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문제 정의
- LLE는 SPE에 비해 비용, 소요 시간, 소모되는 용액의 양이 많고, 자동화에 적합하지 않은 단점이 있다. 따라서 본 연구의 목적은 기존에 수행되고 있는 LLE 전처리법을 보완하여 혼합형 이온교환수지를 이용하고, 자동화 전처리 방법의 최적화와 LC-MS/MS 분석법을 개발하는 것이다.
- 본 연구에서는 혼합형 양이온 교환 수지가 충전된 4 가지 상업용 SPE 카트리지를 구매하여 각 카트리지별로 55종 염기성 대상약물의 상대 회수율을 비교하였다. 또한 말의 소변은 다른 생체 시료에 비해 점도가높으므로 막힘 현상이 적은 카트리지를 선택하고자 하였다. 실험에 사용된 경주마의 소변은 약물투여 사실이 없는 것을 채취하여 공 시료(blank urine)로 하였다 상대 회수율 비교를 위하여 공 시료에 55종 염기성 약물 표준 용액을 이용하여 농도가 100 ng/mL 가 되도록 첨가한 후, 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다.
- 본 연구에서는 경주마 소변시료의 SPE 전처리 방법에서 막힘 현상을 적게하고 회수율을 높이는 최적의 조건을 검토하기 위하여, 소변시료를 효소 가수분해한 후 상업화되어 시중에서 유통되는 4 종의 혼합형 양이온교환 수지 SPE 카트리지를 대상으로 전처리조건을 비교 검토하였다.
- 본 연구에서는 경주마 소변으로부터 55종 염기성 약물을 검출하는 혼합형 이온교환수지의 고체상 추출법-액체 크로마토그래피-텐덤질량분석법을 개발하였다. 55종 염기성 약물에는 중추신경흥분제, 베타 차단제, 베타 길항제, 국소마취제, 진정제, 항우울제, 근육이완저], 항고혈압제, 항저혈압제 등 넓은 범위의 약물들이 포함된다.
- 있었다. 본 연구에서는 막힘 현상을 방지하기 위하여 카트리지별로 중력 상태에서 유속을 비교하여 유속이 큰 카트리지를 사용하고자 하였다. 카트리지별 상대적인 유속은 XTRACT® XRDAH > Discovery® DSC-MCAX > Oasis® MCX > Certify® 순이 었다.
제안 방법
- 2.4.1 항의 실험결과를 비교하여 최적의 SPE 카트리지를 선정한 후, 세척 용액으로 사용한 2% 암모니아 수용액과 10% 메탄올 수용액의 부피를 1.0 mL, 1.5 mL, 2.0 mL 로 각각 변경하면서 상대 회수율의 변화를 확인하였다.
- 본 실험에서 사용한 모든 수용액은 3차 증류수를 이용하여 제조하였다. 3차 증류수는 1차 증류수 제조기 PRIMA (USF Elga, High Wycombe, UK) 로정제된 증류수를 MAXIMA (USF Elga, High Wycombe, UK)를 사용하여 제조하였다.
- 이때 ionspray voltage 는 5400 V, curtain gas 는 40 psi, collision gas는 3 psi로 정하였다. Q1에서 precursor ion과 Q3에서 product ion의 선택 시 분해능은 unit mass로 정하여 수행하였다.
- 5, 5, 50 ng/mL 가 되도록 표준약물을 공 시료에 첨가하여 제조하였다. 각 농도별 3개씩 준비된 시료는 내부표준물질을 첨가하고, 최적화된 고체상 추출법을 이용하여 실험하였다.
- 각 약물의 MRM transitione 해당 표준물질을 syringe pump를 이용하여, 분당 10 pL로 API 2000에 주 입 하면 서 collision energy 와 parameter (Table 1)를 최적화하였다. 각 약물의 transition 시 머무름 시간 (dwell time)은 25 ms로, 쉬는 시간(pause time)은 5 ms로 하였다.
- 검정곡선 작성에 사용된 시료는 55종의 염기성 약물의 농도가 0.05, 0.5, 2.5, 5, 50 ng/mL 가 되도록 표준약물을 공 시료에 첨가하여 제조하였다. 각 농도별 3개씩 준비된 시료는 내부표준물질을 첨가하고, 최적화된 고체상 추출법을 이용하여 실험하였다.
- 경주마의 소변 중 염기성 약물 55종을 대상으로, 기존의 LLE 전처리 방법 대신 자동화된 SPE 방법을 도입 하여 추출하고, LC-MS/MS로 동시 분석 하는 방법을 제시하였다. SPE 를 이용한 전처리 단계에서는 2% 암모니아 수용액과 10% 메탄올 수용액의 최적 부피와 최적 유속을 결정하여, 시료 내에 포함되어 있는 많은 불순물들을 효과적으로 제거하면서 또한 양호한 회수율을 유지할 수 있었다.
- 고체상 추출법의 최적화를 위하여 세척단계에 사용되는 용액의 부피와 유속을 변화시키면서 상대 회수율을 확인하였다. 이때 경주마의 소변시료 적용과 용출단계에서는 유속을 분당 1 mL 로 하였다.
- 따라서 이 두 가지 수용액의 부피를 각각 1.0 mL, 1.5 mL, 2.0 mL로 각각 변화 시키면서 상대 회수율을 비교하였다 (Table 3). 비교 결과, 부피 변화에 따른 회수율의 차이는 크지 않았으며, 분석 소요시간과 용액의 사용량 등을 고려하여 두 가지 모두 1.
- 한다. 본 연구에서는 혼합형 양이온 교환 수지가 충전된 4 가지 상업용 SPE 카트리지를 구매하여 각 카트리지별로 55종 염기성 대상약물의 상대 회수율을 비교하였다. 또한 말의 소변은 다른 생체 시료에 비해 점도가높으므로 막힘 현상이 적은 카트리지를 선택하고자 하였다.
- 0 mL로 각각 변화 시키면서 상대 회수율을 비교하였다 (Table 3). 비교 결과, 부피 변화에 따른 회수율의 차이는 크지 않았으며, 분석 소요시간과 용액의 사용량 등을 고려하여 두 가지 모두 1.5 mL 를 사용하기로 결정하였다. 또한 세척 과정에서 적용되는 용액의 유속 변화(분당 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL) 에 따른 상대 회수율 추이를 분석한 결과, 유속이 분당 2 mL 일 때 가장 좋은 분석 결과를 나타내었다 (Table 4).
- 실험에 사용된 경주마의 소변은 약물투여 사실이 없는 것을 채취하여 공 시료(blank urine)로 하였다 상대 회수율 비교를 위하여 공 시료에 55종 염기성 약물 표준 용액을 이용하여 농도가 100 ng/mL 가 되도록 첨가한 후, 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다. 상대 회수율은 공 시료에 표준용액을 첨가하여 추출한 후 분석한 결과와 공 시료를 추출한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과의 면적을 상호비교하여 구하였다.
- 또한 말의 소변은 다른 생체 시료에 비해 점도가높으므로 막힘 현상이 적은 카트리지를 선택하고자 하였다. 실험에 사용된 경주마의 소변은 약물투여 사실이 없는 것을 채취하여 공 시료(blank urine)로 하였다 상대 회수율 비교를 위하여 공 시료에 55종 염기성 약물 표준 용액을 이용하여 농도가 100 ng/mL 가 되도록 첨가한 후, 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다. 상대 회수율은 공 시료에 표준용액을 첨가하여 추출한 후 분석한 결과와 공 시료를 추출한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과의 면적을 상호비교하여 구하였다.
- 염기성 약물 55종의 screen 검사의 유효성 확인을 위하여 “EURACHEM”에서 제시한 방법으로 검출한계 (limit of detection, LOD) 와 선택성 (selectivity) 을 검증하였다.17
- 5 pm; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 이동상은 5 mM ammonium formate (pH=3.5)를 용매 A로, methan이을 용매 B 로 하여 선형 기울기법으로 분석하였다. 선형 기울기법은 최초 용매 A 를 70%, 용매 B 를 30%로 하여 5분간 용매 A 를 20%로 감소시키고, 용매 B 를 80%로 증가시킨 후 3분간 유지시킨다.
- 최적의 세척 용액 부피를 선정한 후, 세척 용액의 유속을 분당 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL로 변경하면서 유속의 변화에 따른 추출효율을 확인하였다.
대상 데이터
- SevenEasy S20 모델을 사용하였다. HPLC 시스템으로는 degasser, binary pump, auto-injector, column oven을 갖춘 Hewlett-Packard사의 HP 1100 series (Waldbronn, Germany)를, 텐덤 질량분석기 (MS/MS)는 PE SCIEX사의 API 2000 (Toronto, MO, Canada)을 사용하였다. 데이터 처리장치로는 Analyst(Ver.
- 소변 시료의 가수분해를 위해 사용한 ammonium acetate 는 시약급(Junsei, Kyoto, Japan)의 제품을 사용하였고, p-glucuronidase/aiylsufatase 는 Roche Diagnostics시(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 가수분해 된 시료의 pH 조절을 위해 사용한 인산(phosphoric acid)은 시약급(Sigma- Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 을 사용하였고, 고체상추출법의 최적화 실험을 위해 카트리지형태의 혼합형양이온교환 수지 4가지 제품; XTRACT® XRDAH, 3 mL, 200 mg (UCT, Bristol, PA, USA), Bond Elut Certify®, 3 mL, 130 mg (Varian, Palo Alto, CA, USA), Discovery DSC-MCAX®, 3 mL, 100 mg (Supelco, Bellefonte, PA, USA), Oasis® MCX, 3cc, 60mg(Waters, Milford, MA, USA) 을 구입하여 사용하였다. 고체상추출 실행 시 세척 단계에 사용한 개미산(formic acid) 과 암모니 아 (ammonia solution) 는 시약급 (Junsei, Kyoto, Japan) 의 제품을 사용하였고, 메탄올 (methanol) 은 HPLC급(J.
- 가수분해 된 시료의 pH 조절을 위해 사용한 인산(phosphoric acid)은 시약급(Sigma- Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 을 사용하였고, 고체상추출법의 최적화 실험을 위해 카트리지형태의 혼합형양이온교환 수지 4가지 제품; XTRACT® XRDAH, 3 mL, 200 mg (UCT, Bristol, PA, USA), Bond Elut Certify®, 3 mL, 130 mg (Varian, Palo Alto, CA, USA), Discovery DSC-MCAX®, 3 mL, 100 mg (Supelco, Bellefonte, PA, USA), Oasis® MCX, 3cc, 60mg(Waters, Milford, MA, USA) 을 구입하여 사용하였다. 고체상추출 실행 시 세척 단계에 사용한 개미산(formic acid) 과 암모니 아 (ammonia solution) 는 시약급 (Junsei, Kyoto, Japan) 의 제품을 사용하였고, 메탄올 (methanol) 은 HPLC급(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)을 사용하였다. 액체크로마토그래프의 이동상 제조에 사용한 ammonium formate는 특급(Kato, Tokyo, Japan)을 .
- 구입하여 사용하였다. 내부표준물질로 사용한 cotinine, dibucainee USP사(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 소변 시료의 가수분해를 위해 사용한 ammonium acetate 는 시약급(Junsei, Kyoto, Japan)의 제품을 사용하였고, p-glucuronidase/aiylsufatase 는 Roche Diagnostics시(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
- HPLC 시스템으로는 degasser, binary pump, auto-injector, column oven을 갖춘 Hewlett-Packard사의 HP 1100 series (Waldbronn, Germany)를, 텐덤 질량분석기 (MS/MS)는 PE SCIEX사의 API 2000 (Toronto, MO, Canada)을 사용하였다. 데이터 처리장치로는 Analyst(Ver. 1.4.2)를, 기타 장비로는 질소발생기(Model 78-72, Whatman, Florham Park, MA, USA)와 질소 증발기 (MG-2200, Eyela, Tokyo, Japan) 등을 사용하였다.
- 본 연구에서는 검사 대상 약물로 International Federation of Horseracing Authorities (IFHA) 의 협 약18 에 의해 반드시 검출해야 되는 약물과 경주마에 오남용 가능성이 높은 약물을 선택하였다. 하지만, 선정된 대상 약물들은 물리화학적인 성질이 다양하여 동시 분석을 수행하기 위한 최적 추출조건을 찾기에 어려움이 있었다.
- 내부표준물질로 사용한 cotinine, dibucainee USP사(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 소변 시료의 가수분해를 위해 사용한 ammonium acetate 는 시약급(Junsei, Kyoto, Japan)의 제품을 사용하였고, p-glucuronidase/aiylsufatase 는 Roche Diagnostics시(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 가수분해 된 시료의 pH 조절을 위해 사용한 인산(phosphoric acid)은 시약급(Sigma- Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 을 사용하였고, 고체상추출법의 최적화 실험을 위해 카트리지형태의 혼합형양이온교환 수지 4가지 제품; XTRACT® XRDAH, 3 mL, 200 mg (UCT, Bristol, PA, USA), Bond Elut Certify®, 3 mL, 130 mg (Varian, Palo Alto, CA, USA), Discovery DSC-MCAX®, 3 mL, 100 mg (Supelco, Bellefonte, PA, USA), Oasis® MCX, 3cc, 60mg(Waters, Milford, MA, USA) 을 구입하여 사용하였다.
- 표준물질 acepromazine, aminopyrine, amitriptylline, antipyrine, atenolol, atropine, azaperone, benzocaine, bupivacaine, caffeine, carbamazepine, chlorpheniramine, chlorpromazine, clenbuterol, diphenhydramine, dipyrone, doxapram, guaifenesine, heptaminol, imipramine, lidocaine, mephentermine, mepivacaine, methocarbamol, methoxyphenamine, nikethamide, oxprenolol, papaverine, phenylpropanolamine, procaine, promazine, propionylpromazine, propranolol, pyrilamine, salbutamol, scopolamine, pentazocine, terbutaline, tetracaine, timolol, trimethoprim, tripelenamine, xylazinee USP사(Rockville, MD, USA) 에서, 마으약류 표준물질 amphetamine, benzoylecgonine, butorphanol, cocaine, codeine, diazepam, ephedrine, ketamine, meperidine, methamphetamine, methylphenidate, nordiazepam 은 Cerillant사(Round Rock, TX, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 내부표준물질로 사용한 cotinine, dibucainee USP사(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 검출한계는 공 시료를 10회 분석한 결과와 서로 비교하여 신호대 잡음비 (signal/noise, S/N) 가 3 이상인 농도를 검출한계 값으로 정하였다.
이론/모형
- LC 에서 분리되어 나오는 55종의 염기성 약물들의 검출은 triple-quadrupole mass spectrometer를 이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 방법으로 수행하였다. 각 약물의 MRM transitione 해당 표준물질을 syringe pump를 이용하여, 분당 10 pL로 API 2000에 주 입 하면 서 collision energy 와 parameter (Table 1)를 최적화하였다.
- 용출 용매로 2% 암모니아수 메탄올 용액 2 mL를 사용하여 분석대상 약물들을 용출시켰다. 모든 고체상 추출 과정은 자동화 장비 (ASPEC XL)을 사용하였다. 용출된 용액은 60oC 질소 관류기를 이용하여 증발건조시켰다.
- 본 연구에 사용한 SPE 장비는 Gilson사(Madison, WI, USA)의 자동 ASPEC XL을 사용하였으며, pH meter는 Mettler-Toledo사 (Schwerzenbach, Switzerland) 의 SevenEasy S20 모델을 사용하였다. HPLC 시스템으로는 degasser, binary pump, auto-injector, column oven을 갖춘 Hewlett-Packard사의 HP 1100 series (Waldbronn, Germany)를, 텐덤 질량분석기 (MS/MS)는 PE SCIEX사의 API 2000 (Toronto, MO, Canada)을 사용하였다.
- 71 초였다. 이온화 방법은 양이온 분무 방식(+electrospray ionization, +ESI)을 사용하여 nebulizer gas를 45 psi, 400oC의 heater gas를 90 psi로 하여 작동하였다. 이때 ionspray voltage 는 5400 V, curtain gas 는 40 psi, collision gas는 3 psi로 정하였다.
성능/효과
- 최적화된 고체상 추출법 모식도를 Scheme 1에 나타내었다. 2% 암모니아 수용액, 10% 메탄올 수용액이 세척 단계에서 중요한 역할을 하는데, 2% 암모니아 수용액으로 물질과 혼합형 이온교환수지 간, 양이온 교환 상호 작용을 하는 이온성 불순물들을 효과적으로 제거할 수 있었고, 10% 메탄올 수용액으로는 물질과 혼합형 이온교환수지 간, 소수성 상호 작용을 하는 불순물들을 효과적으로 제거할 수 있었다.
- 따라서 대부분의 도핑 검사에서 경주마의 소변시료를 이용하여 검사를 실시하는 것이 바람직하며, 이를 이용한 연구는 다양하게 이루어지고 있다.2, 4-6 한편 혈액을 이용한 도핑검사의 장점은 분석이 요구되는 시점에서 즉시로 sampling 이 가능하며, 가끔 실패할 가능성이 있는 소변시료 채취와 달리 혈액채취는 항상 가능하며, 대사가 잘 일어나는 약물의 경우 모약물의 검출이 더 용이하다는 것이다.
- 4, 7 이에 호주 경마실험실에서는 위의 4가지 대상약물의 추출효율을 높이기 위하여 특수한 sorbent (Bond Elute PBA; phenylboronic acid covalently linked to a silica gel surface)를 사용할 것을 제안하고 있었다.4 따라서, 본 연구에서는 위 4가지 대상약물을 포함하여 총 55 종 염기성 약물에 대한 추출 효율이 좋은 혼합형 양이온 수지의 SPE 카트리지를 선택하고자 하였고, 분석 결과 Oasis MCX 와 XTRACT XRDAH를 이용할 경우 추출 효율이 상대적으로 우수함을 확인할 수 있었다.
- 55종 염기성 약물에 대한 검정 곡선은 0.05 ng/mL ~50 ng/mL 범위 내에서 codeine(0.9804)과 doxapram (0.9852)을 제외하고, 상관계수 (r2)가 0.99 이상의 직선성을 나타내었다. 검출한계는 0.
- 나타내었다. Oasis® MCX 에 의한 상대 회수율 결과는 caffeine (20.5%)를 제외하고 모두 80% 이상 좋은 결과를 나타내었고, XTRACT® XRDAH 에 의한 결과는 terbutaline (41.3%), salbutamol (71.5%) heptaminol (70.7%), phenylpropanolamine (66.3%)을 제외하고 모두 80% 이상 좋은 결과를 나타내었다.
- 제시하였다. SPE 를 이용한 전처리 단계에서는 2% 암모니아 수용액과 10% 메탄올 수용액의 최적 부피와 최적 유속을 결정하여, 시료 내에 포함되어 있는 많은 불순물들을 효과적으로 제거하면서 또한 양호한 회수율을 유지할 수 있었다.
- 각 카트리지별 상대 회수율과 유속을 비교한 결과 XTRACT® XRDAH SPE 카트리지가 경주마 도핑검사 적용에 적합함을 알 수 있었다. 다만 동일한 SPE 카트리지 부피(3 mL)에서 sorbent mass와 카트리지 입자크기 (particle size), pore size 가 일정하지 않아, 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 3 ng/mL로 측정되었다(Table 5). 또한 55종 염기성 약물을 LC- MS/MS의 MRM 방식으로 검출한 결과, 각 성분별 머무름 시간대에서 분석에 방해되는 어떠한 피이크도검출되지 않았다(Fig. 1).
- 3 ng/mL 의 농도 범위에 있는 것으로 확인하였다. 또한 LC-MS/ MS의 MRM 방법으로 55종을 분석한 결과, 각 대상 약물별 머무름 시간대에 방해되는 피이크가 검출되지 않음을 확인하였다.
- 5 mL 를 사용하기로 결정하였다. 또한 세척 과정에서 적용되는 용액의 유속 변화(분당 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL) 에 따른 상대 회수율 추이를 분석한 결과, 유속이 분당 2 mL 일 때 가장 좋은 분석 결과를 나타내었다 (Table 4).
- 하지만, 선정된 대상 약물들은 물리화학적인 성질이 다양하여 동시 분석을 수행하기 위한 최적 추출조건을 찾기에 어려움이 있었다. 특히 heptaminol, phenylpropanolamine, salbutamol, terbutaline 등은 혼합형 양이온 교환 수지로 분석하기에 적합하지 않음을 알 수 있었다.4, 7 이에 호주 경마실험실에서는 위의 4가지 대상약물의 추출효율을 높이기 위하여 특수한 sorbent (Bond Elute PBA; phenylboronic acid covalently linked to a silica gel surface)를 사용할 것을 제안하고 있었다.
- 확립된 실험방법에 대한 분석법 검증을 수행한 결과, 55종 약물에 대한 검량곡선의 직선성 상관계수 (r2)는 0.99 이상이었으며 (codeine, doxapram 은 예외), 검출한계 (LOD) 는 55종 대상 약물별로 0.2~8.3 ng/mL 의 농도 범위에 있는 것으로 확인하였다. 또한 LC-MS/ MS의 MRM 방법으로 55종을 분석한 결과, 각 대상 약물별 머무름 시간대에 방해되는 피이크가 검출되지 않음을 확인하였다.
후속연구
- 특히 heptaminol, phenylpropanolamine, salbutamol, terbutaline 등은 혼합형 양이온 교환 수지로 분석하기에 적합하지 않음을 알 수 있었다.4, 7 이에 호주 경마실험실에서는 위의 4가지 대상약물의 추출효율을 높이기 위하여 특수한 sorbent (Bond Elute PBA; phenylboronic acid covalently linked to a silica gel surface)를 사용할 것을 제안하고 있었다.4 따라서, 본 연구에서는 위 4가지 대상약물을 포함하여 총 55 종 염기성 약물에 대한 추출 효율이 좋은 혼합형 양이온 수지의 SPE 카트리지를 선택하고자 하였고, 분석 결과 Oasis MCX 와 XTRACT XRDAH를 이용할 경우 추출 효율이 상대적으로 우수함을 확인할 수 있었다.
- 적용에 적합함을 알 수 있었다. 다만 동일한 SPE 카트리지 부피(3 mL)에서 sorbent mass와 카트리지 입자크기 (particle size), pore size 가 일정하지 않아, 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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