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문제 정의
- , 2006). 따라서 분화를 시키지 않은 냉동 전후의 제대 유래 줄기세포에서 이들 유전자를 발현한다는 점은 제대 유래 줄기세포가 심근세포를 포함한 중배엽성 기원의 세포와 신경세포로 분화할 수 있는 가능성을 제시한다.
- 따라서 탯줄에서 유래한 줄기세포의 동결보존법에 대한 연구는 앞으로 임상적으로 세포치료제의 사용에 있어서 필수적이라고 생각되며, 본 연구에서는 사람의 탯줄 유래 줄기세포를 동결보존한 후 해동시킨 세포의 증식 능력과 유전자 및 단백질의 발현 등을 통해 줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 살펴보았다.
- 본 연구에서는 동결방지제로 DMSO를 첨가하여 탯줄 유래 세포를 동결보존한 후 해동시켜 성장속도와 유전자 및 단백질의 발현 변화를 살펴보았다. 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동보존액에 넣어 액체질소에 6개월 동안 보관한 후 해동시킨 결과, 형태 변화 없이 냉동 전의 탯줄 유래 줄기세포와 유사한 형태를 유지하였다.
제안 방법
- 이후 biotinylated goat anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG를 실온에서 20분간 처리하였다. 3번 세척한 다음, horseradish peroxidase-conjugated streptavidin(Dako)을 20분간 처리하였다. 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Dako) 용액으로 발색하였다.
- 125% trypsin과 1 mM EDTA가 첨가된 HBSS로 3분간 처리하여 세포를 떼어낸 후 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 DMEM-LG에 1×106/㎖의 농도로 cryotube(Nunc)에 넣어준 후 —80℃에서 24시간 냉동 후 —196℃의 액체 질소로 옮겨 냉동 보존하였다. 6개월 후, 냉동 보존된 탯줄 유래 세포를 37℃ water bath에서 녹인 다음 15 ㎖ tube로 옮긴 후 10% FBS가 포함된 DMEM-LG를 첨가하였다. 이를 300×g로 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 다시 DMEM-LG로 2번 세척하였다.
- 25 U Taq polymerase(Fermentas), 10 pM의 sense와 antisense gene-specific primers가 혼합된 10 ㎕ 반응 용액으로 PCR을 수행하였다. Amplification은 총 35 cycles 수행하였으며, 각 cycle은 94℃에서 30초간의 denaturation, 30초간의 annealing, 72℃에서 30초간의 extension 과정으로 구성되었다. Annealing 과정의 온도는 Table 1에 표기하였다.
- 그 후 각 SSEA-3(1:50; R&D System), SSEA-4(1:50; Chemicon), Thy-1(1:20; Chemicon), fibronectin(1:200; Novocastra), vimentin(1:100; Novocastra), CD44(1:500; Novocastra), CD54(1:40; Novocastra), vWF (1:200; Novocastra), HLA-1(1:200; Novocastra), HLA-DR (1:50; Novocastra) mouse monoclonal antibody를 4℃에서 17시간 동안 처리 후, 세척하였다.
- 냉동 전후 탯줄 유래 세포의 유전자 발현 양상을 살펴보기 위해 냉동하기 전 계대 5번째의 탯줄 유래 세포와 냉동 보존 후 계대 5번째 탯줄 유래 세포를 RT-PCR을 수행하였다. 두 개의 다른 탯줄 유래 세포 모두 냉동 전후에 배아줄기세포, 배아종양세포에서 발현하는 유전자인 nanog와 Oct-4, 배아종양세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포에서 발현하는 유전자인 SCF(stem cell factor), 외배엽 세포에서 발현하는 NCAM (neural cell adhesion molecule)과 nestin, 중배엽 세포에서 발현하는 BMP-4, 내배엽 세포에서 발현하는 GATA-4, 조직 적합성복합체인 HLA-1 유전자를 발현하였다.
- 반응 종결 후, PCR 생성물들은 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 40% sucrose가 포함된 6×loading buffer에 혼합한 다음 2% agarose gel을 이용하여 전기영동하였다.
- 발색이 된 세포는 Ca2+, Mg2+-free DPBS로 세척하고 Mayer’s Haematoxylin으로 대조 염색한 후 광학 현미경(LSM 410; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 관찰하였다.
- 배양용기의 70～80% 정도로 세포가 자라면 0.125% trypsin과 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)가 첨가된 HBSS로 3분간 처리하여 세포를 떼어낸 후 2×103/㎠의 농도로 배양하였다.
- 배양용기의 70～80% 정도로 자란 2～3번째 계대 배양의 탯줄 유래 세포를 0.125% trypsin과 1 mM EDTA가 첨가된 HBSS로 3분간 처리하여 세포를 떼어낸 후 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 DMEM-LG에 1×106/㎖의 농도로 cryotube(Nunc)에 넣어준 후 —80℃에서 24시간 냉동 후 —196℃의 액체 질소로 옮겨 냉동 보존하였다.
- 이 후 Ca2+, Mg2+-free DPBS를 40배 첨가하여 실온에서 600×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 DMEM- LG로 2번 세척하였다. 분리된 세포를 100 U/㎖ penicillin, 0.1 ㎍/㎖ streptomycin, 3.7 ㎎/㎖ sodium bicarbonate, 그리고 10% FBS가 포함된 DMEM-LG에서 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다. 배양 3일 후 배양용기의 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고, 1주에 2번 배양액을 교체하였다.
- 반응은 42℃에서 60분간 진행되었다. 얻어진 RT products(cDNAs)는 2 mM MgCl2, 1x Taq buffer, 0.25 U Taq polymerase(Fermentas), 10 pM의 sense와 antisense gene-specific primers가 혼합된 10 ㎕ 반응 용액으로 PCR을 수행하였다. Amplification은 총 35 cycles 수행하였으며, 각 cycle은 94℃에서 30초간의 denaturation, 30초간의 annealing, 72℃에서 30초간의 extension 과정으로 구성되었다.
- 25% xylene cyanol, 40% sucrose가 포함된 6×loading buffer에 혼합한 다음 2% agarose gel을 이용하여 전기영동하였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하고 ultraviolet light를 이용하여 DNA의 영상을 얻었다.
대상 데이터
- 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Dako) 용액으로 발색하였다.
- 본 연구에 사용된 탯줄은 만삭 정상 산모의 제왕절개 또는 질식 분만 시 산모의 동의 하에 태아로부터 채취하였다. 채취한 조직은 24시간 내에 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구에서는 동결방지제로 DMSO를 첨가하여 탯줄 유래 세포를 동결보존한 후 해동시켜 성장속도와 유전자 및 단백질의 발현 변화를 살펴보았다. 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동보존액에 넣어 액체질소에 6개월 동안 보관한 후 해동시킨 결과, 형태 변화 없이 냉동 전의 탯줄 유래 줄기세포와 유사한 형태를 유지하였다. 체외에서 증식률 또한 냉동 전의 탯줄 유래 세포와 같이 계대 10번까지 배양이 가능했고, 분열횟수는 냉동 전후 각각 38번, 42번으로 조금 더 많이 분열한 것을 관찰하였다.
- 체외에서 증식률 또한 냉동 전의 탯줄 유래 세포와 같이 계대 10번까지 배양이 가능했고, 분열횟수는 냉동 전후 각각 38번, 42번으로 조금 더 많이 분열한 것을 관찰하였다. RT-PCR을 통해 냉동 보존 전후 유전자 발현을 분석한 결과, 세포 line에 따라 발현량의 변화가 있는 세포도 있긴 하였지만 모두 Oct-4, nanog, SCF를 포함한 배아 줄기세포나 중간엽 줄기세포에서 발현하는 줄기세포 관련 유전자들이 모두 발현하였으며, NCAM, GATA-4, BMP-4, HLA-1 또한 모두 발현하였다. 단백질 발현에서도 SSEA-3, -4, Thy-1를 포함한 줄기세포 표지 단백질이 냉동 전후 세포에서 발현하였지만, 그 발현량의 증가 및 감소를 나타내는 단백질도 있었다.
- 결론적으로, 탯줄 유래 세포를 냉동보존하였을 때 세포의 특성 변화 없이 보존되었다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 임상적으로 사용할 수 있는 세포의 수나 시간을 맞추는데 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 보인다.
- 두 개의 다른 탯줄 유래 세포 모두 냉동 전후에 배아줄기세포, 배아종양세포에서 발현하는 유전자인 nanog와 Oct-4, 배아종양세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포에서 발현하는 유전자인 SCF(stem cell factor), 외배엽 세포에서 발현하는 NCAM (neural cell adhesion molecule)과 nestin, 중배엽 세포에서 발현하는 BMP-4, 내배엽 세포에서 발현하는 GATA-4, 조직 적합성복합체인 HLA-1 유전자를 발현하였다. 그리고 두 종류의 세포 모두 중배엽 marker 유전자인 Brachyury와 조직 적합성 복합체 HLA-DR은 냉동 전후 탯줄 유래 세포 모두에서 발현하지 않았다(Fig. 3).
- 그러나 세포연접 물질인 CD44(homing cell adhesion molecule, HCAM), CD54(intracellular cell adhesion molecule, ICAM -1)은 냉동 보존 후 배양되었을 때 감소되었다. 내피세포에서 발현하는 vWF는 냉동 보존 전과 후 모두 약하게 발현되었으며, 조직적합성 복합체 항원인 HLA-DR은 냉동보존 전 후 탯줄 유래 세포 모두에서 발현하지 않았다.
- 냉동 전후의 탯줄 유래 세포를 면역세포 화학분석법을 통하여 단백질 발현을 분석한 결과, 배아줄기세포의 표지 물질로 알려진 SSEA-3, SSEA-4, 그리고 중간엽 줄기세포 표지 물질인 Thy-1은 냉동 전 후의 탯줄 유래 세포에서 모두 발현하였다. 그러나 SSEA-4과 Thy-1은 냉동보존 후 배양된 탯줄 유래 세포에서 발현량이 증가하는 양상을 보였다(Fig.
- 냉동 전후 탯줄 유래 세포의 유전자 발현 양상을 살펴보기 위해 냉동하기 전 계대 5번째의 탯줄 유래 세포와 냉동 보존 후 계대 5번째 탯줄 유래 세포를 RT-PCR을 수행하였다. 두 개의 다른 탯줄 유래 세포 모두 냉동 전후에 배아줄기세포, 배아종양세포에서 발현하는 유전자인 nanog와 Oct-4, 배아종양세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포에서 발현하는 유전자인 SCF(stem cell factor), 외배엽 세포에서 발현하는 NCAM (neural cell adhesion molecule)과 nestin, 중배엽 세포에서 발현하는 BMP-4, 내배엽 세포에서 발현하는 GATA-4, 조직 적합성복합체인 HLA-1 유전자를 발현하였다. 그리고 두 종류의 세포 모두 중배엽 marker 유전자인 Brachyury와 조직 적합성 복합체 HLA-DR은 냉동 전후 탯줄 유래 세포 모두에서 발현하지 않았다(Fig.
- 2). 이러한 결과로 미루어 보아, 냉동 보존하기 전후 탯줄 유래 세포의 형태적인 특성과 성장속도는 큰 차이가 없는 것으로 보인다.
- 세포 생존율은 냉동보존 후 해동시킨 세포에서 가장 중요한 요소로, 높은 생존율은 세포들이 얼음 크리스탈 형성이나 온도의 급격한 변화와 동결방지제의 세포독성과 같은 냉동보존 후 발생할 수 있는 세포 내 손상으로부터 보호되었다는 것을 의미한다. 이번 연구에서는 탯줄 유래 세포를 6개월 동안 냉동보존한 후 해동시켜 배양하였을 경우 74%의 생존율을 보였다. 이 수치는 골수 유래 줄기세포(Kotobuki et al.
- 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동보존액에 넣어 액체질소에 6개월 동안 보관한 후 해동시킨 결과, 형태 변화 없이 냉동 전의 탯줄 유래 줄기세포와 유사한 형태를 유지하였다. 체외에서 증식률 또한 냉동 전의 탯줄 유래 세포와 같이 계대 10번까지 배양이 가능했고, 분열횟수는 냉동 전후 각각 38번, 42번으로 조금 더 많이 분열한 것을 관찰하였다. RT-PCR을 통해 냉동 보존 전후 유전자 발현을 분석한 결과, 세포 line에 따라 발현량의 변화가 있는 세포도 있긴 하였지만 모두 Oct-4, nanog, SCF를 포함한 배아 줄기세포나 중간엽 줄기세포에서 발현하는 줄기세포 관련 유전자들이 모두 발현하였으며, NCAM, GATA-4, BMP-4, HLA-1 또한 모두 발현하였다.
후속연구
- 하지만 제대 유래 줄기세포를 효과적으로 임상 사용을 하기 위해서는 더 높은 생존율을 얻을 수 있는 냉동배양액 및 보존방법의 개발이 필요할 것으로 보이며, 이에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각된다. 또한, 본 연구에서는 냉동보존한 후 줄기세포의 분화능력에 대한 조사가 이루어지지 않았기 때문에 냉동보존 전후의 분화능력의 변화에 대한 실험이 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 결론적으로, 탯줄 유래 세포를 냉동보존하였을 때 세포의 특성 변화 없이 보존되었다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 임상적으로 사용할 수 있는 세포의 수나 시간을 맞추는데 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 보인다.
- 또한, Fu 등과 Weiss 등(2006)에서도 탯줄에서 유래한 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화 가능하다는 연구를 보고하였다. 이처럼 탯줄은 임상적 사용을 위한 줄기세포를 공급할 수 있는 조직으로 기대되며, 나아가 세포치료제로서 사용이 가능할 것으로 보인다.
- 그럼에도 불구하고, 냉동 보존한 후 세포들의 성장속도가 냉동 보존하기 전의 세포보다 조금 더 빨랐으며, 이들의 유전자 및 단백질의 발현 양상에도 큰 변화가 나타나지 않았다. 하지만 제대 유래 줄기세포를 효과적으로 임상 사용을 하기 위해서는 더 높은 생존율을 얻을 수 있는 냉동배양액 및 보존방법의 개발이 필요할 것으로 보이며, 이에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각된다. 또한, 본 연구에서는 냉동보존한 후 줄기세포의 분화능력에 대한 조사가 이루어지지 않았기 때문에 냉동보존 전후의 분화능력의 변화에 대한 실험이 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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