고추 역병이 발병된 토양 시료에서 길항미생물을 선발 및 개량하여 다시 현장에 적용했을 때 방제능 및 적응력이 높은 생물 방제균을 선발하고자 총 300여점의 경북 북부지역의 토양시료로부터 길항능이 우수한 균주를 분리하였으며, 이들을 대상으로 고추 역병균에 대한 항진균력이 가장 우수한 균주 AM-651을 최종 선발하였다. 분리균주 AM-651은 생리생화학적 특성과 16S rDNA sequencing의 방법을 이용하여 동정한 결과 Bacillus sp.로 동정되었다. 항진균성 활성물질의 생산을 위한 배지의 최적조건은 Davis minimal media를 변형하여 배양하였을 경우 pH 7, 온도 $30^{\circ}C$ 조건에서 고추 역병균에 대한 항진균 활성이 높았으며, 탄소원으로는 0.5% glucose, 질소원으로는 0.1% $(NH_4)_2SO_4$, 무기염으로는 0.7% $K_2HPO_4$를 첨가하였을 때 가장 높은 활성을 보였다 선발된 Bacillus sp. AM-651 균주를 시간대별로 배양 후 항진균력을 측정 해 본 결과 48시간 배양액에서 고추 역병균에 대한 억제율이 가장 높았다. 또한, Bacillus sp. AM-651의 배양액은 pH와 온도의 변화에서 안정된 활성을 보였다. Bacillus sp. AM-651은 고추 역병 외에도 B. sorokiniana, B. cinerea, R. solani 등에 대하여 항진균 활성이 높았고, 다른 식물성 병원균에 대해서도 비교적 항진균 활성이 높게 나타났다. 열처리한 Bacillus sp. AM-651 배양상등액은 처리전과 비슷한 항진균 활성을 가지므로 열에 안정한 물질인 것으로 추측되었다.
고추 역병이 발병된 토양 시료에서 길항미생물을 선발 및 개량하여 다시 현장에 적용했을 때 방제능 및 적응력이 높은 생물 방제균을 선발하고자 총 300여점의 경북 북부지역의 토양시료로부터 길항능이 우수한 균주를 분리하였으며, 이들을 대상으로 고추 역병균에 대한 항진균력이 가장 우수한 균주 AM-651을 최종 선발하였다. 분리균주 AM-651은 생리생화학적 특성과 16S rDNA sequencing의 방법을 이용하여 동정한 결과 Bacillus sp.로 동정되었다. 항진균성 활성물질의 생산을 위한 배지의 최적조건은 Davis minimal media를 변형하여 배양하였을 경우 pH 7, 온도 $30^{\circ}C$ 조건에서 고추 역병균에 대한 항진균 활성이 높았으며, 탄소원으로는 0.5% glucose, 질소원으로는 0.1% $(NH_4)_2SO_4$, 무기염으로는 0.7% $K_2HPO_4$를 첨가하였을 때 가장 높은 활성을 보였다 선발된 Bacillus sp. AM-651 균주를 시간대별로 배양 후 항진균력을 측정 해 본 결과 48시간 배양액에서 고추 역병균에 대한 억제율이 가장 높았다. 또한, Bacillus sp. AM-651의 배양액은 pH와 온도의 변화에서 안정된 활성을 보였다. Bacillus sp. AM-651은 고추 역병 외에도 B. sorokiniana, B. cinerea, R. solani 등에 대하여 항진균 활성이 높았고, 다른 식물성 병원균에 대해서도 비교적 항진균 활성이 높게 나타났다. 열처리한 Bacillus sp. AM-651 배양상등액은 처리전과 비슷한 항진균 활성을 가지므로 열에 안정한 물질인 것으로 추측되었다.
Biological antagonists of Phytophthora capsici were isolated from soil in Gyeongbuk, Korea. Among the isolated bacteria, a Bacillus sp. was identified from l6S rDNA sequence analysis and named Bacillus sp. AM-651. Bacillus sp. AM-65l strain which can strongly a antifungal activity against Phytophtho...
Biological antagonists of Phytophthora capsici were isolated from soil in Gyeongbuk, Korea. Among the isolated bacteria, a Bacillus sp. was identified from l6S rDNA sequence analysis and named Bacillus sp. AM-651. Bacillus sp. AM-65l strain which can strongly a antifungal activity against Phytophthora capsici. Culture conditions for the maximum production of the antagonistic substance were optimized. The production of antibiotic were high on modified Davis mineral medium pH 7 at $30^{\circ}C$. The medium for highest production of the agonistic substance optimized. It is composed the best activity on glucose, $(NH_4)_2SO_4$ and $K_2HPO_4$ at 0.5%, 0.1%, and 0.7%, respectively. By time course of culture solution selected Bacillus sp. AM-65l, the culture solution after 48hrs had strongly growth inhibition rate against P. capsici. And culture solution of Bacillus sp. AM-651 was stable within a pH range $5{\sim}11$ and temperature range $4{\sim}70^{\circ}C$. Bacillus sp. AM-651 cultured broth shown fungal growth inhibitory activity against B. sorokiniana, B. cinerea, R. solani avove and beyond P. capsici and comparatively showed a high activity against C. gloeosporioides, B. dothidea, B. cinerea and F. graminearum by agar diffusion method.
Biological antagonists of Phytophthora capsici were isolated from soil in Gyeongbuk, Korea. Among the isolated bacteria, a Bacillus sp. was identified from l6S rDNA sequence analysis and named Bacillus sp. AM-651. Bacillus sp. AM-65l strain which can strongly a antifungal activity against Phytophthora capsici. Culture conditions for the maximum production of the antagonistic substance were optimized. The production of antibiotic were high on modified Davis mineral medium pH 7 at $30^{\circ}C$. The medium for highest production of the agonistic substance optimized. It is composed the best activity on glucose, $(NH_4)_2SO_4$ and $K_2HPO_4$ at 0.5%, 0.1%, and 0.7%, respectively. By time course of culture solution selected Bacillus sp. AM-65l, the culture solution after 48hrs had strongly growth inhibition rate against P. capsici. And culture solution of Bacillus sp. AM-651 was stable within a pH range $5{\sim}11$ and temperature range $4{\sim}70^{\circ}C$. Bacillus sp. AM-651 cultured broth shown fungal growth inhibitory activity against B. sorokiniana, B. cinerea, R. solani avove and beyond P. capsici and comparatively showed a high activity against C. gloeosporioides, B. dothidea, B. cinerea and F. graminearum by agar diffusion method.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 고추역병을 야기하는 Phytophthora capsici어) 대하여 강한 항진균 활성을 나타내는 길 항균 주를 선발 및 동정을 하고, 그 길항균주가 생산하는 항진균성 물질의 생산성의 최적화를 검토하고, 역병방제 미생물 제제화 및 생물 농약으로서 친환경농자재의 개발에 가능성과 기초를 마련하고자하였다.
제안 방법
AM-651 를 이용흐}여 다른 식물병원균에 대한 항진균 효과 여부를 알아보기 위하여 Bipolaris sorokiniana, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani 등의 진균 10종에 대하여 고 주역 병균과 동일한 실험 방법으로 조사하였다.
길항세균 Bacillus sp. AM-651이 생산하는 항진균 물질을 고추 역병외 다른 식물병원균에 대한 방제 활성을 조사하기 위하여, 총 10종의 식물병원균에 대해 항진균 활성을 고추 역병균 실험과 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 A.
IN NaOH, IN HCI로 pH 3-11 로 조절된 최적배지에 분리 균주를 접종하고 4일 동안 배양하면서 경시적으로 상등액을회수흐]였고, agar diffusion method에 따라 항진균 활성을 조사하였다. 항생물질 생산에 대한 온도에 영향을 조사하기 위해 25-40℃에서 4일 동안 배양하면서 경시적으로 상등액을 회수하여 diffusion method에 따라 항진균 활성을 조사하였다.
고추역병균의 균사생장을 억제시키는 균주중 항진균 활성 가장 우수한 균주를 선별하여 16S rDNA sequencing을 통하여 균주를 동정하고 계통분류도를 그렸다.
고추역병에 대해 강한 억제활성을 갖는 길항세균의 분리 및 선발을 위해 총 300여점의 시료에서 균주를 분리하였고, 이들의 항진균 활성을 검정하여 총 8종의 균주를 선발하였다. 각 선발된 균주의 항균력은 50% 이상으로 조사된 #13이 65%, #32이 60%, 이 51%, 6이 50%, #170이 63%, E4가 72%, JH 68%, AM-651 이 90%로 이들 중 가장 길항력이 높게 나타난 AM-651 을 최종 선발하여 실험에 사용하였다.
길항균이 생산하는 항진균성 활성물질에 의한 고추 역병균 생육의 길항정도를 측정하기 위해 먼저 길항세균을 최소배지(0.5% glucose, 0.7% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.1% (404, 0.01% MgSO4?H2O, 0.01% yeast extract)에 30℃에서 2일간 전 배양한 후 8,000 rpm에서 15분간 원심분리 한 후, agar diffusion method를 이용하여 3xl06~7 cfu/ ml로 P. cac가 접종되어진 PDA plate에 상등액 100 |1L 를 점적한 paper disc(08mm)를 올려, 28<>C에서 7일간 배양하여 항진균 활성을 조사하였다.
미생물을 분리하였다. 순수 분리한 균주들 중 고추 역병을 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 각 균주의 배양 상등액을 PDA 배지에 접종한 후 중앙에 V8 쥬스배지에 전배양한 고추역병의 균총(5 mm)을 각각 접종하여 28℃에서 5일간 배양 후 고추역병의 균사생장을 억제시키는균주를 최종 선발하였다.
활성을 조사하였다. 온도에 대한 안정성은 상등액을 온도 -20, -4, 0, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 70 그리고 90℃에서 30분 동안 처리하고, 110과 12FC에서 3(분간 고압 열처리하여 조사하였다.
최종 선발된 길항균의 배양조건에 따른 생장 및 항진균 활성 물질의 생산특성을 조사하기 위하여 최소배지에 균주를 접종하고 30℃, 130ipm2로 진탕배양 하여 600 nm서 흡광도를 측정하였다.
최종 선발된 길항세균 배양액의 pH에 대한 안정성은 최적화된 배지에 분리균주를 l%(v/v)되게 접종한 후, 30℃에서 2일간 130 rpm으로 진탕 배양하여 상등액을 pH 3, 5, 7, 9 그리고 11로 조절하여 diffusion method를 이용하여 항진균 활성을 조사하였다. 온도에 대한 안정성은 상등액을 온도 -20, -4, 0, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 70 그리고 90℃에서 30분 동안 처리하고, 110과 12FC에서 3(분간 고압 열처리하여 조사하였다.
탄소원의 첨가에 따른 항진균성 활성물질의 생산에 대한영향을 조사하기 위하여 Davis 최소 배지(0.5% glucose, 0.7% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.1% (NH4)2SO4, 0.01% MgSO4-7H2OH 탄소원으로 glucose를 제외시키고 8종의 탄소 원인 glucose, fructose, mannose, sucrose, maltose, lactose, starch 그리고 pectin을 각각 0.5%씩 첨가하였으며, 질소원으로 (NH&SQ를 제외시키고 13종의 질소원인 yeast extract, tryptone, malt extract, beef extract, peptone, urea, NH4CI, (NH4)2HPO4, KNO3, NH4HCO3, NaNO3 그리고 NH4NO3를 각각 0.1% 첨가하였고, 무기염의 경우 K2HPO4 를 제외시키고 9종의 무기 염인 Na2HPO4, NaH2PO4, NH4H2PO4, MgCl2, CaCl2, NaCl, KC1, CaCO3 그리고 ZnSQ를 각각 0.7% 첨가하여 각각에 대한 항진균성 활성 물질 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 항진균 활성은 선발된 균을 3VC에서 4일간 130rpm으로 진탕 배양하면서 배양액을 경시적으로 채취하였으며 8, 000rpm에서 15분간 원심 분리한 상등액을 이용해 발육 균체량 측정법에 따라 항진균 활성을 조사하였다.
7% 첨가하여 각각에 대한 항진균성 활성 물질 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 항진균 활성은 선발된 균을 3VC에서 4일간 130rpm으로 진탕 배양하면서 배양액을 경시적으로 채취하였으며 8, 000rpm에서 15분간 원심 분리한 상등액을 이용해 발육 균체량 측정법에 따라 항진균 활성을 조사하였다.
대상 데이터
각 선발된 균주의 항균력은 50% 이상으로 조사된 #13이 65%, #32이 60%, 이 51%, 6이 50%, #170이 63%, E4가 72%, JH 68%, AM-651 이 90%로 이들 중 가장 길항력이 높게 나타난 AM-651 을 최종 선발하여 실험에 사용하였다.
고추 역병균의 생장을 억제시키는 길항미생물을 선발하기 위해 경북 북부지역의 고추재배지 토양과 자연 경작지 토양을 균원 시료로 사용하였으며, 채취한 시료 1 g을 9 mLg 멸균생리식 염수가 담긴 test tube에 현탁하여, 현탁액 100 piL 씩 분취하여 LB및 NA 배지 도말한 다음 30℃에서 2일간 배양하여 미생물을 분리하였다. 순수 분리한 균주들 중 고추 역병을 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 각 균주의 배양 상등액을 PDA 배지에 접종한 후 중앙에 V8 쥬스배지에 전배양한 고추역병의 균총(5 mm)을 각각 접종하여 28℃에서 5일간 배양 후 고추역병의 균사생장을 억제시키는균주를 최종 선발하였다.
이론/모형
Phylogenetic tree for strain AM-651 and related organfems based on 16S rDNA sequences. The distances were calculated usingthe neighbor-joining method. The numbers at the branch points are bootstrap values (based on 1000 samplings), and only values greater than 50% are shown.
항생물질 생산에 대한 온도에 영향을 조사하기 위해 25-40℃에서 4일 동안 배양하면서 경시적으로 상등액을 회수하여 diffusion method에 따라 항진균 활성을 조사하였다.
성능/효과
651을 LB 배지를 이용하여 3(TC에서 순수 배양한 후 생화학적 특성을 조사한 결과 내생포자를 형성하는 gram positive 의 간균으로, catalase tes에서는 양성으로 조사되었다. 16S rDNA sequencing 결과 Bacillus sp와 99%의 상동성을 나타냈다(Fig. 1). 따라서 이 균주를 최종적으로 Bacillus sp.
AM-651은 고추 역병균에 가장 높은 억제 활성을 나타냄과 동시에 여러가지 식물성 병원균에 대한 넓은 항진균 spectrum의 활성이 미생물 제제로 Bacillus sp. AM- 651을 이용할 수 있을 것이라는 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 실용적 인 친환경농자재 인 생물학적 방제제로의 개발을 위해 포장실험과 제형개발 등의 다양한 조사를 진행하여야 할 것이다.
4와 같이 30℃에서 배양한Bacs sp. AM-651 균주가 가장 항진균 활성이 높게 나타났으며, 25~40℃까지 배양하였을 경우에도 항진균 활성효과를 보이는 것으로 조사되어졌다.
이러한 결과는 Bacillus sp. AM-651 배양액을 토양에 살포하였을 때 여름철 토양의 온도 변화에도 안정하여 현장 살포 후에도 방제효과는 우수할 것으로 사료된다.
Bacillus sp. AM-651 배양액의 온도에 대한 안정성을 조사한 결과는 Fig. 5에서 같이 30℃에서도 가장 높은 안정성을 보였으며 , 저온과 고온에서도 매우 안정적으로 조사되었으며, 특히 고압 열처리한 배양액에서도 50% 이상의 활성을 보였다. 이러한 결과는 Bacillus sp.
Bacillus sp. AM-651 이 갖는 항진균 활성물질 생산을 위한 최적 pH 및 온도를 조사하기 위해 최적조건의 배지를 130rpm에서 각각의 온도와 pH에서 조사한 결과 Fig. 4에서와 같이 강산성인 pH3과 강알카리성 pH 11에서는 각각 8.00 mm의 항진균활성을 보였으며, 가장 높은 활성을 보인 최적 pH는 7로 방제가가 40.23 nun의 넓은 inhibition zone 을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Lim(2000) 이 보고한 pH가 산성인 조건에서 활성 물질 생산이 불안정하다는 결과와는 달리 본 균주 Bacillus sp.
Bacillus sp. AM-651의 최적 pH와 최적 온도 배양 시간에 따른 생장 및 항진균 활성물질의 생산특성을 조사하기 위하여 Davis 최소 배지를 변형한 배지를 이용하여 130rpm, 30℃에서 배양한 결과 Fig. 2와 같이 배양 24시간에 가장 높은 O.D. 3.0으로 나타났으며, 최대 증식기때에 항진균 활성은 20.04 mm로 나타났으며, 고추역병에 대한 항진균 활성은 가장 우수했던 배양시간은 배양후 4&시간에 가장 높은 30.24 mm로 나타났다. 이러한 결과로 보아 Bacillus sp.
AM-651이 생산하는 항진균 물질을 고추 역병외 다른 식물병원균에 대한 방제 활성을 조사하기 위하여, 총 10종의 식물병원균에 대해 항진균 활성을 고추 역병균 실험과 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 A. malier P. infensie\ 대한 항진균 활성은 비교적 낮은 편이었으나, 이들을 제외한 C. gloeosporioides, B. dothidea, B. cinerea 그리고 E graminearume 대하여 항진균 활성이 높았으며, 이러한 결과로 보아 길항세균 Bacillus sp. AM-651은 고추 역병균에 가장 높은 억제 활성을 나타냄과 동시에 여러가지 식물성 병원균에 대한 넓은 항진균 spectrum의 활성이 미생물 제제로 Bacillus sp.
의해 항진균 활성이 조사되었다. 그 중 탄소원으로 glucose, mannose 그리고 maltose는 탄소원으로 이용하였때항진균력이 우수하게 나타났으나, 항생물질 생산성과 경제성을 고려한다면 대량배양의 최적 탄소원으로 Table 1과 같이 74%의 항진균력을 나타낸 이ucose를 최적 탄소원으로 사용하였다.
AM-651 은 2차 대사산물에 의해 항진균 활성을 나타냄을 추정 할 수 있다. 길항세균의 항진균 활성은 Fig. 3과 같이 PDA 배지 상에서 대치배양을 실시하여 이루어졌으며, PDA배지 상에서 dear zonee 30.24 mn를 나타났으며, 이는 Lee 등의 결과[12] 보다 30% 가량 더 높은 것으로 조사되었다.
다양한 질소원에 상당히 의존적으로 항진균 활성을 보였으며, 특히 (NHeHPCU%가 첨가된 경우 항진균능이 80%로 가장 높게 나타났다. 또한, 무기질소원보다는 유기질소원에서 길항세균의 성장과 항진균 활성물질 생산능이 높게 나타났는데 이러한 결과는 Bacillus sp.
후속연구
5%의 항진균력을보였으며 , 이러한 결과로 보아 Bacillus sp. AM-651 을 현장에 미생물 제제로 살포하였을 때 이미 토양에 잔재하던 비료 성분을 이용하여 더 높은 항진균 물질을 생산하여 방제 효과가 더 효과적일 수 있을 것으로 사료된다.
AM- 651을 이용할 수 있을 것이라는 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 실용적 인 친환경농자재 인 생물학적 방제제로의 개발을 위해 포장실험과 제형개발 등의 다양한 조사를 진행하여야 할 것이다.
5에서 보는 바와 같이 배양액의 고추역병에 대한 억제력이 pH3~ll까지 넓은 범위에서 나타났다. 이러한 결과는 우리나라 토양이 산성의 특성을 가지며, 화학농약과 비료의 사용으로 더욱 산성화될 수 있는 점을 고려한다면 산성에서 안정한 본 분리균주의 항진균 활성은 현장 적용시 중요한 인자로 작용할 것으로 사료된다. Bacillus sp.
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