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문제 정의
- 백색부후균의 하나인 아교버섯은 국내의 삼림에 흔히 자생하는 균류로서 프탈레이트 류에 대한 분해능이 우수하 였고, 프탈레이트가 포함된 배지에서 laccase의 활성이 크게 증가 되었다(13). 저자들은 아교버섯의 laccase cDNA를 확보하였고, 이를 발현벡터로 구축하여 다시 아교버섯에 도입함으로써 분해능이 향상된 형질전환체를 확보하였으므로 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- EDC들이 포함된 배지에서 laccase의 활성 및 발현을 분석하고 자 배양 5일 후 상등액의 효소활성을 o-tolidine을 발색기질로 사용하여 분석하였다(13). 효소활성은 이 조건에서 1분당 ODe 0.
- Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자의 promoter (gprf)를 가진 pBARGPEl에 아교버섯 laccase cDNA를 연결하여 발현벡터를 구축하고 이를 아교버섯 일핵체에 도입하여 형질전 환체를 확보하였다. 형질전환체 70여 개 중 PDA 배지에서 laccase 활성이 증가된 균주들을 액체배양하여 상등액에 존재하는 효소활성을 분석한 결과 야생형 균주(recipient strain)에 비하여 높은 효소활성을 보이는 형질전환체를 확보하게 되었다(Fig.
- 0 ml/min이었 다. 각 EDC의 농도는 표준시약을 동일한 조건으로 분석하여 결 정하였다. 배양상등액에 잔존하는 에스트로겐 활성은 Shizuoka 대학의 Nishida 교수로부터 분양받은 yeast two hybrid system을 이용하여 분석하였다(12).
- 2). 내분비장애 물질의 분해에 대한 분석을 배양 5일 후 분석한 것과 달리 에스 트로겐 활성의 감소를 배양 24시간까지 분석한 것은 original compound의 감소/분해에 비하여 에스트로겐 활성의 감소가 더 빠르게 진행되기 때문에 야생형 균주와 형질전환체의 정확한 활 성비교를 위하여 빠른 시간대의 시료를 대상으로 분석하였다. 이 과정에서 laccase는 BBP 및 BR\의 첨가에 의하여 더 많은 활성 증가를 보였으며, laccase-specific RT-PCR에 의한 발현량의 분석 에서도 BBP 첨가 시 가장 높은 발현을 보였다(Fig.
- -2 균체를 PDB에 접종하여 5일 동안 30℃ 에서 진탕 배양하였다. 배양된 균체를 Waring blender로 1초씩 5 회 분쇄하고 균체를 최소배지(100 ml)에 부피 비율로 10% 되도 록 접종하였다. 이때 BBP (300ng/ml), BPA (100 ng/ml), DEP (400 gg/ml) 및 NP (20pig/ml)를 각각 더하여 균체와 함께 배양 하였다.
- 아교버섯 laccase cDNA에 BamW linkers- 연결하고 이를 발 현벡터인 pBARGPEl의 BamHl 위치에 삽입함으로써 laccase 발 현벡터(pBARiqCl)를 구축하였다. 아교버섯 일핵체를 최소배지 에서 진탕배양 후 김 등(1)의 방법에 따라 형질전환 실험을 수행하였다.
- 백색부후균의 하나인 Coriolopsis polyzonal 세포외 효소를 이용한 내분비장애물질의 분해가 보고되었으며, 이때 laccase mediator 인 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)에 의하여 분해가 증가되었고 이를 근거로 laccase의 관 련성이 보고되었다(2). 아교버섯의 경우 BBP와 DEP를 첨가한 배지에서 laccase 활성과 발현량이 증가되었기 때문에(13) 항시발 현 gpd promoters- 사용하여 laccase가 균 생장기에도 발현되는 형질전환체를 확보하여 이들의 분해능을 분석하였다. Laccase 활 성이 증가된 형질전환체가 사용된 4가지 내분비장애물질에 대하여 모두 우수한 분해결과를 보이지는 않았으나 야생형 균주에 비하여 더 빠른 분해 및 에스트로겐 활성의 감소를 보였으므로, 이 결과는 내분비장애물질의 분해능을 향상시킬 수 있는 새로운 방법을 제시한 것이라고 판단된다.
- 배양액 및 균체에 잔존하는 EDC들의 농도를 다음과 같이 분 석하였다. 접종 5일 후 균체를 포함하는 배양액을 n-hexane과 ethylacetate로 차례로 추출하고 24, 900Xg에서 20분간 원심분리하여 유기용매층에 있는 EDC의 농도를 HPLC (Waters, 미국)를 사용하고 Gemini 5 um C6-phenyl 150x4.6 mm column (Pheno- menex, 미국)을 이용하여 분석하였다. 용출용매는 acetonitrile과 H2O (9:1)의 혼합용액을 사용하였고, 용출속도는 1.
- 형질전환체 중 laccase 활성이 가장 높은 TF2-1 을 대상으로 내 분비장애물질의 분해 및 에스트로겐활성의 감소, 그리고 이때 laccase의 활성 및 발현량을 분석하였다. 내분비장애물질 4가지를 각각 최소배지에 더하고 배양 5일 후 HPLC를 사용하여 잔존량 을 분석한 결과 DEP와 NP의 경우 분해가 느리게 진행되었으나 BBP와 BPA의 경우 빠르게 분해되었으며, 이들 4가지 물질 모두 야생형 균주보다 형질전환체 TF2-1에서 빠른 분해를 보였다(Fig.
- 아교버섯 일핵체를 최소배지 에서 진탕배양 후 김 등(1)의 방법에 따라 형질전환 실험을 수행하였다. 형질전환체는 선택표지인 항생물질 phosphinothricin 저 항성 유전자를 사용하고자 phosphinothricin (50 Rg/ml)이 포 함된 최소배지에서 선발하였으며 , 선발된 형질전환체들은 phos- phinothricin (lOOgg/mirl 포함된 배지에서 생장을 재차 확인하였다. 형질전환체에 laccase가 발현벡터가 안정되게 삽입되었음을 증 명하기 위하여 형질전환체의 염색체를 분리하고 발현벡터에 존재하는 trpC promoter의 일부와 bar 유전자의 일부를 각각 forward primer 및 reverse primer로 사용하는 PCR을 수행하였다(14).
- 형질전환체는 선택표지인 항생물질 phosphinothricin 저 항성 유전자를 사용하고자 phosphinothricin (50 Rg/ml)이 포 함된 최소배지에서 선발하였으며 , 선발된 형질전환체들은 phos- phinothricin (lOOgg/mirl 포함된 배지에서 생장을 재차 확인하였다. 형질전환체에 laccase가 발현벡터가 안정되게 삽입되었음을 증 명하기 위하여 형질전환체의 염색체를 분리하고 발현벡터에 존재하는 trpC promoter의 일부와 bar 유전자의 일부를 각각 forward primer 및 reverse primer로 사용하는 PCR을 수행하였다(14).
- EDC들이 포함된 배지에서 laccase의 활성 및 발현을 분석하고 자 배양 5일 후 상등액의 효소활성을 o-tolidine을 발색기질로 사용하여 분석하였다(13). 효소활성은 이 조건에서 1분당 ODe 0.1의 상승을 보이는 효소 양을 1 unit로 정하였다. 유전자의 발 현을 분석하고자 균체를 회수하고 Yeo 등(13)의 방법에 따라 total RNA를 분리하였고, 각 배양균체의 RNA를 대상으로 laccase 유전자 서열에 근거한 PCR primer (3)를 사용하여 RT- PCR을 수행하고 증폭된 DNA는 전기영동 방법으로 분리하여 분 석하였다.
대상 데이터
- 각 EDC의 농도는 표준시약을 동일한 조건으로 분석하여 결 정하였다. 배양상등액에 잔존하는 에스트로겐 활성은 Shizuoka 대학의 Nishida 교수로부터 분양받은 yeast two hybrid system을 이용하여 분석하였다(12).
- -2를 완전배지인 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco)에 배양하여 균체를 확보하였고 액체배지는 PDB (Potato Dextrose Broth, Dicfco) 또는 최소배지 (7)를 사용하였으며, 기타 배양조건은 Yeo등(13)의 방법을 따랐다. 실험에 사용한 benzylbutylphthalate (BBP), bisphenol A diethylphthalate (DEP) 및 nonylphenol (NP)은 Aldrich로부터 구입하였다.
- 6 mm column (Pheno- menex, 미국)을 이용하여 분석하였다. 용출용매는 acetonitrile과 H2O (9:1)의 혼합용액을 사용하였고, 용출속도는 1.0 ml/min이었 다. 각 EDC의 농도는 표준시약을 동일한 조건으로 분석하여 결 정하였다.
이론/모형
- 아교버섯 이핵체 균사로부터 원형질체 분리방법(14)을 사용하여 분리한 일핵체 PtO5-2를 완전배지인 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco)에 배양하여 균체를 확보하였고 액체배지는 PDB (Potato Dextrose Broth, Dicfco) 또는 최소배지 (7)를 사용하였으며, 기타 배양조건은 Yeo등(13)의 방법을 따랐다. 실험에 사용한 benzylbutylphthalate (BBP), bisphenol A diethylphthalate (DEP) 및 nonylphenol (NP)은 Aldrich로부터 구입하였다.
- 아교버섯 laccase cDNA에 BamW linkers- 연결하고 이를 발 현벡터인 pBARGPEl의 BamHl 위치에 삽입함으로써 laccase 발 현벡터(pBARiqCl)를 구축하였다. 아교버섯 일핵체를 최소배지 에서 진탕배양 후 김 등(1)의 방법에 따라 형질전환 실험을 수행하였다. 형질전환체는 선택표지인 항생물질 phosphinothricin 저 항성 유전자를 사용하고자 phosphinothricin (50 Rg/ml)이 포 함된 최소배지에서 선발하였으며 , 선발된 형질전환체들은 phos- phinothricin (lOOgg/mirl 포함된 배지에서 생장을 재차 확인하였다.
- 1의 상승을 보이는 효소 양을 1 unit로 정하였다. 유전자의 발 현을 분석하고자 균체를 회수하고 Yeo 등(13)의 방법에 따라 total RNA를 분리하였고, 각 배양균체의 RNA를 대상으로 laccase 유전자 서열에 근거한 PCR primer (3)를 사용하여 RT- PCR을 수행하고 증폭된 DNA는 전기영동 방법으로 분리하여 분 석하였다.
성능/효과
- 아교버섯의 경우 BBP와 DEP를 첨가한 배지에서 laccase 활성과 발현량이 증가되었기 때문에(13) 항시발 현 gpd promoters- 사용하여 laccase가 균 생장기에도 발현되는 형질전환체를 확보하여 이들의 분해능을 분석하였다. Laccase 활 성이 증가된 형질전환체가 사용된 4가지 내분비장애물질에 대하여 모두 우수한 분해결과를 보이지는 않았으나 야생형 균주에 비하여 더 빠른 분해 및 에스트로겐 활성의 감소를 보였으므로, 이 결과는 내분비장애물질의 분해능을 향상시킬 수 있는 새로운 방법을 제시한 것이라고 판단된다.
- 형질전환체 중 laccase 활성이 가장 높은 TF2-1 을 대상으로 내 분비장애물질의 분해 및 에스트로겐활성의 감소, 그리고 이때 laccase의 활성 및 발현량을 분석하였다. 내분비장애물질 4가지를 각각 최소배지에 더하고 배양 5일 후 HPLC를 사용하여 잔존량 을 분석한 결과 DEP와 NP의 경우 분해가 느리게 진행되었으나 BBP와 BPA의 경우 빠르게 분해되었으며, 이들 4가지 물질 모두 야생형 균주보다 형질전환체 TF2-1에서 빠른 분해를 보였다(Fig. 2). 내분비장애물질이 보이는 가장 큰 피해인 에스트로겐 활성은 BBP와 NP가 강하기 때문에 이들의 에스트로겐 활성감소를 분석한 결과 TF2-1에서 빠른 활성감소를 보였다(Fig.
- 내분비장애 물질의 분해에 대한 분석을 배양 5일 후 분석한 것과 달리 에스 트로겐 활성의 감소를 배양 24시간까지 분석한 것은 original compound의 감소/분해에 비하여 에스트로겐 활성의 감소가 더 빠르게 진행되기 때문에 야생형 균주와 형질전환체의 정확한 활 성비교를 위하여 빠른 시간대의 시료를 대상으로 분석하였다. 이 과정에서 laccase는 BBP 및 BR\의 첨가에 의하여 더 많은 활성 증가를 보였으며, laccase-specific RT-PCR에 의한 발현량의 분석 에서도 BBP 첨가 시 가장 높은 발현을 보였다(Fig. 3).
- 1). 이와 같이 효소활성이 증가된 균주들의 염색체에 laccase 발 현벡터가 존재함을 증명하기 위하여 trpC/bar-specific PCR을 수행한 결과 형질전환체의 염색체에서 예상되는 길이의 유전자가 증폭되어 확인되었다(Fig. 1). 구름버섯의 MnP 유전자를 pBARGPEl 벡터와 재조합하고 이를 구름버섯에 도입한 결과 MnP 활성이 증가된 형질전환체가 보고되었으며(14), 이 실험에 서도 laccase 활성이 증가된 형질전환체를 다수 확보할 수 있었다.
- Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자의 promoter (gprf)를 가진 pBARGPEl에 아교버섯 laccase cDNA를 연결하여 발현벡터를 구축하고 이를 아교버섯 일핵체에 도입하여 형질전 환체를 확보하였다. 형질전환체 70여 개 중 PDA 배지에서 laccase 활성이 증가된 균주들을 액체배양하여 상등액에 존재하는 효소활성을 분석한 결과 야생형 균주(recipient strain)에 비하여 높은 효소활성을 보이는 형질전환체를 확보하게 되었다(Fig. 1). 이와 같이 효소활성이 증가된 균주들의 염색체에 laccase 발 현벡터가 존재함을 증명하기 위하여 trpC/bar-specific PCR을 수행한 결과 형질전환체의 염색체에서 예상되는 길이의 유전자가 증폭되어 확인되었다(Fig.
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