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문제 정의
- , 2007). 따라서 본 연구는 체외배양과정 중에 첨가된 멜라토닌이 생쥐 난자의 체외성숙 과정 중 생성되는 활성산소 제거제로 작용하여 성숙율을 증진시킬 수 있는지 알아보고, 이를 이용하여 배양조건을 개선하고자 수행되었다. 생쥐 난소에서 회수된 미성숙 난자를 네 군으로 나누었고, 첫번째 군을 대조군으로 멜라토닌을 첨가하지 않은 기본 성숙 배양액에서 배양하였다.
- 이상의 연구 결과로 oxidative stress가 난자의 성숙 과정에 유해한 영향을 미치는 요인이며, 난포액 내 멜라토닌이 이러한 oxidative stress 로부터 난자를 보호하여 난자의 질과 수정율을 향상시키는 역할을 할 것으로 여겨진다. 따라서 본 연구자들은 난포액 내에 다수 존재하며 강력한 활성산소 제거제로 알려진 멜라토닌을 배양액에 첨가하여 생쥐 난구세포-핵낭(germinal vesicle, GV) 시기 난자 복합체의 체외성숙에 미치는 영향을 알아보고자 하였으며, 이를 이용하여 체외성숙과정의 효율을 증진하기 위한 체외배양조건을 개선하고자 이 연구를 시행하였다.
- 1 nM을 첨가한 군에 비하여 유의적으로 높은 체외 성숙율을 나타냈다(Table 1). 이러한 결과는 멜라토닌이 생쥐 난자의 체외 성숙 과정에 있어 중요한 역할을 할 것이라는 가능성을 다시 한번 확인하게 하였고, 그 자세한 기작을 알아보기 위하여 추가의 연구를 진행하였다.
가설 설정
- A : TUNEL and DAPI staining. B : Percent of apoptotic cells in total cumulus cells. Data are shown as mean SEM for three replications.
제안 방법
- 1 μg의 total RNA로 Super ScriptTM II R Kit(Invitrogen)을 이용하여 RT를 시행하였다.
- 각 그룹의 난구세포를 회수하여 anti-histone으로 피막이 형성된 각 well에서 반응시킨 후 세척하였다. Conjugation solution(anti-DNA-POD)을 첨가하여 실온에서 90분간 incubation 후 세척하고 기질 용액을 첨가하여 반응시킨 다음 일정시간이 경과한 후 반응 종결 용액을 첨가하여 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 1 μg의 total RNA로 Super ScriptTM II R Kit(Invitrogen)을 이용하여 RT를 시행하였다. Oligo dT와 dNTP 등의 합성 시약을 RNA sample과 혼합한 후 PCR 기계에서 37℃ 20분, 65℃ 5분 후에 0.1 M DTT와 superscript를 첨가한 후 얼음에서 5분간 정치한 후 기계에 42℃ 60 min, 70℃ 15 min 동안 두어 first strand cDNA를 합성하였다. 연쇄중합법은 4 μL DEPC-treated water, 2 μL forward primer(5 pmole), 2 μL reverse primer(2 pmole), 10 μL premix with SYBR Green and 2 μL of cDNA template를 포함하는 20 μL에서 35 cycle을 증폭시켰다.
- TUNEL 방법을 이용하여 난구세포에서의 세포자연사 여부를 알아보았다. PI 염색을 통하여 전체 세포 수를 계수하고, 이에 대한 TUNEL 양성 염색을 나타내는 세포의 비율을 계산하여 분석하였다. Apoptotic 세포의 수는 대조군에서는 20.
- 회수된 난구세포는 1% paraformaldehyde로 10분간 고정시킨 후 1% BSA가 첨가된 Dulbecco's phosphate-buffered solution(DPBS, Gibco)으로 세척하고 fluorescein(tetra-methyl-rhodamine) conjugated dUTP(Roche Diagnostics)를 이용한 in situ apoptosis detection kit을 사용하여 염색하였다. propidium iodide(PI, Sigma)를 이용하여 핵을 염색하였으며, 1% BSA가 첨가된 DPBS 용액으로 세척 후에 mounting한 뒤 형광현미경 하에서 검경하였다.
- 각 군의 난구세포로 둘러싸인 체외성숙 전후의 난자로부터 난구세포를 회수하고 세포자연사를 확인하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling(TUNEL)을 시행하였다. 회수된 난구세포는 1% paraformaldehyde로 10분간 고정시킨 후 1% BSA가 첨가된 Dulbecco's phosphate-buffered solution(DPBS, Gibco)으로 세척하고 fluorescein(tetra-methyl-rhodamine) conjugated dUTP(Roche Diagnostics)를 이용한 in situ apoptosis detection kit을 사용하여 염색하였다.
- 각 Cycle은 95℃에서 30초, 각 primer 의 annealing 온도에서 30초, 72℃에서 30초로 구성되어 있다. 각 역전사 연쇄중합반응의 mixture는 DyNAmo SYBR green qPCR kit(Finnzymes)을 사용한 DNA Engine 2 fluorescence detection system(MJ research)을 사용하여 분석하였다. 본 실험에서 사용한 primer는 ribosomal protein S16 (RPS16) (5'-aga tga tcg agc cgc gc-3', 5'-gct acc agg gcc ttt gag atg ga-3': 163 bp, 58℃), Mtnr1-a(5'-cca ttt cat cgt gcc tat g-3', 5'-gta act agc cac gaa cag c-3'; 259 bp, 58℃), Mtnr1-b(5'-acg cat cta ttc ctg cac ctt c-3', 5'-ctg cgc aaa tca ctc ggt ctc-3'; 192 bp, 58℃)이었다.
- 생쥐 난소에서 회수된 미성숙 난자를 네 군으로 나누었고, 첫번째 군을 대조군으로 멜라토닌을 첨가하지 않은 기본 성숙 배양액에서 배양하였다. 나머지 실험군으로는 각각 0.1 nM, 10 nM, 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가하여 체외성숙을 실시하였다. 본 연구에서 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 군의 미성숙 난자가 대조군과 0.
- 난구세포로 둘러싸인 생쥐 미성숙 난자를 체외 배양한 후 극체 형성율을 통하여 멜라토닌이 체외성숙에 미치는 영향을 알아보았다. 실험에 앞서 멜라토닌의 첨가 농도는 예비실험을 통해 결정하였다(data not shown).
- 또한, 배양액에 첨가된 멜라토닌에 의한 난구세포 내 멜라토닌 수용체인 Mtnr1 발현의 조절 가능성을 검증하였다. 멜라토닌의 영향에 의해 성숙율이 가장 높고 세포자연사가 가장 낮게 관찰된 1,000 nM군과 멜라토닌을 첨가하지 않은 군을 선택하여 실험을 진행하였다.
- 또한, 배양액에 첨가된 멜라토닌에 의한 난구세포 내 멜라토닌 수용체인 Mtnr1 발현의 조절 가능성을 검증하였다. 멜라토닌의 영향에 의해 성숙율이 가장 높고 세포자연사가 가장 낮게 관찰된 1,000 nM군과 멜라토닌을 첨가하지 않은 군을 선택하여 실험을 진행하였다. 난구세포 내에서 멜라토닌 수용체 유전자들인 Mtnr1-a와 Mtnr1-b의 발현량은 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조군을 기준으로 상대적으로 비교하였을 때 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 군(0.
- 멜라토닌의 첨가가 배양 중 난구세포에서의 세포자연사에 미치는 영향을 정량적으로 알아보고자 면역효소흡착법을 이용하여 다시 분석하였다. 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조군에서는 평균 흡광도 값이 0.
- 미성숙 난자의 채취를 위해 암컷 생쥐의 복강 내에 5 IU의 pregnant mare's serum gonadotropin(PMSG, Folligon)을주사하여 난자의 성숙 정도를 균일하게 하고, 44～46시간 후에 경추 파열로 도살한 후 복강을 절개하여 난소를 분리하였다.
- 따라서 본 연구는 체외배양과정 중에 첨가된 멜라토닌이 생쥐 난자의 체외성숙 과정 중 생성되는 활성산소 제거제로 작용하여 성숙율을 증진시킬 수 있는지 알아보고, 이를 이용하여 배양조건을 개선하고자 수행되었다. 생쥐 난소에서 회수된 미성숙 난자를 네 군으로 나누었고, 첫번째 군을 대조군으로 멜라토닌을 첨가하지 않은 기본 성숙 배양액에서 배양하였다. 나머지 실험군으로는 각각 0.
- 연쇄중합법은 4 μL DEPC-treated water, 2 μL forward primer(5 pmole), 2 μL reverse primer(2 pmole), 10 μL premix with SYBR Green and 2 μL of cDNA template를 포함하는 20 μL에서 35 cycle을 증폭시켰다.
- 채취한 난구세포로 둘러싸인 난자(cumulus cells-enclosed oocytes, CEOs)는 체외성숙을 위해 임의로 나누어 각각 기본 배양액 또는 멜라토닌이 첨가된 기본 배양액에서 18시간 동안 배양한 후 도립 현미경(Nikon)으로 극체 형성(polar body formation, PB)을 확인하여 체외 성숙율을 평가하였다.
- 회수된 난구세포는 1% paraformaldehyde로 10분간 고정시킨 후 1% BSA가 첨가된 Dulbecco's phosphate-buffered solution(DPBS, Gibco)으로 세척하고 fluorescein(tetra-methyl-rhodamine) conjugated dUTP(Roche Diagnostics)를 이용한 in situ apoptosis detection kit을 사용하여 염색하였다.
대상 데이터
- 미성숙 난자의 채취를 위해 암컷 생쥐의 복강 내에 5 IU의 pregnant mare's serum gonadotropin(PMSG, Folligon)을주사하여 난자의 성숙 정도를 균일하게 하고, 44～46시간 후에 경추 파열로 도살한 후 복강을 절개하여 난소를 분리하였다. 난소는 M2 배양액이 들어있는 배양접시(Falcon)로 옮겨 해부 현미경 하에서 forcep과 29G 바늘로 난포를 터트려 난구세포-난자 복합체를 채취하였다. 회수된 핵낭 시기의 난자는 세척 후 체외 배양을 위해 준비해 둔 배양접시의 배양액 방울(50 μL)로 옮겨서 배양하였다.
- 배양접시는 최소한 12 시간 이전에 mineral oil(Sigma)로 덮은 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 평형하여 적정 pH가 유지되도록 한 후 사용하였다. 난자의 채취 및 세척은 M2 배양액을 이용하였고, 미성숙 난자의 체외 배양을 위한 기본배양액으로는 5% human serum albumin(HSA, Vitrolife)과 0.075 IU/mL FSH(Gonal-F, Serono), 0.5 IU/mL hCG(Pergonal, Serono), 1.0 g/mL-estradiol (Sigma)이 첨가된 G2.3 배양액(Vitrolife)을 사용하였다. 멜라토닌(Sigma)은 G2.
- 본 실험에서 사용한 primer는 ribosomal protein S16 (RPS16) (5'-aga tga tcg agc cgc gc-3', 5'-gct acc agg gcc ttt gag atg ga-3': 163 bp, 58℃), Mtnr1-a(5'-cca ttt cat cgt gcc tat g-3', 5'-gta act agc cac gaa cag c-3'; 259 bp, 58℃), Mtnr1-b(5'-acg cat cta ttc ctg cac ctt c-3', 5'-ctg cgc aaa tca ctc ggt ctc-3'; 192 bp, 58℃)이었다.
- 본 연구에 사용한 실험동물(샘타코, 오산)은 생후 3주된 ICR 계통의 생쥐 암컷을 이용하였고, 온도와 낮밤(낮 12시간, 밤 12시간)이 조절되는 사육실에서 물과 먹이를 충분히 공급하여 사육하였다.
데이터처리
- 각각의 실험은 3회 이상 반복하여 수행하였고, 실험 결과의 통계 처리는 Statistical Analysis System(SAS, Cary, NC, USA)에 의한 One-way ANOVA를 이용하였으며 p<0.05인 경우를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 1,000 nM 멜라토닌이 처리되거나 처리되지 않은 실험군의 난구세포를 회수하고, 세포 내 유전자 발현의 분석을 위해 실시간 역전사 연쇄중합법(real time-reverse transcriptionpolymerase chain reaction, real time RT-PCR)을 시행하였다. 회수된 난구세포에 300 μL의 trizole(Sigma)를 넣어 섞은 후에 10분간 정치하였다.
- Cytoplasmic histone-associated DNA 단편을 정량하기 위해 cell death detection kit(Roche)을 사용하여 two-step sandwich-type immunoassay 방법으로 면역효소흡착법을 수행하였다. 각 그룹의 난구세포를 회수하여 anti-histone으로 피막이 형성된 각 well에서 반응시킨 후 세척하였다.
- TUNEL 방법을 이용하여 난구세포에서의 세포자연사 여부를 알아보았다. PI 염색을 통하여 전체 세포 수를 계수하고, 이에 대한 TUNEL 양성 염색을 나타내는 세포의 비율을 계산하여 분석하였다.
- 유전자 발현의 상대적 양은 2－ΔΔCT method에 의해 분석되었다(Livak & Schmittgen, 2001).
성능/효과
- 실험에 앞서 멜라토닌의 첨가 농도는 예비실험을 통해 결정하였다(data not shown). 18시간 동안 체외배양한 난자의 성숙율은 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조군에서는 84.9%이었고, 멜라토닌이 각각 0.1 nM, 10 nM 첨가된 배양액에서 배양된 실험군에서는 각각 85.7%, 85.3%로 나타나 대조군에 비해 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 1,000 nM의 멜라토닌이 첨가된 배양액에서 배양된 실험군에서는 92.3%로 멜라토닌을 첨가하지 않거나 낮은 농도의 멜라토닌을 첨가한 그룹에서보다 더 높은 성숙율을 나타냈다(Table 1).
- Apoptotic 세포의 수는 대조군에서는 20.8±4.5였고, 멜라토닌을 각각 0.1 nM, 10 nM, 1,000 nM 첨가한 실험군에서는 각각 11.7±3.6, 7.7±2.7, 3.7±1.8로 배양액에 첨가한 멜라토닌의 농도가 증가됨에 따라 apoptotic 세포의 수가 감소한 것으로 나타났으며, 특히 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 실험군에서는 다른 군에 비해 유의하게 낮았다(Fig. 1).
- 난구세포 내에서 멜라토닌 수용체 유전자들인 Mtnr1-a와 Mtnr1-b의 발현량은 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조군을 기준으로 상대적으로 비교하였을 때 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 군(0.31±0.15, 0.18±0.13)에서 발현이 낮게 나타났다(Fig. 3).
- 하지만 멜라토닌이 첨가되거나 첨가되지 않은 배양액에서 배양된 난구세포를 수집하여 세포자연사를 비교한 결과, 멜라토닌을 첨가하지 않은 군에 비하여 1,000 nM을 첨가하였을 때 세포자연사율이 유의하게 감소하였다. 따라서 이러한 결과는 멜라토닌이 체외배양 중에 형성되는 활성산소의 유해한 영향으로 난구세포가 자연사하는 것을 방지하고, 이를 통해 난구세포가 체외성숙 과정 중 난자를 보호하고 난자성숙에 도움을 줄 수 있을 것이라고 예상할 수 있었다. 또한, 멜라토닌의 첨가는 난구세포 내의 멜라토닌 수용체의 mRNA의 발현을 증가시키지 않고, 오히려 감소시키는 결과를 보여준다(Fig.
- 따라서 이러한 결과는 멜라토닌이 체외배양 중에 형성되는 활성산소의 유해한 영향으로 난구세포가 자연사하는 것을 방지하고, 이를 통해 난구세포가 체외성숙 과정 중 난자를 보호하고 난자성숙에 도움을 줄 수 있을 것이라고 예상할 수 있었다. 또한, 멜라토닌의 첨가는 난구세포 내의 멜라토닌 수용체의 mRNA의 발현을 증가시키지 않고, 오히려 감소시키는 결과를 보여준다(Fig. 3). 이 결과는 멜라토닌의 난구세포에 대한 영향이 직접적이기보다 성숙을 도와주어 황체화하는 것과 같은 간접적인 영향을 미칠 것이라는 암시를 주나, 그 자세한 기작을 알기 위해서는 보다 많은 추가 연구가 필요하다.
- , 2008). 또한, 생쥐 미성숙 난자에 H2O2를 첨가하여 12시간 동안 배양하였을 때에는 제1극체 방출율이 유의하게 감소되었으나 멜라토닌을 동시에 첨가한 경우에는 제1극체 방출율이 상당히 극복되었다. 이상의 연구 결과로 oxidative stress가 난자의 성숙 과정에 유해한 영향을 미치는 요인이며, 난포액 내 멜라토닌이 이러한 oxidative stress 로부터 난자를 보호하여 난자의 질과 수정율을 향상시키는 역할을 할 것으로 여겨진다.
- 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조군에서는 평균 흡광도 값이 0.087±0.004이었고, 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 군에서는 흡광도 값이 0.052±0.011로 대조군에 비해 유의하게 낮은 것으로 나타났다.
- 1 nM, 10 nM, 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가하여 체외성숙을 실시하였다. 본 연구에서 1,000 nM의 멜라토닌을 첨가한 군의 미성숙 난자가 대조군과 0.1 nM을 첨가한 군에 비하여 유의적으로 높은 체외 성숙율을 나타냈다(Table 1). 이러한 결과는 멜라토닌이 생쥐 난자의 체외 성숙 과정에 있어 중요한 역할을 할 것이라는 가능성을 다시 한번 확인하게 하였고, 그 자세한 기작을 알아보기 위하여 추가의 연구를 진행하였다.
- 이상의 결과를 종합하면 체외성숙 배양액에 첨가된 멜라토닌은 체외배양과정에 형성되는 활성산소에 의한 난구세포의 세포자연사를 감소시킴으로써 난자의 체외성숙 능력을 향상시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 따라서 배아발생 능력이 확인된다면 미성숙 난자의 배양액에 멜라토닌을 첨가하는 것이 배양조건의 개선에 많은 기여를 할 것이다.
- 본 연구에서 각 군에서 체외성숙시킨 생쥐 난자의 세포자연사를 TUNEL 방법을 이용하여 분석하였으나, 어떠한 세포자연사도 관찰할 수 없었다(data not shown). 하지만 멜라토닌이 첨가되거나 첨가되지 않은 배양액에서 배양된 난구세포를 수집하여 세포자연사를 비교한 결과, 멜라토닌을 첨가하지 않은 군에 비하여 1,000 nM을 첨가하였을 때 세포자연사율이 유의하게 감소하였다. 따라서 이러한 결과는 멜라토닌이 체외배양 중에 형성되는 활성산소의 유해한 영향으로 난구세포가 자연사하는 것을 방지하고, 이를 통해 난구세포가 체외성숙 과정 중 난자를 보호하고 난자성숙에 도움을 줄 수 있을 것이라고 예상할 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하면 체외성숙 배양액에 첨가된 멜라토닌은 체외배양과정에 형성되는 활성산소에 의한 난구세포의 세포자연사를 감소시킴으로써 난자의 체외성숙 능력을 향상시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 따라서 배아발생 능력이 확인된다면 미성숙 난자의 배양액에 멜라토닌을 첨가하는 것이 배양조건의 개선에 많은 기여를 할 것이다.
- 이는 체외성숙과정에서 배양액 내 혈청의 결핍으로 인해 투명대 경화가 일어났거나, 세포질 성숙이 완전하지 않았기 때문으로 사료된다. 따라서 보다 직접적인 연구를 위해서는 미성숙 난자의 체외수정이 가능한 다른 동물 시스템을 이용하거나 세포질 내 정자 직접주입술의 도입이 필요할 것으로 여겨진다.
- 이것은 복합체의 바깥쪽에서 난구세포가 보호해 주었기 때문에 corona 안쪽의 세포자연사가 감소된 것으로 여겨진다. 본 연구에서 각 군에서 체외성숙시킨 생쥐 난자의 세포자연사를 TUNEL 방법을 이용하여 분석하였으나, 어떠한 세포자연사도 관찰할 수 없었다(data not shown). 하지만 멜라토닌이 첨가되거나 첨가되지 않은 배양액에서 배양된 난구세포를 수집하여 세포자연사를 비교한 결과, 멜라토닌을 첨가하지 않은 군에 비하여 1,000 nM을 첨가하였을 때 세포자연사율이 유의하게 감소하였다.
- 3). 이 결과는 멜라토닌의 난구세포에 대한 영향이 직접적이기보다 성숙을 도와주어 황체화하는 것과 같은 간접적인 영향을 미칠 것이라는 암시를 주나, 그 자세한 기작을 알기 위해서는 보다 많은 추가 연구가 필요하다.
- 또한, 생쥐 미성숙 난자에 H2O2를 첨가하여 12시간 동안 배양하였을 때에는 제1극체 방출율이 유의하게 감소되었으나 멜라토닌을 동시에 첨가한 경우에는 제1극체 방출율이 상당히 극복되었다. 이상의 연구 결과로 oxidative stress가 난자의 성숙 과정에 유해한 영향을 미치는 요인이며, 난포액 내 멜라토닌이 이러한 oxidative stress 로부터 난자를 보호하여 난자의 질과 수정율을 향상시키는 역할을 할 것으로 여겨진다. 따라서 본 연구자들은 난포액 내에 다수 존재하며 강력한 활성산소 제거제로 알려진 멜라토닌을 배양액에 첨가하여 생쥐 난구세포-핵낭(germinal vesicle, GV) 시기 난자 복합체의 체외성숙에 미치는 영향을 알아보고자 하였으며, 이를 이용하여 체외성숙과정의 효율을 증진하기 위한 체외배양조건을 개선하고자 이 연구를 시행하였다.
- 배양액 내에 멜라토닌의 첨가가 난자의 세포질 성숙에 미치는 영향을 비교하기 위해서는 각 군에서 얻은 성숙 난자를 이용한 배아 발생의 확인이 필요하다. 하지만 배아를 생성하기 위해서는 체외수정을 통한 수정란의 생산이 필요하나, 본 연구에서는 수정란의 생산율이 매우 저조하여 체외성숙을 통해 얻은 배아의 발생을 연구할 수 없었다. 이는 체외성숙과정에서 배양액 내 혈청의 결핍으로 인해 투명대 경화가 일어났거나, 세포질 성숙이 완전하지 않았기 때문으로 사료된다.
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