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제안 방법
- 시아노박테리아의전체 DNA는 SDS/lysozyme 방법에 의해서 추출된다(10). NRPS/PKS 유전자의 유무는 degenerate primers에 의한 PCR 증폭에 의해서 조사되었다. NPRS gene의 탐침에는 MTF2/MTR2와 A3/A7 degenerate primers 쓰여졌고 PKS 유전자에는 DKF/DKR degenerate primer가 관련 유전자의 증폭과 탐지를 위해 사용되었다(11, 12).
- 그러므로 이번 연구에서는 시아노박테리아가 생산하는 세포외단백질 (extracellular proteins)에 대한 연구방법을 모색하고 특성화 하였다. NRPS/PKS에 관련된 유전자를 탐지하는 degenerated primers가 분자유전학적 스크리닝을 위하여 사용되었고 HPLC를 통해 정성분석이 이루어졌다.
- PCR Screening과 HPLC 정성분석을 통하여 선별되어 지는 균주가 알려지지 않은 경우 16S rDNA-PCR을 통해서 동정하였다. 시아노박테리아의 16S rRNA 유전자를 27F (5´-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3´) und 1492R (5´-GGYTACCTTGTTACGACTT-3´)을 이용하여 PCR로 증폭하여 서열분석하고 그 결과를 BLAST(http://ncbi.
- MTF2/MTR2와 DKF/DKR의 경우에는 증류수 7 μl 이외에 Taq polymerase Mix, 10 μl; DNA, 1 μl; 정방향 primer, 1 μl; 역방향 primer, 1 μl가 들어간다. PCR 반응은 94℃로 5분간의 분리과정을 거친 후 증폭 과정으로 94℃, 30초 55℃, 30초 72℃ 1분을 30회 시행하였으며 72℃, 10분과 10℃로 마무리 되었다. A3/A7의 경우에는 증류수 1 μl 이외에 Taq polymerase Mix, 10 μl; DNA, 1 μl; 정방향 primer, 4 μl; 역방향 primer, 4 μl가 들어간다.
- A3/A7의 경우에는 증류수 1 μl 이외에 Taq polymerase Mix, 10 μl; DNA, 1 μl; 정방향 primer, 4 μl; 역방향 primer, 4 μl가 들어간다. PCR 반응은 94℃로 5분간의 분리과정을 거친 후 증폭과정으로 denaturation 94℃, 30초 annealing 40℃, 30초 extension 72℃ 1분을 30회 시행하였으며 72℃, 10분과 10℃로 마무리 되었다
- gov/)에 적용하여 비교 분석하였다. PCR 반응은 96℃로 2.5분간의 분리과정을 거친 후 증폭과정으로 96℃, 30초 53℃, 30초 72℃ 3분을 30회 시행하였으며 72℃, 10분과 10℃로 마무리 하였다.
- PCR 스크리닝 총 98 개체의 시아노박테리아에서 NRPS/PKS 유전자를 확인하기 위해 3가지 디제너래이티드 프라이머 (degenerated primers)를 사용하여 분석하였다.
- 그러나 대부분의 novel drug에 대한 시아노박테리아의 연구는 세포내 단백질 (intracellular proteins)에 국한되어 있었다. 그러므로 이번 연구에서는 시아노박테리아가 생산하는 세포외단백질 (extracellular proteins)에 대한 연구방법을 모색하고 특성화 하였다. NRPS/PKS에 관련된 유전자를 탐지하는 degenerated primers가 분자유전학적 스크리닝을 위하여 사용되었고 HPLC를 통해 정성분석이 이루어졌다.
- 배양액에서 세포외물질이 확인된 4가지 균주들을 동정하였다. 각각 다른 균주들의 프라이머를 사용한결과 CBT57의 경우에는 확인이 불가능하였고, CBT62는 Pleurocapsa sp.
- 가 멸균필터를 통해 탄소원으로써 공급되었다. 배양액에서 시료를 채취하여 원심분리를 통해 시아노박테리아의 균체를 분리하였다. 세포가 분리된 배지는 고체상추출 (Solid Phase Extraction, 이하 SPE)을 하기 위해서 PD10-Column 또는 PD5-Column (Pharmacia GmbH, Erlangen)에 로딩되었다.
- PCR Screening과 HPLC 정성분석을 통하여 선별되어 지는 균주가 알려지지 않은 경우 16S rDNA-PCR을 통해서 동정하였다. 시아노박테리아의 16S rRNA 유전자를 27F (5´-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3´) und 1492R (5´-GGYTACCTTGTTACGACTT-3´)을 이용하여 PCR로 증폭하여 서열분석하고 그 결과를 BLAST(http://ncbi.nlm.nih.gov/)에 적용하여 비교 분석하였다. PCR 반응은 96℃로 2.
- 실험된 38개의 균주에서 putative PKS 유전자는 DKF/DKR degenerated primer를 사용하여 검출하였다. NRPS 유전자의 존재는 MTF2/MTR2 degenerated primer와 A3/A7 degenerated primer를 사용하여 확인될 수 있다.
대상 데이터
- 배양과정에서 생산되는 세포외부물질의 여부를 배양 후 세포들을 제거하고 남는 배지를분석한 결과, CBT57, CBT62, CBT590 and CBT632 균주들이 extracelluar product의 생산을 위한 균주로 선별되었다. 세포외물질들이 검출된 CBT57, CBT62, CBT590 and CBT632 균주들이 세포외 산물 (extracelluar product)의 생산을 위한 균주로 선별되었다. CBT62와 CBT632는 DKF/DKR degenerated primer와 degenerated PCR screening에 의해서 선별되었지만 CBT57와 CBT590은 어는 degenerated primer에 의해서도 검출되지 않았다.
- 시아노바이오텍사에서 제공된 98개의 균주들이 이번 실험에서 선별되었고, BG11 배지를 사용하여 25℃에서 광배양 (대략 1500lx) 되었다. 총 DNA를 추출하기 위해서 3주 동안 500 ml 플라스크에서 교반 배양되었다.
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