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문제 정의
- 고본이 IFN-γ와 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, 고본의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지 여부를 확인하기 위하여 MTT assay를 통하여 고본의 쥐의 복강 대식세포에 대한 세포독성을 알아보았다.
- 생리적 조건에서 NO는 종양이나 기생충, 세균 등의 방어에 관여하는 반면 과도하게 생성된 NO는 toxic radical로 작용하여 세포나 조직의 손상을 일으킨다18).본 실험에서는 SNP를 이용하여 NO 생성을 유도하였으며 고본이 생성된 NO 소거에 미치는 영향을 조사하였다. 고본은 농도의존적으로 NO를 소거시켰으나 DPPH radical이나 superoxide radical 소거능에 비해서 약한 활성을 나타냄을 알 수 있었다(Fig.
- 본 연구에서는 85% 메탄 올로 추출된 고본(Angelica tenuissima Nakai)이 IFN-γ와 LPS로자극된 쥐의 복강 대식세포에서 나타나는 염증관련 지표들에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.
- 이에 본 실험에서는 DPPH radical 소거효과, superoxide anion 소거능 및 nitric oxide 소거능을 통해 고본의 항산화 효과를 알아보았으며, IFN-γ와 LPS로 자극된 쥐의 복강 대식세포에서 염증 매개물인 NO 생성 및 iNOS, COX-2 발현에 고본이 어떠한 영향을 미치는지 조사하여 유의성있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- DPPH radical에 대한 고본의 영향을 관찰하기 위해 Gyamfi 등의 방법10)을 응용하여 실험하였다. 0.
- Griess 시약을 이용하여 쥐의 복강 대식세포에서 IFN-γ와 LPS에 의해 유도된 NO2- 의 양을 측정하였으며, 고본의 NO 생성 저해 활성을 실험하였다.
- IFN-γ와 LPS에 의해 생성되는 NO의 양은 세포배양액에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다.
- 또한 고본은 함유성분 측면에서 볼 때 천궁과 많이 유사하다고 볼 수 있어서 성분에 대한 약리 작용은 천궁과 비슷할 것으로 사료되며, Li 등은16) 천궁의 물 추출물에서 hydroxyl radical 소거능을 확인하였다. Ka 등과 Li 등의 보고는 고본의 항산화능에 대한 가능성을 시사한다고 생각하며 이에 본 실험에서는 in vitro radical 소거능 측정을 통해 고본 메탄올 추출물의 항산화능을 검정하였다.
- Sodium nitroprusside (SNP; 5 mM) 495 ㎕와 여러 농도의 고본 추출물 5 ㎕를 잘 섞은 다음 실온에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. SNP에 의해 생성된 NO에 대한 고본의 효과는 Griess reagent (1% sulphanilamide and 0.1% naphthyletylenediamine dihydrochloride in 2.5% H3PO4)와 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였으며, 결과는 % inhibition으로 환산하여 표기하였다.
- Sodium nitroprusside (SNP)는 빛의 노출에 의해 NO를 방출시키는 무기물질로서 본 실험에서는 5 mM의 SNP와 고본을 2 시간 30분 동안 반응시켜 고본이 SNP의 NO 방출에 미치는 영향을 조사하였다. 고본은 농도가 증가함에 따라 nitric oxide 소거 능이 증가하는 경향을 보였는데 최대농도인 1000 ㎍/㎖의 농도에서의 소거능이 20.
- Superoxide radical (•O2-)에 대한 소거능 (SOD mimic activity)은 Ibrahim 등의 방법 11) 을 일부 수정하여 사용하였다.
- 고본의 NO 생성 억제 기전을 알아보기 위하여 쥐의 복강 대식세포의 iNOS 단백질의 발현량을 immunoblot analysis를 통하여 분석하였다. IFN-γ/LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질은 고본 1000 ㎍/㎖ 투여군에서 현저히 감소하여 iNOS의 발현이 거의 관찰되지 않았다(Fig.
- - 의 양을 측정하였으며, 고본의 NO 생성 저해 활성을 실험하였다. 고본의 메탄올 추출물은 각각 10, 100, 1000 ㎍/㎖로 처리하였으며 농도에 따라서 32.6%, 78.7%, 87.9% 으로 유의성있는 NO 생성 저해 효과를 나타내었다(Fig. 4).
- 고본의 전자 공여능에 의한 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH radical에 대한 소거율을 측정하였다. 실험결과 10, 100 ㎍ /㎖의 농도에서는 각각 8.
- 고본의 항산화 효과를 알아보기 위해 먼저 DPPH에 대한 고본의 전자공여능을 측정하였다. DPPH는 radical을 갖는 물질 가운데 비교적 안정한 화합물로 항산화 물질의 전자 공여능에 의해 DPPH radical을 포획하기 때문에 보라색이 소실되며 이를 통해 시료의 항산화 활성을 알아볼 수 있다17).
- DPPH는 radical을 갖는 물질 가운데 비교적 안정한 화합물로 항산화 물질의 전자 공여능에 의해 DPPH radical을 포획하기 때문에 보라색이 소실되며 이를 통해 시료의 항산화 활성을 알아볼 수 있다17). 고본의 항산화능은 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid를 대조군으로 하여 비교하 였으며, 실험결과 고본은 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 활성을 나타내었다(Fig. 1).
- 고본이 농도에 따라 보여준 NO 생성 저해 활성이 고본의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 비롯된 것인지 확인하기 위하여, 쥐의 복강 대식세포에 고본을 처리한 다음 MTT assay를 통하여 세포 생존도를 측정하였다. 실험결과 고본은 모든 투여 농도에서 유의성있는 세포독성을 나타내지 않았으며 오히려 IFN-γ와 LPS 처리에 의한 10% 정도의 세포 독성이 고본의 투여 농도 증가에 의해 유의성 있게 정상 수준까지 회복되는 결과를 보였다(Fig.
- 05 U/㎖)을 첨가하여 반응을 시작하였으며 37℃에서 20분간 반응시킨 후 2 ㎖의 SDS (69 mM)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 대조군은 시료 대신 D.W를 넣어 실험하였고 570 nm에서 흡광도를 측정하여 NBT의 감소량을 확인하였다.
- 복강 macrophage를 3 × 105 cells/well 이 되도록 24 well plate에 분주한 다음 여러 농도의 고본 (10, 100, 1000 ㎍/㎖)을 처리하고 IFN-γ 103 U/㎖와 LPS 1 ㎍/㎖을 처리하여 48 시간 동안 배양하였다.
- 본 실험에서는 쥐의 복강 대식세포에서 고본의 NO 생성 억제 효과를 확인하기 위하여 고본을 각각 10, 100, 1000 ㎍/㎖의농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다. IFNγ/LPS를 48시간 동안 처리한 군에서는 control군과 비교하여 NO의 생성량이 확연하게 증가하였으며, 고본 투여군에서는 10 ㎍/㎖에서 25.
- 25 mM DPPH (dissolved absolute ethanol) 495 ㎕와 여러 농도의 고본 추출물 5 ㎕를 암실에서 20분 동안 교반한 후 microplate reader (GENios, Tecan, Austria)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였으며, DPPH radical의 소거능은 % inhibition으로 환산하여 표기하였다.
- 염증반응 매개물질인 NO는 iNOS에 의해 생합성되며 NO의 억제효과가 iNOS 발현 억제에 의한 것인지 여부를 immunoblot analysis를 통해 조사하였다. 쥐의 복강 대식세포에서 아무것도 투여하지 않은 control군은 전혀 iNOS의 발현이 관찰되지 않은 반면, IFN-γ/LPS를 투여하고 24시간 동안 배양한 군은 iNOS의 발현이 크게 증가함이 확인되었다.
- 완성된 cell lysate는 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동한 다음 분리된 gel의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 electroblotting에 의해 transfer하였고, membrane은 5% skim milk에 반응시켜 비특이적 단백질을 blocking 하였다. 일차 항체인 iNOS와 COX-2를 skim milk에 각각 1:500, 1:5000으로 희석하고, 2시간 동안 각각 항원 항체 반응을 시킨 다음 5분간 3번 PBS-T로 씻어내고 이차 항체인 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG conjugated HRP를 1시간 30분 동안 반응시킨 후 ECL kit를 사용하여 X-ray film에 감광시켜 발현된 단백질의 양을 분석하였다.
- 쥐의 복강 대식세포를 24 well plate에 3 × 105 cells/well로 분주한 다음 고본을 10, 100, 1000 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
- 활성산소종 (Reactive oxygen species) 가운데 하나인 superoxide anion에 대한 고본의 소거활성은 xanthine/xanthine oxidase system에서 생성된 superoxide anion에 대한 NBT 환원 능으로 측정하였다. 실험 결과 고본은 DPPH radical 소거능과 마찬가지로 10 및 100 ㎍/㎖의 농도에서는 약한 소거활성을 나타낸 반면, 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 66.
대상 데이터
- 고본은 강원도 임계에서 재배된 藁本 (Angelica tenuissima Nakai)을 완산약업사를 통해 구입하여 사용하였다. 건조된 고본 300 g은 85% 메탄올 7000 ㎖로 2시간 동안 초음파 추출하였으며, 여과하여 여액을 rotary evaporator로 감압 농축하였다.
- 에서 기타 시약은 cell culture용 및 1급 시약을 사용하 였다. 사용기구는 culture flask (Nunc), 24 well plate (Costar), CO2 incubator (Vision scientific Co.), inverted fluoromicroscope (Zeiss Co.), electrophoresis system (Bio-Rad), XAR-5 X-ray film (Kodak), microplate reader (Tecan) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), penicillin-streptomycin, Dulbecco's phosphate buffered saline, sodium dodecyl sulfate (SDS), fetal bovine serum (FBS), trypsin은 Gibco Co.에서 anti-mouse iNOS 는 Santa Cruz에서 구입한 것을 사용하였다. L-ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitroblue tetrazolium (NBT), sodium nitroprusside (SNP), lipopolysaccharide (LPS), anti-rabbit actin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium (MTT)은 Sigma Co.
- 쥐의 복강 대식세포는, C57BL/6 6주령 male에 TG 2.5 ㎖을 주사하여 3일 후 cell을 분리하였다. 분리한 세포는 10% FBS와 100 unit/㎖의 penicillin/streptomycin을 1% 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며, 37℃의 포화 습도가 유지되는 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 실험군 간의 데이터는 student's t-test로 분석하였으며 대조군과 비교하여 p < 0.01 일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다
이론/모형
- The peritoneal macrophages were then stimulated with IFN-γ (20 U/㎖) and LPS (10 ㎍/㎖). After 48 h of culture, NO release was measured by the Griess method (nitrite). Nitrite released into the medium is presented as the mean ± S.
- The peritoneal macrophages were then stimulated with LPS (10 ㎍/㎖) for 24h. Cell viability was evaluated by MTT colorimetric assay as described in the method. The results are expressed as means ± SEM.
- The peritoneal macrophages were then stimulated with LPS (10 ㎍/㎖) for 24 h. The protein extracts were prepared and samples were analyzed for COX-2 expression by Western blotting as described in the method.
- The peritoneal macrophages were then stimulated with LPS (10 ㎍/㎖) for 24 h. The protein extracts were prepared and samples were analyzed for iNOS expression by Western blotting as described in the method.
성능/효과
- IFNγ/LPS를 48시간 동안 처리한 군에서는 control군과 비교하여 NO의 생성량이 확연하게 증가하였으며, 고본 투여군에서는 10 ㎍/㎖에서 25.98%, 100 ㎍/㎖ 에서 42.86%, 1000 ㎍/㎖ 에서 87.29%의 뚜렷한 NO 생성 억제 효과를 보여주었다(Fig. 4).
- 고본 1000 ㎍/㎖ 투여군은 오히려 IFN-γ와 LPS에 의한 세포독성을 유의성 있게 감소시킨 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 본 실험에서는 SNP를 이용하여 NO 생성을 유도하였으며 고본이 생성된 NO 소거에 미치는 영향을 조사하였다. 고본은 농도의존적으로 NO를 소거시켰으나 DPPH radical이나 superoxide radical 소거능에 비해서 약한 활성을 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 고본의 85% 메탄올 추출물의 항산화능 및 항염증 효과를 알아본 결과 고본은 DPPH radical 및 superoxide anion은 1000 ㎍ /㎖ 농도에서 유의성 있게 감소시켰으나 nitric oxide 소거능은 비교적 약한 것으로 나타났다. 또한 고본의 항염증 효과를 알아 보기 위해서 염증성 매개인자들인 NO나 iNOS, COX-2의 발현을 쥐의 복강 대식세포에서 확인하였으며, 고본은 IFN-γ/LPS 처리에 의해 생성된 NO를 농도의존적으로 현저히 감소시켰고, 투여 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
- 또한 고본의 항염증 효과를 알아 보기 위해서 염증성 매개인자들인 NO나 iNOS, COX-2의 발현을 쥐의 복강 대식세포에서 확인하였으며, 고본은 IFN-γ/LPS 처리에 의해 생성된 NO를 농도의존적으로 현저히 감소시켰고, 투여 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
- 또한 항염증 효과를 알아보기 위해 사용된 쥐의 복강 대식세포 모델에서 고본은 IFN-γ와 LPS에 의해 생성된 NO를 유의성 있게 억제하였으며, 이는 iNOS 발현의 감소에서 기인함을 확인하였다.
- 본 연구에서 COX-2 단백질은 IFN-γ와 LPS로 자극된 대식 세포에서 강하게 발현하였으며 고본을 병용투여한 군에서는 농도의존적으로 COX-2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 실험 결과 고본은 DPPH radical 소거능과 마찬가지로 10 및 100 ㎍/㎖의 농도에서는 약한 소거활성을 나타낸 반면, 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 66.68 ± 3.28의 유의성 있는 소거능을 나타내었다(Fig. 2).
- 실험결과 10, 100 ㎍ /㎖의 농도에서는 각각 8.49 ± 2.84, 10.52 ± 1.83의 소거율을 보여 그다지 큰 효과를 나타내지 않은 반면, 1000 ㎍/㎖농도에서 66.54 ± 0.97의 비교적 우수한 전자공여능을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).
- 실험결과 고본은 모든 투여 농도에서 유의성있는 세포독성을 나타내지 않았으며 오히려 IFN-γ와 LPS 처리에 의한 10% 정도의 세포 독성이 고본의 투여 농도 증가에 의해 유의성 있게 정상 수준까지 회복되는 결과를 보였다(Fig. 5).
- 이상의 결과들을 통해 고본이 항산화능을 가지고 있음을 알수 있었으며 이러한 항산화 활성은 고본의 성분 가운데 하나인 ferulic acid와 관련이 있을 것으로 생각되며, ferulic acid는 phenol성 화합물로서 항산화력이 보고되고 있다19).
- 이상의 연구결과를 종합해보면 고본의 85% 메탄올 추출물은 DPPH radical 소거능과 superoxide anion 소거능 및 nitric oxide 소거능 등의 in vitro 항산화능 시험에서 비교적 양호한 효과를 보여주었다. 또한 항염증 효과를 알아보기 위해 사용된 쥐의 복강 대식세포 모델에서 고본은 IFN-γ와 LPS에 의해 생성된 NO를 유의성 있게 억제하였으며, 이는 iNOS 발현의 감소에서 기인함을 확인하였다.
- 고본이 IFN-γ와 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, 고본의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지 여부를 확인하기 위하여 MTT assay를 통하여 고본의 쥐의 복강 대식세포에 대한 세포독성을 알아보았다. 쥐의 복강 대식세 포에 LPS를 투여한 결과 아무것도 투여하지 않은 control군에 비하여 약 10%의 세포독성을 나타내었으며, 고본을 처리한 결과 처리 농도에 따른 뚜렷한 독성은 확인할 수 없었다. 고본 1000 ㎍/㎖ 투여군은 오히려 IFN-γ와 LPS에 의한 세포독성을 유의성 있게 감소시킨 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 쥐의 복강 대식세포에 IFN-γ와 LPS를 처리한 결과 COX-2 단백질이 강하게 유도되었으며 IFN-γ/LPS와 고본을 동시에 처리한 군에서 발현된 COX-2 단백질의 량이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7).
- 쥐의 복강 대식세포에서 아무것도 투여하지 않은 control군은 전혀 iNOS의 발현이 관찰되지 않은 반면, IFN-γ/LPS를 투여하고 24시간 동안 배양한 군은 iNOS의 발현이 크게 증가함이 확인되었다.
- 증가된 iNOS는 IFN-γ/LPS와고본의 병용투여에 의해 현저히 감소하였고, 1000 ㎍/㎖ 투여 용량에서는 iNOS의 발현이 거의 확인되지 않았다(Fig. 6).
후속연구
- 또한 iNOS와 마찬가지로 COX-2의 발현에도 NF-κB가 promoter로작용하여 전사단계에서 발현을 조절한다고 알려져 있으며36), 앞으로 고본이 이러한 유전자 발현 조절물질에 대한 활성이 있는지 여부도 연구되어야 할 것으로 생각된다.
- 이러한 결과로 미루어보아 고본의 NO 생성 억제가 iNOS 발현 저해에서 기인한 것임을 확인할 수있었으며, iNOS 발현이 저해되는 것이 염증관련 주요 전사인자인 NF-κB의down-regulation을 통한 것인지는 좀 더 많은 연구를 통해 확인이 필요하다고 생각된다.
- 고본은 COX-2의 발현도 감소시켰으며 그로 인해 PGE 2의 합성이 억제되었을 것으로 추측된다. 이상의 결과로 고본의 항산화 및 항염증 효과를 확인할 수 있었으며 앞으로 활성성분의 확인과 더불어, in vivo에서의 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 고본의 NO 생성 억제 효과는 iNOS의 활성을 저해시킨데 따른 것으로 사료되며, 주요염 증인자인 COX-2의 발현 역시 억제하였다. 이상의 결과로 미루어 보아, 고본의 메탄올 추출물은 우수한 항산화 및 항염증 효과를 가지고 있는 것으로 판단되며, 류마티스 관절염 및 동맥경화 등의 만성 염증성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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