배발생 캘러스 유도 실험을 통해 음나무의 대량 증식의 가능성을 제시하였다. 절편체의 부위 및 호르몬 농도에 따라 약간의 차이는 보였으나 대부분의 조건에서 배발생 캘러스가 유기되었다. 특히 엽병 절편체에 비하여 잎 절편체에서 배발생 캘러스 유기가 더 활발히 이루어졌으며, 2.0mg/l의 2,4-D와 0.1mg/l의 BA를 혼합 처리한 조건에서 가장 많이 유기됨을 확인할 수 있었다. 배발생 캘러스의 대량 증식을 위하여 현탁배양을 실시한 결과 1.0mg/l의 2,4-D를 첨가한 배양액이 증식에 가장 좋은 것으로 나타났으며, 무기염류를 1/2로 반감한 B5 배지와 White 배지가 적당한 것으로 나타났다. 또한 탄소원은 3%의 농도를 사용하였을 때 캘러스 증식 뿐만 아니라 체세포 배의 발아에도 적당한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 결과는 생물반응기를 이용한 음나무의 대량 생산을 가능하게 하는 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
배발생 캘러스 유도 실험을 통해 음나무의 대량 증식의 가능성을 제시하였다. 절편체의 부위 및 호르몬 농도에 따라 약간의 차이는 보였으나 대부분의 조건에서 배발생 캘러스가 유기되었다. 특히 엽병 절편체에 비하여 잎 절편체에서 배발생 캘러스 유기가 더 활발히 이루어졌으며, 2.0mg/l의 2,4-D와 0.1mg/l의 BA를 혼합 처리한 조건에서 가장 많이 유기됨을 확인할 수 있었다. 배발생 캘러스의 대량 증식을 위하여 현탁배양을 실시한 결과 1.0mg/l의 2,4-D를 첨가한 배양액이 증식에 가장 좋은 것으로 나타났으며, 무기염류를 1/2로 반감한 B5 배지와 White 배지가 적당한 것으로 나타났다. 또한 탄소원은 3%의 농도를 사용하였을 때 캘러스 증식 뿐만 아니라 체세포 배의 발아에도 적당한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 결과는 생물반응기를 이용한 음나무의 대량 생산을 가능하게 하는 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
Kalopanax pictus was cultured in vitro to find out optimal condition for embryogenic cells proliferation in liquid media rapidly. Embryogenic cells were induced from leaves and petiols of Kalopanax pictus. Optimum culture medium appeared to be a 1/2MS medium supplemented with 2.0mg/L 2,4-D and 0.1mg...
Kalopanax pictus was cultured in vitro to find out optimal condition for embryogenic cells proliferation in liquid media rapidly. Embryogenic cells were induced from leaves and petiols of Kalopanax pictus. Optimum culture medium appeared to be a 1/2MS medium supplemented with 2.0mg/L 2,4-D and 0.1mg/L BA. To find out optimal conditions, embryogenic cells were cultured some condition as different concentrations of 2,4-D, medium and sucrose. There was cultured on 1/2MS liquid medium containing different concentration of 2,4-D. When embryogenic cells were cultured on 1/2MS liquid medium supplemented with 1.0mg/L 2,4-D, cell propagation rate was higher than other concentration of 2,4-D. When embryogenic cells were cultured on different media that MS, Gambols B5, N6, White, SH medium, observed the highest multiplication rate among Gambols B5 and White medium. To find out of effect of sucrose to embryogenic cells propagation, we tested cells under different concentrations. Optimal concentration of sucrose appeared to be a basal medium added 3% sucrose. Above results suggest that optimal conditions for proliferation of embryogenic cells were established Gambols B5 and White medium added 1.0mg/L 2,4-D and 3% sucrose. There is every possibility achieving embryogenic cells proliferation via bioreactor culture system in Kalopanax pictus.
Kalopanax pictus was cultured in vitro to find out optimal condition for embryogenic cells proliferation in liquid media rapidly. Embryogenic cells were induced from leaves and petiols of Kalopanax pictus. Optimum culture medium appeared to be a 1/2MS medium supplemented with 2.0mg/L 2,4-D and 0.1mg/L BA. To find out optimal conditions, embryogenic cells were cultured some condition as different concentrations of 2,4-D, medium and sucrose. There was cultured on 1/2MS liquid medium containing different concentration of 2,4-D. When embryogenic cells were cultured on 1/2MS liquid medium supplemented with 1.0mg/L 2,4-D, cell propagation rate was higher than other concentration of 2,4-D. When embryogenic cells were cultured on different media that MS, Gambols B5, N6, White, SH medium, observed the highest multiplication rate among Gambols B5 and White medium. To find out of effect of sucrose to embryogenic cells propagation, we tested cells under different concentrations. Optimal concentration of sucrose appeared to be a basal medium added 3% sucrose. Above results suggest that optimal conditions for proliferation of embryogenic cells were established Gambols B5 and White medium added 1.0mg/L 2,4-D and 3% sucrose. There is every possibility achieving embryogenic cells proliferation via bioreactor culture system in Kalopanax pictus.
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문제 정의
음나무의 기내 대량 생산을 위한 기초 연구인 현탁배양시 음나무 배발생 캘러스의 증식에 영향을 미치는 요소에 대하여 연구하였다.
3). 이 결과를 바탕으로 액체배지가 배발생 캘러스의 대량 증식에 적합하여, 액체배지에서의 대량 증식 조건을 규명하기 위하여 다음 실험을 실시하였다.
제안 방법
사용하였다. 2, 4-D 농도별 증식실험은 MS 기본 액체배지에 2, 4-D를 0.5, 1.0, 2.0, 4.0mg/l의 농도별로 처리하였다. 탄 소원농도별 증식실험은 MS 기본배지 및 1/2MS 배지에 /I 2, 4- 와 sucrose를 0, 1, 2, 3, 5%로 농도별 처리하였다.
7). 각 농도별 배양액에서 증식된 배발생 캘러스를 2, 4-D를 첨가하지 않은 기본 배지에 현탁하였을 경우, sucrose의 농도가 1%, 2% 및 3%인 경우에는 대부분의 캘러스가 체세포 배로 발달하였으며, 배양 후 정상적인 형태의 자엽이 출현하였으며, 하배축이 가늘고 길게 형성된 반면, 5%의 sucrose가 첨가된 배양액에서 증식된 캘러스는 체세포 배로의 발달은 정상적으로 이루어졌으나 자엽이 형성되지 않고, 하배축은 짧고 굵으며 여러개의 체세포 배가 뭉쳐서 정상적인 발아가 이루어지지 않았으며, 배양 중 대부분의 발아된 배가 갈변하여 고사하였다.
및 농도에 따른 실험을 실시하였다. 배발생 캘러스 증식 실험을 위하여, Moon 등(2005)의 방법에 따라 배발생 캘러스를 MS 기본배지에 5% sucrose와 lmg/1 2, 4-D를 첨가하여 0.3% gelrite로 고체화한 배지에서 치상하여 유지하였으며, 2주 간격으로 계대배양하였다. 배지는 121℃에서 20분간 고압멸균하여 90x15의 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다.
배지 물리성에 따른 음나무 배발생 캘러스 증식 정도를 알아보기 위하여 gelrite 첨가 여부에 따라 고체배지와 액체배지의 두 가지로 실험하였으며, MS 기본배지에 lmg/1 2, 4-를 첨가하여 사용하였다. 2, 4-D 농도별 증식실험은 MS 기본 액체배지에 2, 4-D를 0.
탄 소원농도별 증식실험은 MS 기본배지 및 1/2MS 배지에 /I 2, 4- 와 sucrose를 0, 1, 2, 3, 5%로 농도별 처리하였다. 배지 종류 및 농도별 캘러스 증식 실험은 MS, B5, N6, White, SH medium 등 5가지 배지를 이용하였으며, 이 배지 중 선발된 B5 와 White 배지를 농도별로 1/4, 1/3, 1/2, 1, 2, 3배의 6가지 농도로 처리하였으며, 모든 배지에는 2, 4-D를 lmg/1 첨가하여 증식 실험을 실시하였다. 위의 모든 실험은 배지 물리성 실험의 결과를 바탕으로 액체배지를 이용하였으며, 100ml용 삼각플라스크에 배지를 50ml씩 분주하여 고압멸균하여 사용하였고, 배 발생 캘러스를 각 처리별로씩 접종하여 4주간 현탁배양하여 증식 정도를 확인하였다.
배지 종류 및 농도별 캘러스 증식 실험은 MS, B5, N6, White, SH medium 등 5가지 배지를 이용하였으며, 이 배지 중 선발된 B5 와 White 배지를 농도별로 1/4, 1/3, 1/2, 1, 2, 3배의 6가지 농도로 처리하였으며, 모든 배지에는 2, 4-D를 lmg/1 첨가하여 증식 실험을 실시하였다. 위의 모든 실험은 배지 물리성 실험의 결과를 바탕으로 액체배지를 이용하였으며, 100ml용 삼각플라스크에 배지를 50ml씩 분주하여 고압멸균하여 사용하였고, 배 발생 캘러스를 각 처리별로씩 접종하여 4주간 현탁배양하여 증식 정도를 확인하였다.
음나무 배발생 캘러스 대량 증식 조건을 구명하기 위하여 배지의 물리성, 2, 4-D 농도별, 탄소원(sucrose) 농도별, 배지 종류 및 농도에 따른 실험을 실시하였다. 배발생 캘러스 증식 실험을 위하여, Moon 등(2005)의 방법에 따라 배발생 캘러스를 MS 기본배지에 5% sucrose와 lmg/1 2, 4-D를 첨가하여 0.
음나무 배발생 캘러스 유도에 미치는 옥신 및 시토키닌의 효과를 알아보고자 MS(Murashige and Skoog, 1962)배지에 2, 4-D(2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid)는 4농도(0.5, 1.0, 2.0 및 4.0mg/l) 수준으로 처리하였으며 0.1mg/l BA(6-benzy- laminopurine)를 각 처리구에 첨가하여 사용하였다. 배지는 PH5.
0mg/l의 농도별로 처리하였다. 탄 소원농도별 증식실험은 MS 기본배지 및 1/2MS 배지에 /I 2, 4- 와 sucrose를 0, 1, 2, 3, 5%로 농도별 처리하였다. 배지 종류 및 농도별 캘러스 증식 실험은 MS, B5, N6, White, SH medium 등 5가지 배지를 이용하였으며, 이 배지 중 선발된 B5 와 White 배지를 농도별로 1/4, 1/3, 1/2, 1, 2, 3배의 6가지 농도로 처리하였으며, 모든 배지에는 2, 4-D를 lmg/1 첨가하여 증식 실험을 실시하였다.
표면살균은 tween20액을 몇 방울 첨가하여 거품을 내어 수돗물로 약 3시간가량 수세한 후, 무균상에서 70% (v/v) 에탄올로 , 멸균수로 1회 수세, 1% NaClO 액 (v/v)으로 10분간 표면 살균 후 멸균수로 3회 수세하였다. 다음 여과지에서 수분을 제거한 후 살균 시 약해를 받은 부분을 잘라내고 캘러스 유도 배지에 치상하였다.
대상 데이터
식물재료는 온실에서 자란 음나무의 어린 잎, 엽병, 뿌리를 사용하였다. 표면살균은 tween20액을 몇 방울 첨가하여 거품을 내어 수돗물로 약 3시간가량 수세한 후, 무균상에서 70% (v/v) 에탄올로 , 멸균수로 1회 수세, 1% NaClO 액 (v/v)으로 10분간 표면 살균 후 멸균수로 3회 수세하였다.
성능/효과
1). 2, 4-의 농도에 따른 캘러스 형성은 농도별로 확연한 차이는 보이지 않았으나 저농도보다 고농도에서 잘 유도되는 것을 확인할 수 있었으며(Table 1), 대부분의 식물체와 마찬가지로 고동도의 옥신류와 저농도의 사이토키닌류를 조합하여 캘러스를 유도하였을 때 세포분열이 왕성히 일어나 캘러스 유도가 잘 일어나는 것처럼 음나무 절편에서도 비슷한 양상을 보였다. 유도된 캘러스는 lmg/1 의 2, 4-D와 /1의 L-glutamine이 첨가된 1/2MS 기본배지로 계대배양 후 (Moon et al.
Omg/1 의 2, 4-D를 첨가하여 실험을 실시하였다. 기존에 사용하던 MS 기본배지에 비하여 B5 배지와 White 배지에서의 캘러스 증식이 매우 잘되는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이것은 MS 배지에 비하여 위 두가지 배지에 함유된 암모니아태 질소의 함량이 B5배지의 경우 약 1/16 정도이며, White 배지의 경우는 암모니아태 질소가 전혀 들어있지 않기 때문으로 생각된다.
모든 배양된 조직의 절편에서 캘러스가 유도되었으며, 절편의 잘려진 부분에서 먼저 형성되었고 색깔은 흰색, 연노란색, 노란색 등 다양하게 나타났다(Fig. 1). 2, 4-의 농도에 따른 캘러스 형성은 농도별로 확연한 차이는 보이지 않았으나 저농도보다 고농도에서 잘 유도되는 것을 확인할 수 있었으며(Table 1), 대부분의 식물체와 마찬가지로 고동도의 옥신류와 저농도의 사이토키닌류를 조합하여 캘러스를 유도하였을 때 세포분열이 왕성히 일어나 캘러스 유도가 잘 일어나는 것처럼 음나무 절편에서도 비슷한 양상을 보였다.
0cm까지 자랐다. 배 발생 유도에서 얻어진 캘러스 중 주로 노란색 계통이며, 잘 부서지는 캘러스에서 배발생 캘러스가 유도되었으며, 흰색의 캘러스에서는 배발생 캘러스가 유도되지 않았다.
배발생 캘러스의 증식에 영향을 미치는 요인 중의 하나인 sucrose를 농도별로 처리한 결과, 3%의 sucrose를 첨가한 배양액에서 가장 많은 양이 증식됨을 알 수 있었다(Fig.7). 각 농도별 배양액에서 증식된 배발생 캘러스를 2, 4-D를 첨가하지 않은 기본 배지에 현탁하였을 경우, sucrose의 농도가 1%, 2% 및 3%인 경우에는 대부분의 캘러스가 체세포 배로 발달하였으며, 배양 후 정상적인 형태의 자엽이 출현하였으며, 하배축이 가늘고 길게 형성된 반면, 5%의 sucrose가 첨가된 배양액에서 증식된 캘러스는 체세포 배로의 발달은 정상적으로 이루어졌으나 자엽이 형성되지 않고, 하배축은 짧고 굵으며 여러개의 체세포 배가 뭉쳐서 정상적인 발아가 이루어지지 않았으며, 배양 중 대부분의 발아된 배가 갈변하여 고사하였다.
배지 물리성에 따른 배발생 캘러스의 증식 실험을 실시한 결과, gelrite를 첨가한 고체배지에 비해 gelrite를 첨가하지 않은 액체배지에서 약 5배의 증식률을 보였다(Fig. 3). 이 결과를 바탕으로 액체배지가 배발생 캘러스의 대량 증식에 적합하여, 액체배지에서의 대량 증식 조건을 규명하기 위하여 다음 실험을 실시하였다.
배지의 농도에 따른 캘러스의 증식은 B5와 White 배지 모두에서 1/2의 농도에서 가장 많이 증식되는 것으로 나타났다(Fig. 6). 이 사실로 보아 캘러스의 생장 및 증식에 암모니아태 질소와 질산태 질소의 비율도 중요할 뿐만 아니라 배양액내의 무기 염류의 양도 매우 중요한 요소임을 입증하는 결과이다.
액체 현탁배지에서의 음나무 배발생 캘러스의 증식이 가장 활발히 이루어지는 2, 4-D 농도를 확인하기 위하여 4수준의 농도별로 실험한 결과, L0mg/l의 2, 4-D를 첨가하였을 때 가장 많은 양의 캘러스가 증식되었다(Fig. 4). 또한 1회 현탁배양 기간을 최대 4주를 넘지 말아야 하며, 4주 이상 현탁하였을 경우 캘러스가 갈변하면서 배양액 안에서 죽게 된다(결과 미제시).
유도된 배발생 캘러스의 식물체로의 안정적 분화를 확인하기 위하여 실험을 실시한 결과, 대부분의 배발생 캘러스가 현탁배양을 통해 자엽형 체세포 배로 분화하는 것을 확인할 수 있었다. 자엽형 체세포 배를 Moon 등(2005)의 방법에 따라 식물체 분화실험을 한 결과, 자엽과 하배축이 신장하였으며, 약 12주간의 배양 후에 완전한 식물체의 형태를 갖추는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
6). 이 사실로 보아 캘러스의 생장 및 증식에 암모니아태 질소와 질산태 질소의 비율도 중요할 뿐만 아니라 배양액내의 무기 염류의 양도 매우 중요한 요소임을 입증하는 결과이다.
이것은 MS 배지에 비하여 위 두가지 배지에 함유된 암모니아태 질소의 함량이 B5배지의 경우 약 1/16 정도이며, White 배지의 경우는 암모니아태 질소가 전혀 들어있지 않기 때문으로 생각된다. 이것은 붉은잎자작나무에서의 배 발생 캘러스 실험 결과와 같은 양상으로 암모니아태 질소와 질산태 질소의 비율이 캘러스 생장과 색소 형성에 미치는 영향에 대한 실험 결과, 낮은 농도의 암모니아태 질소가 캘러스 형성에 유리하게 작용하는 것으로 나타났는데, 음나무 또한 붉은 잎 자작나무와 마찬가지로 암모니아태 질소의 비율이 질산태 질소의 비율에 비해 낮을 경우 캘러스의 형성 및 증식에 유리하게 작용하는 것으로 생각된다.
있었다. 자엽형 체세포 배를 Moon 등(2005)의 방법에 따라 식물체 분화실험을 한 결과, 자엽과 하배축이 신장하였으며, 약 12주간의 배양 후에 완전한 식물체의 형태를 갖추는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
후속연구
, 1998). 그러나 본 실험에서 음나무 배발생 캘러스 유도시 L-glutamine의 정확한 역할을 확인하기 위해서는 L-glutamine의 유무 및 농도에 따른 세분화된 실험을 통해 확인해야 할 것으로 생각된다. 또한 절편체의 종류와는 상관없이 절단면에서 더 많은 캘러스가 유도되는 경향을 보이는데 이는 wounding에 의한 stress 효과가 나타난 것으로 추정된다(Hernandez et al.
따라서 sucrose는 배발생 캘러스의 증식, 체세포 배 발아 및 식물체 형성에 영향을 미치는 중요한 요소이며 5% 수준에서 배발생 캘러스 증식률의 감소와 체세포 배의 비정상적인 발아는 배지의 삼투압이 지나치게 높거나 탄소 원의 독성에 의한 해로운 작용으로 추측된다(Mamiya and Sakamoto, 2000).이러한 경우 sucrose를 대체할 적정 탄소 원의 종류를 찾는 실험을 추가적으로 실시해야 할 것으로 생각된다.
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