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문제 정의
- 본 연구에서는 현재 다양한 산업 분야에서 넓게 이용되는 효소이면서 향후에 산업적 중요성이 더욱 증대될 것으로 예상되는 Candida antarctica에서 유래된 lipase B (CalB)의 발현 시스템을 구축하였다. CalB는 비수용성 상태에서도 에스터 합성과 전이에스테르화반응에 관여하며, 높은 입체특이성과 특별한 조효소 없이 반응을 진행하고 높은 열안정성과 넓은 범위의 pH 활성 범위를 지니고 있다(5-9).
- 본 연구에서는 현재 산업적 응용이 활발하게 이루어지고 있고, 여러 장점을 지닌 효소인 Candida antarctica에서 유래된 lipase B (CalB)의 신속한 개질을 위해 취급이 용이한 E. coli를 이용하여 CalB 발현시스템을 구축하였다. E.
제안 방법
- pGro7, pTf16 그리고 pKJE7가 도입된 균주는 1 mg/ml L-arabinose를 첨가시켜주고, pG-Tf2의 경우에는 5 ng/ml tetracycline을 포함시켜주고, pG-KJE8의 경우에는 1 mg/ml L-arabinose와 5 ng/ml tetracycline을 추가한다. 37℃에서 colony를 배양한 후, 1 mM IPTG (Fluka, Switzerland)를 사용하여 induction을 실시하고 15℃에서 24시간 배양한 후, CalB의 발현을 halo의 생성여부와 크기로 확인한다.
- Cal B 유전자와 pCold Ι vector의 재조합 plasmid로 형질이 전환된 DH5α로부터 plasmid를 정제하고 Pst I과 Sac I으로 처리한 후, DNA 전기영동을 통해 확인하였다(Fig. 1).
- 2). Chaperone plasmid의 형질전환이 없이 pCold 재조합 plasmid만을 형질전환시킨 결과를 pKJE7, pGro7, pG-KJE8, pTf16, pG-Tf2와 재조합 pCold plasmid를 각각 형질전환시킨 것을 비교하였다. CalB를 발현하는 재조합 plasmid만을 형질전환시킨 균주와 비교하면 chaperone이 공동 형질전환된 균주에서 chaperone plasmid의 존재를 확인할 수 있는 band가 확인되었다.
- DH5α에 재조합 vector와 각 종의 chaperone들을 순차적으로 형질전환시킨 후, plasmid 정제과정을 거친 생성물들을 전기영동을 통해 확인하였다(Fig. 2).
- coli를 이용하여 CalB 발현시스템을 구축하였다. E. coli 발현 시스템에서 효소활성을 지니지 못하는 내포체를 생성하는 단점을 지니고 있어, soluble한 형태의 CalB 생성을 위해 저온 발현이 가능한 pCold I vector와 단백질 접힘을 도와주는 chaperone을 사용하여 CalB를 발현하였다. Liu 등(17)은 E.
- Halo 실험결과를 근거로 groES/groEL 유전자를 가지고 있는 pGro7 plasmid와 재조합 pCold I plasmid를 가지고 있는 3종의 균주에 대해 SDS-PAGE를 이용하여 CalB의 발현 여부를 확인하였다. Rosettagami에서 전체 단백질 샘플과 soluble 및 insoluble 샘플에서 모두 CalB의 발현을 확인할 수 있는 33 kDa에서 band를 확인하였다(Fig.
- Halo는 CalB가 발현이 되면서 halo plate에 포함된 trybutyrin을 균주가 분해하면서 생기는 현상으로 colony의 주위에 생성되는 halo의 유무와 크기를 비교하여 균주의 CalB 발현을 확인하였다. Halo plate 실험결과 CalB가 도입된 3종의 E.
- Marker DNA (pBR322 DNA BstN Ι Digest, New England Biolabs, USA)를 사용하여 1058bp와 929bp band 중간에 위치한 CalB 유전자를 확인하였다.
- PCR 생산물과 pCold І vector를 각각 Pst Ι (New England Biolabs, USA)과 Sac Ι (New England Biolabs, USA)으로 처리한 후, DNA Ligation kit Ver2.1 (Takara, Japan)을 사용하여 CalB가 재조합된 plasmid를 생성하였다.
- 균주별로 competent cell을 제조하여 chaperone plasmid와 혼합한 후, chloramphenicol이 포함된 LB agar plate에서 배양하고 선별된 colony는 chloramphenicol을 함유한 LB배지에서 배양하고 전기영동법을 통해 형질전환을 확인하였다.
- 다른 marker DNA (Lambda DNA Hind Ⅲ Digest, New England Biolabs, USA)를 이용하여 pCold Ι vector의 존재를 확인하였다.
- 원심분리한 후, 상등액은 centrifugal filter device (Millipore, USA)를 이용하여 soluble 샘플을 농축하고 침전물은 insoluble 샘플로 채취한다. 단백질 전기영동기 (Bio-rad, USA)를 이용한 SDS-PAGE (separation gel 12%, stacking gel 4%)를 사용하여 CalB의 발현을 확인하였다.
- 준비된 competent cell과 혼합한 후, ampicillin을 함유한 LB agar plate에서 형질이 전환된 colony를 선별하였다. 선별된 colony를 LB배지에서 배양한 후, Cosmo genetech사 (Korea)에서 나온 Labo passTM Mini kit를 사용하여 plasmid를 정제하였다. 정제된 plasmid는 Pst I과 Sac I으로 처리한 후, 전기영동법을 통해 형질전환을 확인하였다.
- coli는 이황화 결합을 제대로 생성하지 못하여 내포체를 생성하는 단점을 지니고 있다(11-12). 이에 본 연구에서는 내포체의 생성을 저해하기 위해 저온 발현을 시켜서 발현 속도를 늦추는 방법과 단백질 접힘을 도와주는 chaperone을 동시에 발현시키는 방법을 선택하였으며, 이를 위해 CalB가 도입된 pCold plasmid와 chaperone plasmid를 동시에 사용하여 E. coli에서의 CalB의 발현시스템을 구축하였다.
- 재조합 pCold plasmid와 pGro7을 제한효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 각각 처리한 결과를 재조합 pCold plasmid와 pGro7이 공동 형질전환된 균주에서 정제된 plasmid들을 제한 효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 처리하여 비교하였다.
- 재조합 pCold plasmid와 pGro7의 공동 형질전환을 확인하기 위해 제한효소 처리를 실시한 후 전기영동을 통해 확인해 보았다(Fig. 3). 재조합 pCold plasmid와 pGro7을 제한효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 각각 처리한 결과를 재조합 pCold plasmid와 pGro7이 공동 형질전환된 균주에서 정제된 plasmid들을 제한 효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 처리하여 비교하였다.
- 선별된 colony를 LB배지에서 배양한 후, Cosmo genetech사 (Korea)에서 나온 Labo passTM Mini kit를 사용하여 plasmid를 정제하였다. 정제된 plasmid는 Pst I과 Sac I으로 처리한 후, 전기영동법을 통해 형질전환을 확인하였다.
대상 데이터
- CalB의 발현시스템 구축을 위해 숙주세포로 E. coli의 대표적인 형질전환 균주인 DH5α, 이중황결합의 생성이 강화된 Rosettagami, 높은 형질전환 효율과 도입된 유전자의 안정성이 높은 Novablue가 사용되었다(Table 1) (13-14).
- CalB의 발현을 위해 범용 발현시스템인 E. coli 3종을 사용하였다. CalB의 경우 3개의 이중황결합을 가지고 있으나, E.
- Cold shock 단백질을 코드하는 cspA (Cold Shock Protein) 유전자와 cspA promotor, 5' UTR, cspA 단백질의 N 말단을 코드하는 부분을 포함하고 있는 4407 bp 크기의 pCold Ι (Takara, Japan)을 CalB 발현 vector로 사용하였다(15). Chaperone 동시 발현을 위해 Takara (Japan)사의 pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16 plasmid를 사용하였고 각 chaperone plasmid의 특징은 Table 2와 같다(16).
- Cold shock 단백질을 코드하는 cspA (Cold Shock Protein) 유전자와 cspA promotor, 5' UTR, cspA 단백질의 N 말단을 코드하는 부분을 포함하고 있는 4407 bp 크기의 pCold Ι (Takara, Japan)을 CalB 발현 vector로 사용하였다(15).
- 중합효소연쇄반응기는 Corbett Research CG1-96 (Australia)를 이용하였고 Solgent사 (Korea)의 Taq DNA Polymerase kit와 Pst Ι primer (AAT CTG CAG TCA GGG GGT GAC GAT), Sac Ι primer (AAT GAG CTC CTA CCT TCC GGT TCG)를 사용하였다.
이론/모형
- CalB 유전자 (1023 bp)를 증폭하기 위해서 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하였다. 중합효소연쇄반응기는 Corbett Research CG1-96 (Australia)를 이용하였고 Solgent사 (Korea)의 Taq DNA Polymerase kit와 Pst Ι primer (AAT CTG CAG TCA GGG GGT GAC GAT), Sac Ι primer (AAT GAG CTC CTA CCT TCC GGT TCG)를 사용하였다.
성능/효과
- 재조합 pCold plasmid와 pGro7을 제한효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 각각 처리한 결과를 재조합 pCold plasmid와 pGro7이 공동 형질전환된 균주에서 정제된 plasmid들을 제한 효소 Pst Ι과 Sac Ι으로 처리하여 비교하였다. 2종의 plasmid를 각각 분리하여 제한효소로 처리한 후에 나타나는 band들과 재조합 pCold plasmid와 pGro7이 공동 형질전환된 균주에서 정제된 plasmid를 제한효소로 처리한 후에 나타난 band들이 동일한 위치에서 관찰된 바, pGro7의 형질전환도 확인할 수 있었다. 동 실험을 통해 CalB가 재조합된 pCold plasmid와 5종의 chaperone plasmid가 각각 형질전환된 5종의 균주가 제작되었음을 확인하였다.
- Chaperone plasmid의 형질전환이 없이 pCold 재조합 plasmid만을 형질전환시킨 결과를 pKJE7, pGro7, pG-KJE8, pTf16, pG-Tf2와 재조합 pCold plasmid를 각각 형질전환시킨 것을 비교하였다. CalB를 발현하는 재조합 plasmid만을 형질전환시킨 균주와 비교하면 chaperone이 공동 형질전환된 균주에서 chaperone plasmid의 존재를 확인할 수 있는 band가 확인되었다. pGro7의 경우 재조합 pCold plasmid와 크기가 5400 bp 정도의 비슷한 크기를 가지고 있어 Fig.
- Table 3은 각각의 균주에 대해 halo 크기를 비교한 것으로 groES/groEL 유전자를 가지고 있는 pGro7을 도입한 균주가 다른 chaperone plasmid를 도입한 균주에 비해 halo의 크기가 상대적으로 크게 나타났으며, DH5α 와 Rosettagami가 Novablue에 비해 halo의 크기가 상대적으로 크게 나타났다.
- 결론적으로 groES/groEL의 동시 발현을 통해 soluble한 CalB의 발현이 가능하며, 신속하고 안정적으로 재조합 균주의 생성이 가능한 DH5α가 CalB의 발현시스템 구축에 더 효율적이라고 할 수 있다.
- Table 3은 각각의 균주에 대해 halo 크기를 비교한 것으로 groES/groEL 유전자를 가지고 있는 pGro7을 도입한 균주가 다른 chaperone plasmid를 도입한 균주에 비해 halo의 크기가 상대적으로 크게 나타났으며, DH5α 와 Rosettagami가 Novablue에 비해 halo의 크기가 상대적으로 크게 나타났다. 그리고 tig 유전자를 가지고 있는 pTf16을 도입한 3종의 재조합 균주에서 모두 halo가 관찰되었으나, 나머지 chaperone plasmid를 가지고 있는 균주에서는 halo가 생성되지 않거나 아주 미미한 수준으로 관찰되었다. Fig.
- 2종의 plasmid를 각각 분리하여 제한효소로 처리한 후에 나타나는 band들과 재조합 pCold plasmid와 pGro7이 공동 형질전환된 균주에서 정제된 plasmid를 제한효소로 처리한 후에 나타난 band들이 동일한 위치에서 관찰된 바, pGro7의 형질전환도 확인할 수 있었다. 동 실험을 통해 CalB가 재조합된 pCold plasmid와 5종의 chaperone plasmid가 각각 형질전환된 5종의 균주가 제작되었음을 확인하였다.
- 또한 신속한 CalB의 발현시스템을 구축하기 위해서는 유전자 조작의 용이성 및 안정성에서 우월한 DH5α가 Rosettagami에 비해 soluble한 CalB의 발현에 더욱 적합한 균주임이 관찰되었다.
- 본 실험을 통해 3종의 균주에서 모두 내포체에 CalB를 포함하고 있음을 확인하였으며, groES/groEL이 동시에 발현되는 경우에는 Rosettagami와 DH5α에서 soluble한 형태의 CalB가 발현됨을 확인하였다.
- 이중황결합의 생성이 강화된 Rosettagami가 3개의 이중황결합을 가지고 있는 CalB의 발현에 더 적합할 것이라 예상하였으나, DH5α와 비교하면 큰 차이는 보이지 않음에 따라 Rosettagami와 DH5α가 모두 soluble한 형태의 CalB 발현에 적당한 균주라고 할 수가 있다.
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