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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 아보카도의 기능성 소재로서의 이용가능성을 알아보기 위해 아보카도의 과육, 씨, 껍질을 각각 분리한 후 추출물을 제조하여 이들 각각의 항산화 효과를 연구하였고, 인간유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 항암활성을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 아보카도의 기능성 소재로서의 이용가능성을 알아보기 위해, 아보카도의 과육, 씨, 껍질을 각각 분리한 후 추출물을 제조하여 이들 각각의 항산화 효과를 연구하였고, 인간유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 항암활성을 살펴보았다. 아보카도 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 총 폴리페놀 함량은 아보카도 과육과 씨 및 껍질 추출물이 각각 13.
제안 방법
- 4℃에서 16,609×g로 10분간 원심 분리하여 그 상등액으로 BCA kit를 사용 하여 단백질을 정량하여 western blotting법을 이용하여 apoptosis 유도 효과를 관찰하였다.
- 0)를 이용하여 resuspension 한 후 65℃에서 5분 동안 방치시켰다. Phenol/ chloroform(1:1)과 chloroform/isoamyl alcohol(1:24)을 이용 하여 DNA를 추출하였고, 이에 95% ethanol을 첨가하고 원심 분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한 후 RNase 를 첨가하여 10분 동안 반응시킨 후 RNA를 완전히 가수 분해시키고 2% agarose gel에 DNA를 전기 영동하여 DNA ladder를 확인하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(33)을 응용하였다. 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡 광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 tannic acid의 최종농도가 5, 25, 50 μg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
- 본 실험에서는 아보카도 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물과 trolox, BHA, ascorbic acid의 ABTS+• 소거활성을 비교 측정하였다(Table 3).
- 시료의 free radical 소거활성은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 μL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200 μL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 아보카도 과육, 씨, 껍질 추출물에 의한 apoptosis를 확인하기 위하여 씨와 껍질 추출물을 농도 별로 처리하고 DNA 분절 현상을 조사하였다. 그 결과 과육 추출물의 경우, DNA 분절화에 영향을 미치지 않았으며(data not shown), 씨 추출물 100, 200 μg/mL의 농도에서 DNA 분절 현상이 나타났고, 껍질 추출물에서는 10 ug/mL의 농도에서부터 농도의존적 으로 DNA 분절 현상에 영향을 주는 것으로 나타났다(Fig.
- 아보카도의 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 tannic acid, quercetin을 기준물질로 하여 측정하였다(Table 1). 그 결과, 아보카도 과육 추출물의 총 폴리페놀 함량은 13.
- 희석된 용액 990 μL에 sample 10 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였으며 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 아보카도는 일반 대형마트에서 구매한 것으로 깨끗이 수세하여 과육과 씨, 껍질로 각각 분리한후 분쇄기로 각각 분쇄하여 80% 메탄올로 3회 반복 추출하였고 추출액은 여과지(Whatman No.3, England)를 사용하여 여과하고 rotary vacuum evaporator(BUCHI Rotavapor R-205, Switzerland)로 감압농축한 후 동결 건조하여 apoptosis 유도와 항산화 활성검정에 사용하였다. 이 때 각 추출물의 수율은 과육 4%, 씨 11%, 껍질 7.
- 이 실험에 사용된 MDA-MB-231 cell은 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. MDA-MB-231 cell은 RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640과 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic가 첨가된 배지에서 37℃의 5% CO2배양기에서 2～3일에 한 번씩 계대 배양하였다.
이론/모형
- ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+• cation decolorization assay방법(35)에 의하여 시행하였다.
- 시료중의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등(34) 의 방법을 이용하여 측정하였다. 각 시료 추출물 0.
- 아보카도 과육, 씨, 껍질 추출물이 apoptosis를 유도하는지 관찰하기 위하여 western blot법을 시행하였다. 먼저 아보카도 과육 추출물을 처리한 결과 caspase 단백질에 아무런 영향을 미치지 않았으며(data not shown), 아보카도 씨 추출물을 처리한 실험군에서 200 μg/mL의 농도에서 caspase-3, -7의 단백질의 발현이 증가되는 것을 보였고, 아울러 세포사멸 기전의 최종 단계인 PARP 단백질의 발현을 관찰한 결과, caspase 결과와 유사하게 200 μg/mL의 농도에서 cleaved PARP가 증가되는 경향을 보였다(Fig.
- 아보카도 추출물에 의해 apoptotic DNA fragmentation이 일어나는지 알아보기 위해 Herrmann 등(36)의 방법에 따라 MDA-MB-231 세포주를 6-well plate에 1×106 cells/5 mL 로 분주하고 아보카도 추출물을 처리한 후 24시간 배양하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(33)을 응용하였다. 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡 광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
성능/효과
- 10 μg/mL 의 농도에서 아보카도 씨가 70%, 5 μg/mL에서 껍질이 60%정도의 소거능을 보였고, BHA와 ascorbic acid(10 μg/mL) 에서 96% 정도의 항산화능을 보였다.
- ABTS+• 소거활성법에서 표준물질로 사용되는 trolox는 15 μM에서 63% 정도의 소거활성능을보였고, BHA와 ascorbic acid는 10 μg/mL에서 99% 이상의 우수한 소거활성능을 보였다.
- 각 시료의 DPPH 소거활성을 농도별로 측정한 결과, 아보카도 껍질 추출물이 5 μg/ mL에서 60.4%로 껍질 추출물이 가장 우수한 항산화능을보였다.
- 이는 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있을 것으로 생각 되며 Lee 등(48)은 머위로부터 U937 cell에서 apoptosis의 유도를 보고한 바 있다. 결과적으로 아보카도 씨와 껍질 추출물은 apoptosis를 유도하는 유전자인 caspase에 영향을 미치는 것으로 보이며, 순차적으로 DNA 분절을 활성화시켜 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 apoptosis 의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 앞으로 이들 활성성분들의 규명과 동물실험을 통해 씨와 껍질에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 아보카도 씨와 껍질의 유용성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이는 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있을 것으로 생각 되며 Lee 등(48)은 머위로부터 U937 cell에서 apoptosis의 유도를 보고한 바 있다. 결과적으로 아보카도 씨와 껍질 추출물은 apoptosis를 유도하는 유전자인 caspase에 영향을 미치는 것으로 보이며, 순차적으로 DNA 분절을 활성화시켜 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 apoptosis 의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 앞으로 이들 활성성분들의 규명과 동물실험을 통해 씨와 껍질에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 아보카도 씨와 껍질의 유용성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 국내산 식품 중 대추의 폴리페놀 함량을 살펴보면 대추과육 추출물은 98.83 μg/mg, 대추씨 추출물은 138.99 μg/mg으로 대추과육보다는 대추씨에서 비교적 많은 폴리페놀 함량을 보였고(37), 홍화씨, 순 및 꽃이 각각 12.34, 5.10, 8.05%를 함유하여 씨에서 높은 폴리페놀 함량을 보여(38) 아보카도와 유사한 경향이었다.
- 그 결과 과육 추출물의 경우, DNA 분절화에 영향을 미치지 않았으며(data not shown), 씨 추출물 100, 200 μg/mL의 농도에서 DNA 분절 현상이 나타났고, 껍질 추출물에서는 10 ug/mL의 농도에서부터 농도의존적 으로 DNA 분절 현상에 영향을 주는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 그 결과, 아보카도 과육 추출물의 총 폴리페놀 함량은 13.89 μg/mg, 씨 추출물은 137.2 μg/mg, 껍질 추출물은 223.45 μg/mg으로 나타나, 아보카도 과육에 비해 씨와 껍질에서 높은 폴리페놀 함량을 보였다.
- 05%를 함유하여 씨에서 높은 폴리페놀 함량을 보여(38) 아보카도와 유사한 경향이었다. 대추나 홍화와 같이 아보카도 추출물 또한 과육, 씨, 껍질 추출물 중에서 씨와 껍질 추출물이 과육에 비해 상당히 많은 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 폴리페놀 화합물이나 플라보노이드류는 여러 가지 식품에 분포되어 있으며 천연항산화제로 작용한다는 보고가 많이 알려져 있다(39,40).
- 또한 ABTSㆍ+ 소거활성을 trolox, BHA, ascorbic acid와 비교하여 측정한 결과, 아보카도 껍질 추출물은 10μg/mL에서 60.4%의 소거활성을 보였고, DPPH 소거활성과동일하게 껍질 추출물에서 가장 우수한 소거활성능을 보였다.
- 또한 DNA 분절 현상을 관찰한 결과 씨 추출물에서는 100, 200 μg/mL 농도에서, 껍질 추출물에서 10, 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 DNA 분절화 현상이 일어난 것을 관찰하였다.
- 먼저 아보카도 과육 추출물을 처리한 결과 caspase 단백질에 아무런 영향을 미치지 않았으며(data not shown), 아보카도 씨 추출물을 처리한 실험군에서 200 μg/mL의 농도에서 caspase-3, -7의 단백질의 발현이 증가되는 것을 보였고, 아울러 세포사멸 기전의 최종 단계인 PARP 단백질의 발현을 관찰한 결과, caspase 결과와 유사하게 200 μg/mL의 농도에서 cleaved PARP가 증가되는 경향을 보였다(Fig. 1).
- 아보카도 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 총 폴리페놀 함량은 아보카도 과육과 씨 및 껍질 추출물이 각각 13.89, 137.2, 223.45 μg/mg으로 아보카도 껍질 추출물에서 가장 높게 나타났고, 총 플라보노이드 함량에서도 각각 4.03, 5.69, 13.6 μg/mg으로 폴리페놀 함량보다는 다소 낮게 나타났지만 총 플라보노이드 함량 역시 껍질에서 가장 높게 나타났다.
- 아보카도 씨, 껍질 추출물이 apoptosis를 유도하는지를 관찰한 결과 씨, 껍질 추출물 모두 caspase-3, PARP 단백질 들의 발현을 유도하였고, 이들은 모두 200 μg/mL의 농도에서 가장 높게 발현되는 것을 확인하였다.
- 2 μg/mL로 보고 하였다. 이들의 결과와 비교하여 보았을 때 아보카도 씨와 껍질 추출물의 DPPH 소거활성능이 비교적 높은 것으로 확인되었다.
- 총 플라보노이드 함량은 아보카도 과육과씨, 껍질 추출물에서 각각 4.03, 5.69, 13.6 μg/mg으로 아보카도 껍질 추출물에서 가장 높은 함량을 보였다.
후속연구
- 결과적으로 아보카도 씨와 껍질 추출물은 apoptosis를 유도하는 유전자인 caspase에 영향을 미치는 것으로 보이며, 순차적으로 DNA 분절을 활성화시켜 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 apoptosis 의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 앞으로 이들 활성성분들의 규명과 동물실험을 통해 씨와 껍질에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 아보카도 씨와 껍질의 유용성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 11 μg/mL)과 유사한 값을 보였다. 특히 아보카도 껍질 추출물의 RC50 값은 단일물질인 BHA와 ascorbic acid의 RC50 값과 거의 일치하므로 이를 분리․정제하여 유용 물질을 찾아낸다면 더욱 우수한 항산화능을 보일 것으로 생각된다. Yang 등(43)은 단삼 메탄올 추출물의 RC50 값을 18.
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