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문제 정의
- 이에 본 연구는 포화지방산이 나타나는 세포독성은 세포에 따라 다른 것으로 밝혀지고 있어, caprylic acid(CA), lauric acid(LA), palmitic acid(PA) 및 stearic acid(SA)이 피부암 세포주에 나타나는 세포독성을 확인할 목적으로, 정상세포인 NIH3T3 섬유모 세포와 인체 피부 흑색종 세포주에 CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고 48시간이 경과한 후, 세포 생존율을 관찰하기 위하여 MTT 정량분석법을, 세포 부착능을 알아보기 위하여 XTT 정량분석법을 실시하였으며, DPPH법으로 항산화능을 측정하였다. 실험과정의 모든 세포의 광학 현미경적 관찰을 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 본 연구는 포화지방산이 나타나는 세포독성은 세포에 따라 다른 것으로 밝혀지고 있어, caprylic acid(CA), lauric acid(LA), palmitic acid(PA) 및 stearic acid(SA)이 피부암 세포주에 나타나는 세포독성을 확인할 목적으로, 정상세포인 NIH3T3 섬유모 세포와 인체 피부 흑색종 세포주에 CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고 48시간이 경과한 후, 세포 생존율을 관찰하기 위하여 MTT 정량분석법을, 세포 부착능을 알아보기 위하여 XTT 정량분석법을 실시하였으며, DPPH법으로 항산화능을 측정하였다. 실험과정의 모든 세포의 광학 현미경적 관찰을 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 포화지방산의 탄소사슬의 길이가 암세포주에 대하여 나타내는 세포독성에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위하여, CA, LA, PA 및 SA을 선정하여, NIH3T3 섬유모세포, 인체 피부흑색종 세포에 처리한 후, 세포 생존율, 세포부착 저지능, 항산화능 및 세포의 형태학적 관찰을 실시하였다. NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포 생존율은 포화지방산의 탄소수와 농도의 증가에 따라 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않았으나, SA의 경우에서는 농도증가에 의해, NIH3T3 섬유모세포의 생존율이 통계적으로 영향을 미치는 것으로 관찰되었다(p<0.
제안 방법
- 실험을 위하여 일차 배양한 flask의 세포를 0.25% trypsinEDTA로 처리하여 세포를 분리한 후, Turk형 혈구 계산기를 이용하여 세포수가 5 × 104cells/mL가 되도록 세포 부유액을 만들었다.
- 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)14)과 IC50값(DPPH radical 형성을 50% 억제하는 데, 필요한 μL농도)으로 나타내었다.
- Mosmann의 방법12)에 의하여, NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포를 각 배양용기에 5 × 104cells/mL 세포수를 넣고 24시간 배양 후, CA, LA, PA와 SA의 세포독성을 측정하기 위하여, CA, LA, PA와 SA를 각각 농도별(1, 25, 50 및 100μM)로 첨가하고 48시간 배양한 후, 분석 당일 조제한 MTT(Sigma Chemical Co.) 50μg/mL가 포함된 배양액을 첨가하고, 3시간 배양 후 배양액을 버리고, dimethylsulfoxide(DMSO)를 2mL/well씩 넣어 5분간 실온에 방치하여, MTT formazan을 용해하고, 흡광도는 분광광도계 ELISA reader로 MTT의 흡광도를 측정하여, 대조군과 비교 조사하였다.
- Spectrophotometer를 이용하여, 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조약물로는 L-ascorbic acid를 25, 50, 100, 200ppm(99.5% ethanol)의 4가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)14)과 IC50값(DPPH radical 형성을 50% 억제하는 데, 필요한 μL농도)으로 나타내었다.
- CA, LA, PA 와 SA의 IC50 결정은 배양중인 NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포를 각 배양용기당 5 × 104cells/mL씩 넣고 24시간 배양 후, 1, 25, 50, 100μM의 CA, LA, PA와 SA를 첨가하여 48시간 배양한 후, MTT 정량하여 이들 각각에 대한 50% 억제농도인 IC50을 회귀방정식15)에 의해 구하였다.
- 세포의 광학 현미경적 관찰을 위하여, NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포 는 각각 세포분주 후, CA, LA, PA 와 SA를 처리하여, MTT를 처리하기 전에 도립 위상차현미경(Inverted Microscope, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 포화지방산의 탄소사슬 길이와 항암 및 항산화 작용의 활성관계를 비교하기 위하여, CA, LA, PA 및 SA을 선정하여, NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포에 적용한 후, 세포 생존율, 세포부착 저지능, 항산화능 및 세포의 광학 현미경적 관찰을 실시하여, 다음과 같은 결론을 얻었다. NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포에 대하여, 포화지방산은 농도의존적으로 MTT 흡광도를 감소시켰으며, 탄소수가 가장 적은 100μM LA에서 정상세포에 대한 세포독성이 강하였으며, 피부암 세포주에 대한 독성은 탄소수의 증가에 따라 세포독성이 증가하였으며, 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라, 피부암 세포주에 대한 세포독성과 항산화능은 활성과 밀접한 관련이 있는 것으로 관찰되었다.
대상 데이터
- 세포의 배양은 CO2 배양기(Shellab Co., Cornelius, U.S.A.)를 사용하였으며, 세포수의 계산은 Turk형 혈구계산기(Marienfeld Co., Mergentheim, Germany)를 이용하였다. MTT 정량에는 ELISA reader(Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.
- CA, LA, PA 와 SA의 정상세포에 대한 세포독성과 암세포에 대한 세포독성을 측정하기 위하여, 원광대학교 의과대학 해부학교실에서 분양받은 NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3)는 MEM 배지에, 서울대학교 암연구소에서 분양받은 인체 피부흑색종 세포(SK-MEL-3)는 RPMI 1640배지에 10% fetal bovine serum, penicillin(25 unit/mL) 및 fungizone을 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 온도 37℃, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기를 사용하였다.
- CA, LA, PA 와 SA의 정상세포에 대한 세포독성과 암세포에 대한 세포독성을 측정하기 위하여, 원광대학교 의과대학 해부학교실에서 분양받은 NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3)는 MEM 배지에, 서울대학교 암연구소에서 분양받은 인체 피부흑색종 세포(SK-MEL-3)는 RPMI 1640배지에 10% fetal bovine serum, penicillin(25 unit/mL) 및 fungizone을 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 온도 37℃, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기를 사용하였다. 실험을 위하여 일차 배양한 flask의 세포를 0.
데이터처리
- 실험결과의 통계적 분석은 Student's t-test와 One way ANOVA를 적용하여 시행하였으며, p-value가 0.05미만일 경우 통계적 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- DPPH에 의한 항산화능 실험은 Hatano 등의 방법13)에 의하여, 각 fraction을 25, 50, 100, 200, 500 ppm(99.5% ethanol)의 5가지 농도로 조제한 용액 0.1mL(control : 99.5% ethanol)에 0.1mM DPPH용액(99.5% ethanol) 1.9mL를 가하였다. Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation시켰다.
- 3. The cytotoxic activity of CA, LA, PA and SA by the MTT method on SK-MEL-3. The values represent the mean ± standard deviations for triplicate experiments.
- 4. The cytotoxic activity of CA, LA, PA and SA by the MTT method. aCA, LA, PA and SA was examined in four concentrations in triplicate experiments.
성능/효과
- 50μM LA와 100μM LA간의 세포독성의 14.6% 차이로 다른 포화지방산의 세포독성보다 높게 관찰되었으며, 100μM LA에서 세포 생존율에 대한 통계적인 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05).
- SA는 가장 탄소수가 많은 포화지방산으로서, 농도증가에 따라 다른 포화지방산보다 세포독성이 증가하였으며, 100μM SA에서 세포 생존율이 가장 낮은 흡광도(2.60 ± 0.11)로 세포독성은 64.3%로 증가하였으며, 다른 포화지방산에서보다 낮은 농도인 25μM SA에서부터 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05. p<0.01, p<0.001).
- PA는 CA, LA보다 세포 생존율에 대한 감소율이 더 증가하였으며, 50μM PA이상에서부터 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성이 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05. p<0.01).
- 50μM LA와 100μM LA간의 세포독성의 14.6% 차이로 다른 포화지방산의 세포독성보다 높게 관찰되었으며, 100μM LA에서 세포 생존율에 대한 통계적인 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05).
- LA, PA 및 SA의 NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포독성에 대한 MTT 정량분석 결과에 의하면, 흡광도는 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, 100μM CA에서만 통계적으로 유의한 차이의 세포독성이 관찰되었다(p<0.01).
- CA, LA, PA 및 SA의 세포 생존율을 비교하기 위하여, NIH3T3 섬유모세포에 CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하여, MTT 흡광도를 측정한 결과, 그림 1에 의하면, 각 포화 지방산은 농도 의존적으로 MTT 흡광도가 감소가 미약하였으나, 탄소사슬수가 가장 적은 CA의 농도 의존성이 다른 포화 지방산보다 높게 관찰되었으며, 탄소사슬수가 가장 많은 SA는 농도 의존성이 거의 관찰되지 않았다. LA, PA 및 SA의 NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포독성에 대한 MTT 정량분석 결과에 의하면, 흡광도는 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, 100μM CA에서만 통계적으로 유의한 차이의 세포독성이 관찰되었다(p<0.
- CA, LA, PA 및 SA의 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과에 의하면, CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 인체 피부흑색종 세포에 처리하여 MTT 흡광도를 측정하는 결과, 각 포화지방산은 농도 의존적으로 MTT 흡광도가 감소하였으나, 포화지방산의 탄소수가 증가할수록 세포 생존율이 점점 감소하는 현상이 일어났다. 탄소수가 가장 적은 CA는 세포독성도 가장 낮을 뿐 만 아니라, 농도증가에 따라 세포 생존율도 큰 변화가 없었으며, CA는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
- CA, LA, PA 및 SA의 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과에 의하면, CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 인체 피부흑색종 세포에 처리하여 MTT 흡광도를 측정하는 결과, 각 포화지방산은 농도 의존적으로 MTT 흡광도가 감소하였으나, 포화지방산의 탄소수가 증가할수록 세포 생존율이 점점 감소하는 현상이 일어났다. 탄소수가 가장 적은 CA는 세포독성도 가장 낮을 뿐 만 아니라, 농도증가에 따라 세포 생존율도 큰 변화가 없었으며, CA는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 50μM LA와 100μM LA간의 세포독성의 14.
- 001). 일반적으로 포화지방산은 탄소수가 증가할수록 세포 생존율이 감소하였으며, 통계적인 유의성도 증가함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- NIH3T3 섬유모세포에 대한 IC50 측정 값은 CA(504.4μM) < LA(1051.0 μM) < PA(1124.4μM) < SA(2124.6μM) 순서로 세포독성이 감소가 관찰된 것은 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라 활성에 영향을 미치는 것으로 확인할 수가 있었다.
- CA, LA, PA 및 SA의 분자구조와 NIH3T3 섬유모세포 및 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성 관계를 측정하기 위하여, MTT 흡광도를 희귀 방정식에 의하여 IC50 농도를 계산한 결과,15) NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포 생존율은 CA는 SA보다 약 4.2배 정도로 높은 활성이 관찰되었으나, LA와 PA의 세포 생존율보다 약 2배 정도로 높은 세포독성이 관찰되었다. NIH3T3 섬유모세포에 대한 IC50 측정 값은 CA(504.
- CA, LA, PA 및 SA의 분자구조와 항산화 및 항암작용의 활성관계를 측정하기 위하여, CA, LA, PA 및 SA의 DPPH 측정값에 대한 자유라디칼 소거능의 연구결과에 의하면, 1μM CA에서 48.9%와 100μM CA에서 50.3%의 자유라디칼 소거능의 측정은 농도증가에 따라 활성은 약 1.4% 정도로 미약하게 증가되었다.
- PA의 자유라디칼 소거능의 측정값에 의하면, 1μM PA에서 49.6%와 100μM PA에서는 51.1%의 자유라디칼 소거능에서도 약 1.5% 정도의 측정값으로, 1μM - 100μM CA에서 자유라디칼 소거능의 측정값의 차이와 유사한 활성이 관찰되었다.
- 그렇지만, CA의 분자구조보다 탄소수의 증가된 LA와 PA의 포화 지방산은 1μM LA에서 47.3%와 100μM LA에서는 49.8%의 자유라디칼 소거능의 측정값은 CA의 활성 측정값보다 약 2.5% 정도로 약간 높게 활성이 관찰되었다.
- 5배 정도로 낮은 세포독성이 관찰되었다. PA의 피부암 세포에 대한 세포 생존율은 SA보다 약 1.3배 정도로 높은 활성이 관찰되었으나, 정상세포보다는 약 6.4배 정도로 높은 세포독성이 나타났다. LA의 피부암 세포에 대한 세포 생존율은 SA보다 약 1.
- 4배 정도로 높은 세포독성이 나타났다. LA의 피부암 세포에 대한 세포 생존율은 SA보다 약 1.6배 정도로 낮은 세포독성이 관찰되었으며, 정상세포에 비교하면 약 4.8배 정도로 높은 세포독성이 측정되었다. 피부암 세포에 대한 세포독성의 IC50 측정값은 CA(735.
- 1μM) 순서로 세포독성이 증가하여 관찰되었다. 일반적으로 세포독성은 NIH3T3 섬유모 세포에 대해 탄소수가 증가할수록 세포 생존율이 증가하였으나, 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성은 탄소수의 증가에 따라, 피부암 세포의 세포 생존율이 감소하는 현상이 나타났다. 포화지방산의 탄소수 증가에 따른 세포독성 관계를 통하여, 피부암 세포주에 포화지방산을 처리하였을 때에 세포수의 감소와 세포형태의 변화가 심하게 나타나는 세포고사 현상이 추측되었음을 알 수가 있었다(Fig.
- 포화지방산의 항산화 작용은 포화지방산의 분자구조에 따른 자유라디칼 소거능은 탄소수의 증가에 따라, CA < LA < PA < SA 순서로 활성이 증가되어 관찰되었다(Fig. 5).
- 인체 피부흑색종 세포에 LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고, 48시간이 지나면 농도 의존적으로 세포수의 감소와 세포형태가 나타났으며(사진 4), 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라서, 세포수 감소와 세포형태 변화는 CA > LA > PA > SA 탄소수의 증가순서로 심하게 나타났다.
- 정상세포인 NIH3T3 섬유모세포를 DMEM배지에, 인체 피부흑색종 세포를 RPMI 1640배지에 48시간 배양하면, 배양용기의 바닥에 다수의 방추형의 세포들이 빈틈없이 부착되어 있었으며, 인체 피부흑색종 세포는 방추형이긴 하지만, 크기가 작고 세포가 촘촘히 박힌 형태이었으며(사진 1, 3), NIH3T3 섬유모세포는 입체적으로 보면, 올챙이 모양이고 평면으로 보면, 타원형의 세포들로 인체 피부흑색종 세포보다 크기가 크게 관찰되었다(사진 1). NIH3T3 섬유모세포에 CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고, 48시간이 지나면 농도 의존적으로 세포수가 감소하는 경향이었으나, 현미경적으로 뚜렷한 차이는 없었다(사진 2).
- 정상세포인 NIH3T3 섬유모세포를 DMEM배지에, 인체 피부흑색종 세포를 RPMI 1640배지에 48시간 배양하면, 배양용기의 바닥에 다수의 방추형의 세포들이 빈틈없이 부착되어 있었으며, 인체 피부흑색종 세포는 방추형이긴 하지만, 크기가 작고 세포가 촘촘히 박힌 형태이었으며(사진 1, 3), NIH3T3 섬유모세포는 입체적으로 보면, 올챙이 모양이고 평면으로 보면, 타원형의 세포들로 인체 피부흑색종 세포보다 크기가 크게 관찰되었다(사진 1). NIH3T3 섬유모세포에 CA, LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고, 48시간이 지나면 농도 의존적으로 세포수가 감소하는 경향이었으나, 현미경적으로 뚜렷한 차이는 없었다(사진 2). 인체 피부흑색종 세포에 LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고, 48시간이 지나면 농도 의존적으로 세포수의 감소와 세포형태가 나타났으며(사진 4), 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라서, 세포수 감소와 세포형태 변화는 CA > LA > PA > SA 탄소수의 증가순서로 심하게 나타났다.
- NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포 생존율은 포화지방산의 탄소수와 농도의 증가에 따라 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않았으나, SA의 경우에서는 농도증가에 의해, NIH3T3 섬유모세포의 생존율이 통계적으로 영향을 미치는 것으로 관찰되었다(p<0.01).
- 50μM PA에서부터 통계적으로 유의한 차이가 있었으며(p<0.05), 100μM PA에서는 통계적으로 유의성이 높게 관찰되었다(p<0.01).
- 16) 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포 생존율은 농도 의존적으로 감소하였으며, 탄소수가 가장 적은 CA의 세포 생존율은 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, 100μM LA에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05).
- 01). 포화지방산의 연구결과와 달리, NIH3T3 섬유모세포의 생존율에 대한 오메가-3계열의 불포화지방산중에서 탄소수와 이중 결합수가 가장 낮은 linolenic acid(LNA)가 세포독성에 대한 민감성이 높은 것으로 측정되었다.16) 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포 생존율은 농도 의존적으로 감소하였으며, 탄소수가 가장 적은 CA의 세포 생존율은 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, 100μM LA에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.
- PA보다 탄소수가 증가한 SA는 세포 생존율이 25μM SA에서 통계적으로 유의한 차이가 나타났으며(p<0.05), 농도가 증가할수록 세포독성은 강하게, 통계적으로 유의성이 높게 관찰되었다(p<0.01, p<0.001).
- NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포에 대하여, 포화지방산은 농도의존적으로 MTT 흡광도를 감소시켰으며, 탄소수가 가장 적은 100μM LA에서 정상세포에 대한 세포독성이 강하였으며, 피부암 세포주에 대한 독성은 탄소수의 증가에 따라 세포독성이 증가하였으며, 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라, 피부암 세포주에 대한 세포독성과 항산화능은 활성과 밀접한 관련이 있는 것으로 관찰되었다.
- NIH3T3 섬유모세포와 인체 피부흑색종 세포에 대하여, 포화지방산은 농도의존적으로 MTT 흡광도를 감소시켰으며, 탄소수가 가장 적은 100μM LA에서 정상세포에 대한 세포독성이 강하였으며, 피부암 세포주에 대한 독성은 탄소수의 증가에 따라 세포독성이 증가하였으며, 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라, 피부암 세포주에 대한 세포독성과 항산화능은 활성과 밀접한 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 이상의 연구결과에 의하면, 포화지방산, SA, PA, 및 LA는 정상세포보다 피부암 세포주에 나타나는 세포독성이 강하게 관찰되었으나, 탄소수가 가장 적은 CA의 경우는 정상세포주에 높은 세포독성이 관찰되었다. 앞으로 포화지방산의 분자구조에 따른 피부암 세포주의 세포독성과 항산화능의 활성과 밀접한 관계를 시사하고 있어, 이에 대한 포화지방산의 탄소사슬의 길이와 카르복실기는 물론 다른 관능기로 치환되었을 경우에도 연구할 필요가 있다고 생각된다.
- 인체 피부흑색종 세포에 대한 세포독성은 NIH3T3 섬유모세포에 대한 세포독성과는 다르게, SA는 정상세포의 세포독성에 비해 약 15.4배 정도로 높게 활성이 관찰되었으나, 피부암의 경우 SA는 CA보다 약 5.3배 정도로 높은 세포독성이 측정되었으며, SA는 가장 낮은 최소억제농도(138.1μM)로 관찰되었다.
- 가장 많은 탄소수가 결합된 SA는 1μM SA에서 48.3%의 자유라디칼 소거능으로 다른 포화지방산의 측정값과 유사한 활성이 관찰되었으나, 100μM SA에서는 56.5%의 가장 자유라디칼 소거능이 높게 관찰되어, 자유 라디칼 소거능은 약 8.2% 정도의 측정값이 관찰되었다.
후속연구
- 인체 피부흑색종 세포에 LA, PA 및 SA를 농도별로 처리하고, 48시간이 지나면 농도 의존적으로 세포수의 감소와 세포형태가 나타났으며(사진 4), 포화지방산의 탄소수의 증가에 따라서, 세포수 감소와 세포형태 변화는 CA > LA > PA > SA 탄소수의 증가순서로 심하게 나타났다. 이러한 현상은 포화지방산의 분자구조와 세포수와 세포형태 변화에 관련되었음을 관찰할 수 있으나, 앞으로 다양한 포화지방산의 분자구조와 세포사멸의 관계를 연구할 필요가 있다고 생각된다.
- 이상의 연구결과에 의하면, 포화지방산, SA, PA, 및 LA는 정상세포보다 피부암 세포주에 나타나는 세포독성이 강하게 관찰되었으나, 탄소수가 가장 적은 CA의 경우는 정상세포주에 높은 세포독성이 관찰되었다. 앞으로 포화지방산의 분자구조에 따른 피부암 세포주의 세포독성과 항산화능의 활성과 밀접한 관계를 시사하고 있어, 이에 대한 포화지방산의 탄소사슬의 길이와 카르복실기는 물론 다른 관능기로 치환되었을 경우에도 연구할 필요가 있다고 생각된다.
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