. (2000)에 따라 균집락 수를 계수하여 생균수를 측정하였다.
tarda KFE 두 균주의 항원성에 대한 연구로 혈청학적인 방법을 이용하였다. 각 균주의 항원을 제작하여 미꾸라지에 접종한 후 응집항체와 각 균주에 대한 미꾸라지 항혈청의 교차반응 및 살균 능력 등을 관찰함으로써 병원성과 항원의 변화 그리고 이에 대응하는 미꾸라지의 방어체계 변화를 분석하였다. 동시에 E.
공격실험으로 미꾸라지의 세균성 감염에 대한 PS-K의 방어력 증강효과를 보았다. E.
tarda KFE 에 대한 넙치 , 토끼의 항혈청 500 μ[, 에 현탁시켜 25。。에서 1시간 동안 교반하면서 흡착하였다. 그리고 다시 10,000 g에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 이용하여 미꾸라지 항체의 살균 능력 조사에 사용하였다.
1 mL씩 복강 주사하여 7일간의 누적 폐사율을 조사하였다. 대조구로는 실험어에 PBS를 0.1 mL씩 복강 주사한 후 1주째에 동일한 방법으로 생균을 주사하였다.
박 등(1997) 의 보고에서, 나일 틸라피아에 있어서 E. tarda의 감염에 대하여 PS-K가 최대의 방어력 증강 효과를 나타내는 것을 0.1 mg/g 당 어체중의 농도의 PS-K를 복강 주사로 투여한 뒤 7일이 지난 후 임을 알 수 있었고, 이러한 결과는 glucan 등을 연어에 대해서 실험했을 때 3-8일 후 최대의 방어력 증강 효과가 있다는 Robertsen et al. (1990) 와 유사하였으그로, 본연구에서는 이를 기준으로 PS-K 투여 농도 및 투여 후의 기간을 결정하였다. PS-K 투여 후 병원성이 강한 E.
본 연구에서는 병원성이 약한 E. tarda Edk-2 그리고 병원성이 강한 E. tarda KFE 두 균주의 항원성에 대한 연구로 혈청학적인 방법을 이용하였다. 각 균주의 항원을 제작하여 미꾸라지에 접종한 후 응집항체와 각 균주에 대한 미꾸라지 항혈청의 교차반응 및 살균 능력 등을 관찰함으로써 병원성과 항원의 변화 그리고 이에 대응하는 미꾸라지의 방어체계 변화를 분석하였다.
tardcfe 대하여 항체가가 1:960 으로 동일한 것으로 사용하였고, 대조구로는 PBS가 접종된 미꾸라지 혈청을 사용하였다. 살균 반응은 각 실험구의 혈청과 GVB2+ (gelatin veronal buffer; veronal buffer 200 mL, 1% gelatin solution 50 mL, 0.02M CaCl2 - 2H₂O 5 mL, 0.1M MgCl2 . 6H₂O 5 mL, DW 740 mL pH 7.4)를 1:12 로 혼합 희석한 다음, IO, cfa/mL 으로 조정된 E. tarda 세균 부유액과 1:1로 혼합하여 실험하였다. 세균과 희석된 혈청 혼합액을 25。。로 조정된 진탕 배양기로 반응시키면서 0, 1, 3, 6 시간 경과할때마다 단계 희석하여 Bosnea et al.
살균 작용 시험의 결과 판정은 항혈청과 실험균 E. tard硅 반응시켜 시간 경과별로 나타나는 생균수의 변화를 지표로 하였다. 여기에 사용된 항혈청은 각 E.
주사한 후 1, 2, 3, 5, 7 주째에 실험어의 미부정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였다. 혈청내 형성된 항 E.
tarda 분리균주에 대한 항원성을 비교하고자 하였다. 항원 투여 후 면역반응 분석은 체액성 면역반응 분석을 위해 응집항체가를 실시하였다. 실험 전 기간에 걸쳐 E.
항혈청의 교차반응성을 응집항체가 측정법으로 분석하여 보았다. E.
혈청을 분리하였다. 혈청내 형성된 항 E. tarda 항체의 측정은 儷 96 well plate에 연속적으로 2배 희석된 항혈청을 각 well에 50 叫씩 가하고 준비된 항원을 4mg/mL로 50(1L씩 첨가하여 습윤기에서 실온, overnight 동안 반응시킨 후 응집괴가 형성되는 최대 희석 배수를 응집항체가로 결정하였다. E.

대상 데이터

실험어는 평균 어체중 15 g 정도의 시판되고 있는 양^산 미꾸라지를 구입하였으며 외관상 질병의 증세가 나타나지 않는 건강한 개체들을 사용하였다. 실험어를 50 L용량의 실험용 수조에 수용하고 수온을 251 로 유지하여 2주정도 순치 시킨 후 실험에 사용하였다.
tard硅 반응시켜 시간 경과별로 나타나는 생균수의 변화를 지표로 하였다. 여기에 사용된 항혈청은 각 E. tardcfe 대하여 항체가가 1:960 으로 동일한 것으로 사용하였고, 대조구로는 PBS가 접종된 미꾸라지 혈청을 사용하였다. 살균 반응은 각 실험구의 혈청과 GVB2+ (gelatin veronal buffer; veronal buffer 200 mL, 1% gelatin solution 50 mL, 0.

성능/효과

2). E. tarda Edk-2에 대한 항혈청의 살균효과를 보았을 때에는, PBS를 접종한 대조구 혈청과 반응시킨 E. tarda Edk-2의 실험 시작시의 세균수가 1.06x10, cfii/mL에서 6시간 경과 후에는 2.73xlO₅ cfWmL로 약 3배 정도로 증가한 것에 비해, E. tarda Edk-2에 대한 항혈청과 반응시켰을 때는 반응 시작시의 세균 수에 비해 거의 증가하지 않았다. 그리고 E.
증강효과를 보았다. E. tarda KFE 균주로 복강주사한 후 실험구별 누적 폐사율을 조사해본 결과, PBS를 주사한 대조구에서는 1일째부터 폐사가 나타나기 시작하여 7일째까지 누적 폐사율이 75%인데 비해 PS-K를 복강 주사한 실험구에서는 2일째부터 폐사가 나타나기 시작하여 7일째까지 누적 폐사율이 35%이었으므로 대조구에 비해 상대적으로 낮은 누적 폐사율을 보여주었다(Fig. 4). PS-K 를 투여한 실험구에서 7일 이후로 폐사하는 개체는 없었다.
E. tarda KFE에 대한 항혈청의 살균효과 실험결과, PBS를 접종한 대조구 혈청과 반응시킨 E. tarda KFE의 실험 시작 시의 세균수가 7.0x10, cfii/mL에서 반응 6시간 경과 후에는 6.55시俱 cfu/mL 로 약 9배 정도 증가한 것에 비해, E. tarda KFE에 대한 항혈청과 반응시켰을 때는 시작시의 세균수에 비해 약 2배 정도로만 증가하였다. E.
tarda KFE 항원을 투여한 실험구에 비해 £. tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구의 혈청 내 특이 항체가와 특이 항체 생성 세포의 수치가 높게 나타났다. 특히 면역 후 3주째의 혈청내 특이 항체가는 E.
그리고 교차반응 분석에서는 두 균주 간에 공통 항원이 미약하게 존재하는 것을 확인하였으며 미꾸라지 항혈청의 살균효과를 보았을 때에는 두 종류의 항혈청 모두에서 항체의 살균 능력이 있음을 확인하였다. 감염 예방 효과를 가지고 있는 polysaccharide-bound protein (PS-K)을 미꾸라지에 주사한 후 1주째에 E. tarda KFE 분리균주로 공격 실험을 실시하여 본 결과 누적 폐사율이 감소하였으므로, PS-K의 투여는 E. tard(這 포함한 세균성 감염에 대한 효과적인 감염 대책 방안의 하나가 될 수 있음을 확인하였다.
tarda Edk-2에 대한 항혈청과 반응시켰을 때는 반응 시작시의 세균 수에 비해 거의 증가하지 않았다. 그리고 E. tarda Edk-2의 FKC로 흡착시킨 항혈청과 반응시켰을 때에는 실험 시작시의 세균수z가 8.9x10, cfii/mL 에서 &시간 경과 후에는 1.81x105 cfu/ml로 나타나 살균효과의 감소를 보여 주었으나 E. tarda KFE의 FKC로 흡착시킨 항혈청과 반응 시켰을 때는 시작당시 exlO'clU/mL어서 6시간 경과 후 1.22x10s cfu/mle 나타나 뚜렷한 살균 효과의 감소를 보여주지 않았다(Fig. 3).
tarda Edk-2 균주로 면역시켰을 때 훨씬 높은 수치를 나타내었다. 그리고 교차반응 분석에서는 두 균주 간에 공통 항원이 미약하게 존재하는 것을 확인하였으며 미꾸라지 항혈청의 살균효과를 보았을 때에는 두 종류의 항혈청 모두에서 항체의 살균 능력이 있음을 확인하였다. 감염 예방 효과를 가지고 있는 polysaccharide-bound protein (PS-K)을 미꾸라지에 주사한 후 1주째에 E.
01^105 cfu/S. 나타나 살균효과의 감소를 보여 주었으나 E. tarda Edk-2의 FKC 로 흡착시킨 항혈청과 반응 시켰을 때는 시작당시 9.6시0七卸 mL에서 6시간 경과 후 1.6x105 cfU/mL로 나타나 살균 효과의 감소를 보여주지 않았다(Fig. 2). E.
조사하고자 하였다. 미꾸라지를 E. tarda 두 균주의 FKC로 각각 면역시킨 후의 혈청내 특이 항체량은 E. tarda KFE 균주로 면역시켰을 때에 비해 E. tarda Edk-2 균주로 면역시켰을 때 훨씬 높은 수치를 나타내었다. 그리고 교차반응 분석에서는 두 균주 간에 공통 항원이 미약하게 존재하는 것을 확인하였으며 미꾸라지 항혈청의 살균효과를 보았을 때에는 두 종류의 항혈청 모두에서 항체의 살균 능력이 있음을 확인하였다.
본 연구에서 E. tarda KFE와 E. tarda Edk-2에 대한 미꾸라지 항혈청의 살균효과를 보았을 때 E. tarda KFE의 항혈청이 대조구와 비교하여 많은 차이를 보였으나 E. tarda Edk-2의 항혈청도 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였으므로 두 종류의 항혈청 모두에서 항체의 살균 능력이 있음을 확인하였다. 흡착된 항혈청과 반응시키는 실험에서도 대조구와 비교해 보았을 때 살균효과를 보여주었다(Fig.
서로 다른 E. tarda의 항원에 의하여 생성된 항혈청이 나타내는 교차반응을 분석하여 보았을 때 E. tarda Edk-2에 대한 미꾸라지 항혈청과 E. tarda KFE에 대한 미꾸라지 항혈청은 비교적 낮은 교차 반응을 보여주었다. 그러나 국내에서 분리된 £ tarda H-4와 E.
항원 투여 후 면역반응 분석은 체액성 면역반응 분석을 위해 응집항체가를 실시하였다. 실험 전 기간에 걸쳐 E. tarda KFE 항원을 투여한 실험구에 비해 E. tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구의 혈청내 특이 항체가 높게 나타났으며 특히 면역 후 3주째의 혈청내 특이 항체가는 E. tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구가 E. tarda KFE 항원을 투여한 실험구에 비해 3.2배 정도 높았다. 이는 병원성이 높은 E.
어종이 다른 주요 해산어인 넙치의 항혈청에서도 이와 동일한 반응이 나타났으며 포유류인 토끼의 항혈청에서도 이와 동일한 반응을 볼 수 있었다(Table 1). 이러한 본 실험에서 얻어진 결과로 볼 때 우리나라의 넙치에서 분리된 E. tarda KFE와 일본의 뱀장어에서 분리된 E. tarda Edk-2 균주 사이에서는 공통적인 항원이 미약하게 존재하며 국내의 넙치에서 분리된 E tarda H-4와 E. tarda KFE 사이에서는 다수의 공통항원이 존재하는 것으로 볼 수 있다. 그러므로 E.
이상의 결과를 종합하여 볼 때 E. tarda KFE는 E. tarda Edk-2에 비하여 강한 병원성을 가지고 있으며, 위의 두 E. tarda 균주는 항원성에 있어서도 많은 차이를 보여주었는데 E. tarda Edk-2가 더 강한 항원성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 그리고 PS-K 투여가 미꾸라지의 감염예방에 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
PS-K 투여 후 병원성이 강한 E. tarda 첨가 KFE 균주를 LDs。이상의 농도로 복강주사 하는 방법으로 공격 실험을 실시하여 미꾸라지의 세균성 감염에 대한 PS-K의 방어력 증강 효과를 관찰한 결과, 누적 폐사율이 75% 이었던 대조구에 비해 PS-K를 복강 주사한 실험구에서 누적 폐사율 35% 로서 상대적으로 낮은 누적 폐사율을 보여주었으므로 PS-K는 방어력 증강에 좋은 효과를 나타내어 감염 대책 방안의 하나가 될 수 있음을 확인하였다(Fig. 4). 박 등(1997) 이 나일 틸라피아를 사용하여 PS-K가 질병에 대한 방어력을 증강시켜주는 기작에 관하여 연구하여 본 결과, PS-K가 식세포의 활성을 증가시켜 비특이적 면역반응을 증강시켜주는 효능을 가지고 있으며 B 세포의 활성에도 영향을 미쳐 특이적 면역반응까지 증강시켜주므로 결과적으로 질병에 대한 방어력 증강을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다.
접종 후 2주째부터 두 그룹 모두 응집항체가가 증가하기 시작하여 3주째에 최고 수준에 도달하였으며 그 후 서서히 감소하였으나 7주째까지 검출되어졌다. 전체 실험 기간에 걸친 응집 항체 역가의 비교에서 E. tarda Edk-2의 FKC를 투여한 실험구의 혈청내 특이 응집 항체가는 E. tarda KFE의 FKC를 접종한 실험구에 비해 4배 이상 높게 나타났다(Fig. 1).
tarda Edk-2의 FKC (10 mg/Kg body weight)를 미꾸라지의 복강내에 접종 후 혈청내 특이 응집 항체 가를 분석하였斗. 접종 후 2주째부터 두 그룹 모두 응집항체가가 증가하기 시작하여 3주째에 최고 수준에 도달하였으며 그 후 서서히 감소하였으나 7주째까지 검출되어졌다. 전체 실험 기간에 걸친 응집 항체 역가의 비교에서 E.
tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구의 혈청 내 특이 항체가와 특이 항체 생성 세포의 수치가 높게 나타났다. 특히 면역 후 3주째의 혈청내 특이 항체가는 E. tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구가 E. tarda KFE 항원을 투여한 실험구에 비해 3.2배 정도 높았으며, 면역 후 3주째의 특이 항체생성 세포의 수는 E. tarda Edk-2 항원을 투여한 실험구에서 E. tarda KFE 항원을 투여한 실험구에 비해 3.9배 정도 높았으므로 E. tarda KFE 에 비해 E. tarda Edk-2 균주의 항원성이 더 강하다는 것을 알 수 있었斗.

후속연구

박 등(1997) 이 나일 틸라피아를 사용하여 PS-K가 질병에 대한 방어력을 증강시켜주는 기작에 관하여 연구하여 본 결과, PS-K가 식세포의 활성을 증가시켜 비특이적 면역반응을 증강시켜주는 효능을 가지고 있으며 B 세포의 활성에도 영향을 미쳐 특이적 면역반응까지 증강시켜주므로 결과적으로 질병에 대한 방어력 증강을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 이러한 방어 기작에 대한 분석이 틸라피아와는 다른 어종인 미꾸라지에서는 이루어지지 않았으므로 향후 좀 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다. PS-K 이외에도 어류의 면역반응을 증강시켜 질병에 대한 저항성을 증진시킨다고 보고되어 있는 Glucan (Jorgensen et al.
tarda Edk-2가 더 강한 항원성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 그리고 PS-K 투여가 미꾸라지의 감염예방에 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
그리고 방(1993) 의 연구에서 우리나라의 넙치에서 분리된 분리균주와 일본의 뱀장어에서 분리된 분리균주를 혈청학적으로 비교해 보았을 때 공통항원면에서 서로 유사성이 많은 균주가 보고되었지만 몇몇 분리균주는 매우 다른 혈청학적인 특성을 갖고 있음도 보고된 바가 있다. 따라서 본 연구의 결과만으로는 균주가 분리된 지역 및 어종에 따라 항원조성의 차이가 많은 것으로 보여지지만 보다 많은 지역 및 여러 어종 유래 균주에 대하여 조사한다면 또 다른 결과가 나올 수도 있을 것이다.

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상세보기
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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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