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제안 방법
- 미생물의 고정화를 위해서는 담체의 조건을 충족시키면서 균체의 고정화 담체로 많이 이용하고 있는 sodium alginate를 사용하였다. 고정화된 미생물을 이용한 다양한 반응조건 (pH, 온도, 담체량)에서 casein phosphopeptides 의 생산수율을 관찰하여 연속반응에 의한 CPP 생산 가능성을 확인하였다.
- 6에서 침전시켰다. 상등액을 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 CaCb를 상등액에 대해 2%, ethanol을 50% 가하여 침전시켰으며, 침전물을 건조하여 생산된 CPP를 회수하였다.
- 그리고 균체고정화시 균체만을 이용할 경우에는 5, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 후 멸균된 증류수로 3회 세척하여 담체에 고정화시켜 사용하였고, 배양액 자체를 사용할 경우 배양액과 담체를 혼합하여 사용하였다. 균체고정화를 위해 사용한 혼합액의 alginate 농도는 최종적으로 3% (w/v)가 되도록 조절한 후 4% (w/v) CaCl2 - 2H2O 용액에 사출시켜 직경 약 3mm의 Ca-alginate bead를 제조하였다.
- CPP 생산조건을 설정하기 위하여 원료 기질인 sodium caseinate에 상기의 고정화된 Ca-alginate bead를 가하여 반응시킨 후, 이 반응액을 KXTC에서 10분간 불활성화 시킨 다음 효소 분해물을 pH 4.6에서 등전침전 시켰다. 상등액을 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, Ca Cb를 상등액에 대하여 2%, ethanol을 반응액 최종농도의 50% 가하여 침전시켰으며, 침전물을 건조하여 CPP를 제조하였다.
- 6에서 등전침전 시켰다. 상등액을 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, Ca Cb를 상등액에 대하여 2%, ethanol을 반응액 최종농도의 50% 가하여 침전시켰으며, 침전물을 건조하여 CPP를 제조하였다. Batch type반응기에 의한 CPP 생산
- Batch type반응기에 의한 CPP 생산은 삼각플라스크를 사용하여 고정화방법 및 bead 사용량, 반응온도, 기질의 pH, 기질 농도 등의 여러 조건에서 반응시켜 반응시간에 따른 CPP의 양을 측정하여 반응 최적 조건을 확립하였다.
- Continuous type반응기에 의한 CPP 생산은 고정화 균체를 충진한 반응기에 원료기질을 투입하여 반응초기에 회분식으로 그리고 측정된 최적조건에 따른 반응시간에 도달한 후부터는 연속반응을 실시하였다.
- CPP 생성량을 확인하기 위하여 효소반응액을 pH 4.6으로 등 전 침전하고 원심분리하여 CPP를 회수하였다. 단백질 정량법으로 CPP의 생성량을 확인하였으며 단백질은 Lowry등 (9)의 방법을 응용하여 CPP를 표준물질로 하여 정량하였다.
- 6으로 등 전 침전하고 원심분리하여 CPP를 회수하였다. 단백질 정량법으로 CPP의 생성량을 확인하였으며 단백질은 Lowry등 (9)의 방법을 응용하여 CPP를 표준물질로 하여 정량하였다. Reagent A는 증류수 100 血에 CuSO4 - 5瓦0를 0.
- Reagent C는 reagent 日를 1:50의 비율로 혼합하여 사용하였고, 실험하기 직전에 조제 하였다. CPP를 정량분석 하기 위하여 효소액 0.5 g에 reagent C를 2.5 业를 가하여 10분간 방치한 후 2배 희석한 Folin-Ciocalteu's phenol reagent 0.25 를 가하여 20분간 방치하였다. 660 nm에서 이 혼합액의 흡광도를 측정하였다.
- Streptococcus faecalis var. liquefaciense} 고정화된 bead를 1 g 취하여 멸균된 증류수로 2회 세척 하고 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)로 용해하여 담체 내의 균체를 Tryptic Soy Agar로 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 colony 수를 측정하여 생균수로 하였다.
- var. liquefacie焰의 배양액을 사용하여 제조한 CPP 의 분자량 분포를 알아보기 위하여 SDS-PAGE를 행하였다. 기질인 sodium caseinate용액, 생산물인 protease에 의해 분해된 crude CPP, 그리고 Ca-ethanol 침전법으로 회수한 CPP의 분자량 분포를 확인하였다.
- liquefacie焰의 배양액을 사용하여 제조한 CPP 의 분자량 분포를 알아보기 위하여 SDS-PAGE를 행하였다. 기질인 sodium caseinate용액, 생산물인 protease에 의해 분해된 crude CPP, 그리고 Ca-ethanol 침전법으로 회수한 CPP의 분자량 분포를 확인하였다. 그 결과 기질인 sodium caseinate 의 경우 분자량은 17, 000 이상이었으며, crude CPP의 분자량은 3, 000-17, 000 이었다.
- 담체를 이용하여 균체 고정화시 대수 증식기 말기의 균체만을 회수하여 담체에 고정화시키는 방법과 배양액을 담체와 혼합하여 고정화시키는 방법이 있는데, 두 가지 방법 (균체만을 회수하여 고정화, 배양액을 고정화)을 이용하여 고정화시킨 bead를 사용하여 기질과 반응한 후 CPP 생산수율을 비교하였다. 그 결과 균체만 회수하여 고정화시킨 것보다 배양액을 담체와 혼합하여 고정화시킨 것이 반응 초기부터 CPP의 생산수율이 월등히 많았다.
- 특히, 본 실험에서 사용한 균주가 생성하는 protease는 extracellular enzyme으로 균체회수 시 세척에 의해 미생물이 생산한 효소가 제거되고 균체만 회수되었기 때문으로 판단된다. 따라서 배양액을 이용한 고정화 방법을 이용하여 최적 반응조건을 조사 하였다.
- 고정화 균체를 이용하여 CPP를 생산할 때, bead의 사용량에 따른 CPP 생산수율을 비교하여 최적의 bead 사용량을 조사하였다. 반응 부피 100 皿당 bead 사용량을 10 g 및, 20 g, 30 g, 40 g 으로 바꾸어 주면서 반응시간에 따른 CPP의 생산수율을 비교하였다.
- 반응 부피 100 皿당 bead 사용량을 10 g 및, 20 g, 30 g, 40 g 으로 바꾸어 주면서 반응시간에 따른 CPP의 생산수율을 비교하였다. 기질대비 10% (10 g 담체 /100 ml 기질용액)와 20% 사용 시 생산량은 각각 18.
- 5A). 따라서 bioreactor 내의 bead 사용량은 기질량 대비 30% 정도가 CPP생산을 위한 최적 조건이었으므로 다음의 모든 실험은 기질량 대비 30%의 bead를 사용하여 실험을 수행하였다.
- 2). 따라서 CPP 생산을 위한 반응 온도를 45℃ 및 50℃, 55℃, 60℃로 바꾸어 주면서 고정화된 균체를 이용한 경우 반응온도에 따른 CPP의 생산수율을 조사하였다. 모든 온도에서 CPP의 생산수율이 반응 후 10시간까지는 꾸준히 증가하였으나 10 시간 이후부터는 서서히 감소하였다.
- 5B). 반응기질의 pH에 따른 protease의 활성을 알아보기 위하여 pH 6.0 및 pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0으로 반응기질의 pH를 조정하여 실험하였다. 그 결과 네 가지 경우 모두 CPP의 생산수율이 시간이 지남에 따라 증가하여 10시간 반응하였을 때 최대값을 나타냈으며 10시간 이후부터 서서히 감소하였다.
- 5C). 마지막으로 기질에 농도에 따른 CPP 생산수율을 확인하기 위하여 sodium caseinate 를 5% 및 10%, 15%, 20%로 하여 실험하였다. 그 결과 15% 와 20%의 경우에는 10%보다 낮은 수준이었고, 5%와 10%의 경우 CPP의 생산량에 대한 수율은 비슷한 수준을 나타냄을 확인하였다(Fig.
- 연속적인 CPP생산을 위하여 회분식 반응에 의해 설정된 반응 최적의 조건으로 연속식 반웅을 실시하였다. Working volume 200 mt의 반응기에 Streptococcus faecalis var.
대상 데이터
- liquejiiciens가 생성하는 효소를 이용하고자 전세포 고정화기법을 이용하였다. 미생물의 고정화를 위해서는 담체의 조건을 충족시키면서 균체의 고정화 담체로 많이 이용하고 있는 sodium alginate를 사용하였다. 고정화된 미생물을 이용한 다양한 반응조건 (pH, 온도, 담체량)에서 casein phosphopeptides 의 생산수율을 관찰하여 연속반응에 의한 CPP 생산 가능성을 확인하였다.
- 고정화에 사용된 균주는 상기의 냉동 보관한 균주를 Tryptic Soy Broth에 배양하여 대수증식 말기의 것을 사용하였다. 그리고 균체고정화시 균체만을 이용할 경우에는 5, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 후 멸균된 증류수로 3회 세척하여 담체에 고정화시켜 사용하였고, 배양액 자체를 사용할 경우 배양액과 담체를 혼합하여 사용하였다.
이론/모형
- 따라서 본 연구에서는 casein phosphopeptides (CPP) 생산을 목적으로 유산균의 일종인 Streptococcus faecalis var. liquejiiciens가 생성하는 효소를 이용하고자 전세포 고정화기법을 이용하였다. 미생물의 고정화를 위해서는 담체의 조건을 충족시키면서 균체의 고정화 담체로 많이 이용하고 있는 sodium alginate를 사용하였다.
- 생산된 CPP의 분자량 분포와 분자량 측정을 위하여 Swank 등 (16)의 방법에 따라 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 행하였다. Separating gel buffer로는 1% SDS, 1.
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