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문제 정의
- 따라서, 본 연구를 통하여 2007년도 2월에 충청북도에 소재한 삽교호 상부지류 곡교천에서 서식하던 포획 야생 흰뺨검둥오리에서 분리된 NDV의 특성을 조사함으로서, 야생조류와 국내 뉴캣슬병 발생과의 연관성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- NDV 국내분리주 DK1/07주의 분자생물학적 특성을 조사하기 위하여 F 단백질에 대한분자생물학적 분석을 실시하였다. 유전자 분석을 위하여 RFPCR을 실시한 결과 M 단백질 유전자의 C 말단부위와 F 단백질 유전자의 N 말단부위를 포함한 총 508 bps의 산물이 성공적으로 증폭되었다.
- NDV 녹력과 관련 있는 F0 단백질의 F1/F2 분절 부위의 아미노산 서열을 조사하였다. 그 결과 야생 오리에서 분리된 DK1/07주의 F0 분절부위는 112R-R-Q-K-R-F117S] 다엮 기싱 아미노산 서열을 가지고 있었다(Fig.
- 발육계란에서 MDT를 측정하였다. NDV가 함유된 신선한 요막강액을 멸균 생리식염수로 10-5에서 KT, 까지 10진 희석한 다음, 바이러스 희석액 0.1 ml를바이러스 희석액당 5개 발육계란의 요막강(allantoic cavity)내로 접종하였다. 그 후 8시간 내지 10시간이 경과한 후 동일 바이러스 희석액을 동일한 방법으로 발육 계란에 접종하였다.
- NDV의 독력을 측정하기 위하여 9일 내지 10일된 계태아 발육계란에서 MDT를 측정하였다. NDV가 함유된 신선한 요막강액을 멸균 생리식염수로 10-5에서 KT, 까지 10진 희석한 다음, 바이러스 희석액 0.
- NDV의 생물학적 특성을 분석하기 위하여 닭 적혈구와 말 적혈구에 대한 혈구 응집능을 사용하였다. 우선, u 자형 96-well microtiter plate의 모든 well에 phosphate buffered saline, pH 7.
- 취하여 분석하였다. 계통발생학적 유전자분석 (phylogenetic analysis)을 위한 핵산 염기서열 교정 (editing), 아미노산 서열예측, 및 alignments는 Lasergene 7.0(DNASTAI& USA)의 MegAlign program을 사용하여 실시하였다. 본 연구에서 분석한 유전자 염기서열 정보는 기존에 발표된 NDV의 유전자 염기서열 정보와 비교분석 하였다.
- 증폭산물은 l%(w/v) 아가로스겔에서 전기 영동한 다음, Gel extraction kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 특이 증폭밴드를 추출하였다. 그 다음, 증폭산물은 gel purification kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 순수 정제한 다음 Dye Terminator Cyle sequencing kit(Applied Biosystems, US A) 과 자동 염기서열 분석장치(ABI PRISM version 377 DNA autosequencer; PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- 1 ml를바이러스 희석액당 5개 발육계란의 요막강(allantoic cavity)내로 접종하였다. 그 후 8시간 내지 10시간이 경과한 후 동일 바이러스 희석액을 동일한 방법으로 발육 계란에 접종하였다. 그 후 발육계란은 37℃ 부란기에서 배양하면서 일주일간 매일 2회 계태아의 폐사여부를 관찰하여 기록하였다.
- 그 후 8시간 내지 10시간이 경과한 후 동일 바이러스 희석액을 동일한 방법으로 발육 계란에 접종하였다. 그 후 발육계란은 37℃ 부란기에서 배양하면서 일주일간 매일 2회 계태아의 폐사여부를 관찰하여 기록하였다. MDT는 태아를 100% 치사시킨 최고 희석배수에서의 계태아 평균치사시간으로 하였다.
- 사용되어 왔다 [12, 15-18, 25, 29]. 그러므로, 본 연구에서 상기에서 분석된 염기 서열중 F 단백질의 N 말단부위의 389개의 핵산 염기서열을 이용하여 계통분류 학적 분석을 위하여 사용하였다(Fig. 2). 또한, 현재까지 알려진 9개 유전형의 대표적인 NDV strains들의 유전정보를 비교 분석을 위하여 사용하였다.
- 2). 또한, 현재까지 알려진 9개 유전형의 대표적인 NDV strains들의 유전정보를 비교 분석을 위하여 사용하였다. 이미 다른 연구자들 [13, 15, 16]에 의하여 보고된 바와 같이, 백신 주는 유전형 I형 (Ulster2C주 및 VG/GA주) 또는 유전형 II형 (L Sota주, B1주 및 Clone30주)에 속하였다.
- 0(DNASTAI& USA)의 MegAlign program을 사용하여 실시하였다. 본 연구에서 분석한 유전자 염기서열 정보는 기존에 발표된 NDV의 유전자 염기서열 정보와 비교분석 하였다. Phylogenetic trees는 neighboring-joining method within Clustal W with 1,000 bootstrapping replicates를 이용하여 분석하였다.
- 우선, u 자형 96-well microtiter plate의 모든 well에 phosphate buffered saline, pH 7.2(PBS)을 25 jil씩 분주한 다음 바이러스 원액 25)11를 첫 번째 well에 넣어 혼합하여 2진 단계희석을 실시하였다. 그 후 모든 well에 l%(v/v) 닭 적혈구 또는 말 적혈구를 25 |11씩 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 40분간 정치시켰다.
- 유전자 분석은 상기 508bp의 핵산 염기서열중 F 유전자의 N말단부위에 해당하는 첫 389개의 핵산 염기서열을 취하여 분석하였다. 계통발생학적 유전자분석 (phylogenetic analysis)을 위한 핵산 염기서열 교정 (editing), 아미노산 서열예측, 및 alignments는 Lasergene 7.
- RTPCR을 위한 primers 는 Lee 등 [15]이 사용한 M1055(forward; 5, -GCT GAT CAT GAG GTT ACC TC-3')와 F508 (reverse; 5*-AGT CGG AGG ATG TTG GCA GC-3)를 사용하였으며, 이 primer set는 M 유전자의 1055부위에서 F 유전자의 508bps를 증폭하도록 설계되었다. 증폭산물은 l%(w/v) 아가로스겔에서 전기 영동한 다음, Gel extraction kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 특이 증폭밴드를 추출하였다. 그 다음, 증폭산물은 gel purification kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 순수 정제한 다음 Dye Terminator Cyle sequencing kit(Applied Biosystems, US A) 과 자동 염기서열 분석장치(ABI PRISM version 377 DNA autosequencer; PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- , Korea)을 사용하여 제조사에서 권장하는 방법과 Lee 등 [15]이 사용한 PCR 반응 온도와 시간 조건에 따라 one- step RT-PCR법으로 실시하였다. RTPCR을 위한 primers 는 Lee 등 [15]이 사용한 M1055(forward; 5, -GCT GAT CAT GAG GTT ACC TC-3')와 F508 (reverse; 5*-AGT CGG AGG ATG TTG GCA GC-3)를 사용하였으며, 이 primer set는 M 유전자의 1055부위에서 F 유전자의 508bps를 증폭하도록 설계되었다. 증폭산물은 l%(w/v) 아가로스겔에서 전기 영동한 다음, Gel extraction kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 특이 증폭밴드를 추출하였다.
- 대조 바이러스로서 3종의 뉴캣슬병 백신주(La Sota주, Ulster2C주 및 VG/GA주), 닭유래 강독형 국내분리주 2 주(Kr-005주 및 교정원주) 및 2006년 시화호에 서식하는 야생철새 (species 불명) 분변으로부터 분리된 약독 국내 분리 주 SH39/06주를 사용하였다. 본 연구에 사용한 바이러스는 모두 발육계란에서 증식시킨 후 요막강액 (allantoic fluid)을 채취하여 -70℃에 냉동보관하면서 사용하였다.
- 바이 러스 유전자의 추출을 위하여 증식바이 러스가 함유된 요막강액을 사용하였다. 바이러스 유전자는 Viral gene-spin(인트로 한국)을 이용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 추출하였다.
- /06주를 사용하였다. 본 연구에 사용한 바이러스는 모두 발육계란에서 증식시킨 후 요막강액 (allantoic fluid)을 채취하여 -70℃에 냉동보관하면서 사용하였다.
- 증폭신물은 아가로스겔로부터 순수 정제한 후 직접 유전자 염기서열에 사용되었다. 이 중 F 단백질의 389nt의 핵산 염기서열을 염기서열 분석에 사용하였다.
- 유전자 분석을 위하여 RFPCR을 실시한 결과 M 단백질 유전자의 C 말단부위와 F 단백질 유전자의 N 말단부위를 포함한 총 508 bps의 산물이 성공적으로 증폭되었다. 증폭신물은 아가로스겔로부터 순수 정제한 후 직접 유전자 염기서열에 사용되었다. 이 중 F 단백질의 389nt의 핵산 염기서열을 염기서열 분석에 사용하였다.
- 흰뺨검둥오리에서 분리된 NDV 국내 분리주 DK1/07 주는 발육계란에 접종하여 채독한 요양막강액을 실험에 사용하였다. 국내 분리주 DK1.
이론/모형
- 있다. NDV strain의 독력은 일반적으로 발육계태아에 대한 평균 치사 시간(mean death time, MDT), 1 일령 병아리에서의 뇌내 병원성지수(intracerebral pathogenicity index), 6 주령 닭에서의 정맥내 병원성지수(intravenous pathogenicity index) 등 생물학적 방법에 의하여 측정하여 분류한다. 또한, 분자생물학적으로 NDV F0 단백질이 숙주 효소에 의해 F1과 F2로 얼마나 쉽게 분절되어 활성화되는 가에 의하여 바이러스의 독력이 좌우된다고 알려져 있다.
- 본 연구에서 분석한 유전자 염기서열 정보는 기존에 발표된 NDV의 유전자 염기서열 정보와 비교분석 하였다. Phylogenetic trees는 neighboring-joining method within Clustal W with 1,000 bootstrapping replicates를 이용하여 분석하였다.
- Sequences of reference strains were taken from the GenBank database. The phylogenetic tree was constructed using the software package DNASTER with the CLUSTER W method(SloWAccurate, IUB). The provisional designations including genotypes and sub-genotypes are indicated on the right
- 바이러스 유전자는 Viral gene-spin(인트로 한국)을 이용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 추출하였다. cDNA합성 및 특이유전자 증폭은 Accupower RTPCR premix kit (Bioneer co., Korea)을 사용하여 제조사에서 권장하는 방법과 Lee 등 [15]이 사용한 PCR 반응 온도와 시간 조건에 따라 one- step RT-PCR법으로 실시하였다. RTPCR을 위한 primers 는 Lee 등 [15]이 사용한 M1055(forward; 5, -GCT GAT CAT GAG GTT ACC TC-3')와 F508 (reverse; 5*-AGT CGG AGG ATG TTG GCA GC-3)를 사용하였으며, 이 primer set는 M 유전자의 1055부위에서 F 유전자의 508bps를 증폭하도록 설계되었다.
- 요막강액을 사용하였다. 바이러스 유전자는 Viral gene-spin(인트로 한국)을 이용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 추출하였다. cDNA합성 및 특이유전자 증폭은 Accupower RTPCR premix kit (Bioneer co.
- 당시 흰뺨검둥오리 10수중 1수에서만 NDV 항체(64배 HI역가)를 보였으나, NDV가분리된 개체와 일치하지 않았다. 분리바이러스는 paramyxovirus(types 1-9) 표준항혈청 (National Veterinary Service Laboratory, USA)을 이용한 교차 혈구응집억제반응법 (HI)과 RT-PCR법으로 NDV(paramyxovirus type 1) 확진하였다.
성능/효과
- 2. NDV DK1/07주의 F 단백질의 분절부위 아미노산 서열을 분석한 결과, 강독 바이러스의 특징인 112R-R-Q- K-R-F"7의 다염기성 아미노산 서열을 가진 것으로 확인되었다.
- 1. NDV DK1/07주는 발육계란에서 독력을 조사한 결과 평균치사시간(MDT)가 60시간 이내로 강독 바이러스로 확인되었다.
- 3. NDV의 F 유전자의 핵산 염기서열을 토대로 계통발생 학적으로 분석한 결과, DK1/07주는 극동아시아에서 유행하는 강독 바이러스들이 속하는 Vlld형의 유전형으로 분류되었으며, 최근 국내사육 닭에서 분리된 강독 NDV와 유전적으로 가장 높은 상동성을 나타내었다.
- 결론적으로, 본 연구는 흰뺨검둥오리에서 강독 NDV 가 분리되었다는 점에서 야생 흰뺨검둥오리가 NDV의보독동물로서 작용할 수 있다는 것을 확인하였다는 점에서 역학적으로 큰 의의가 있다. 앞으로 뉴캣슬병으로인한 질병 피해 최소화를 위한 예찰조사를 수행할 경우 야생 조류와의 접촉여부 등도 위험도 측면에서 고려해볼 필요가 있다.
- 아미노산 서열을 조사하였다. 그 결과 야생 오리에서 분리된 DK1/07주의 F0 분절부위는 112R-R-Q-K-R-F117S] 다엮 기싱 아미노산 서열을 가지고 있었다(Fig. 1). F 단백질의 분절부위에서의 다염기성 아미노산 서열은 강독 NDV에서 관찰되는특징직인 아미노산서열이고, 제 Vlld 유전형 강독 바이러스들이 공통적으로 가지고 있는 아미노산 엮기서열임을 감안할 때 분리된 DK1/07주는 닭에 치명직인 깅녹 바이러스임을 의미한다.
- MDT는 태아를 100% 치사시킨 최고 희석배수에서의 계태아 평균치사시간으로 하였다. 그 결과, 평균치사시간이 60시간 이하일 경우 강독, 60시간 내지 90시간인 경우 중간독, 90시간 이상일 경우 약독으로 판정하였다.
- 수생동물유래 바이러스의 경우 말 적혈구에 대한 응집능을 가지고 있으나, 닭유래 바이러스의 경우 그러하지 않다 [11]. 둘째, 최근 국내 닭에서 유행하는 강독 NDV와 유전적으로 가장 유사하였다. 셋째, 국립수의과학검역원에서 제공하는뉴캣슬병 발생자료에 의하면 2007년 12월경에 곡교천 인근 지역에 소재한 2개의 닭 농장에서도 뉴캣슬병이발생하였다.
- [11]. 바이러스가 분리되었던 야생오리는 바이러스 분리 당시 외관상 건강한 상태였고, 비록 바이러스가 분리되지 않았지만 당시 같이 포획되었던 다른 야생오리 1수에서 64배의 NDV HI항체가를 보였다는 사실을 감안해볼 때 NDV가 분리된 흰뺨검둥오리는 감염후 불현성 감염으로 진행되었을 것으로 판단된다. NDV DK1/07주가 흰뺨검둥오리의 총배설 강에서 분리되었다는 사실에서 보듯, 야생 오리류가 뉴캣슬병에 치명적이지 않는다 하더라도 감염 오리는 분변을 통하여 NDV를 주변 환경에 오염시킬 수 있다는 점을 유의할 필요가 있어 보인다.
- 시화호 야생조류에서 분리된 SH39/06주는 계통분류학상 유전형 I 형에 속하였다. 본 연구의 야생 오리분리주 DK1/07주는 계통 분류학상 유전형 Vlld형에 속하는 것으로 조사되었으며, 최근 국내 닭에서 유행하는 Vlld형 강독 바이러스와 가장 유전적으로 유사하였다. 이것은 DK1/07주는 백신 바이러스보다는 최근 국내 닭에서 유행하는 강독형 NDV에 유전적으로 가깝다는 것을 의미한다.
- 둘째, 최근 국내 닭에서 유행하는 강독 NDV와 유전적으로 가장 유사하였다. 셋째, 국립수의과학검역원에서 제공하는뉴캣슬병 발생자료에 의하면 2007년 12월경에 곡교천 인근 지역에 소재한 2개의 닭 농장에서도 뉴캣슬병이발생하였다. 만약 NDV DK1/07주가 닭 유래 바이러스일 경우, 감염된 흰뺨검둥오리는 닭유래 NDV가 오염된 물이나, 사료 등과의 접촉에 의한 우연히 감염 되 었을 가능성을 배제할 수 없다.
- 유전자 분석을 위하여 RFPCR을 실시한 결과 M 단백질 유전자의 C 말단부위와 F 단백질 유전자의 N 말단부위를 포함한 총 508 bps의 산물이 성공적으로 증폭되었다. 증폭신물은 아가로스겔로부터 순수 정제한 후 직접 유전자 염기서열에 사용되었다.
- 발육 계태아를 치사시켰다. 이 결과는 DK1/07주가 닭에 대하여 강독 바이러스(MDT: 60시간 이내)의 특성을 가진 바이러스임을 말해 준다.
- 가능성이 높다고 판단된다. 첫째, 수생 야생조류에서 분리된 약독 NDV SH39/06주와 달리 NDV DK1/07주는 말 적혈구 응집능을 보이지 않았다. 수생동물유래 바이러스의 경우 말 적혈구에 대한 응집능을 가지고 있으나, 닭유래 바이러스의 경우 그러하지 않다 [11].
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