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문제 정의
- 돼지 MYL2, ADCYAP1R1 유전자의 다형성이 특정 품종 교배집단의 도체형질에 영향을 주는 것으로 알려져 있으나, 현재까지의 연구보고만으로는 우리나라의 현행 양돈산업에 직접 활용하는 데는 무리가 있어, MYL2와 ADCYAP1R1 유전자의 유전적 다형성을 비육 출하돈 집단에서 조사하고, 이들 유전자형이 우리나라의 돼지 등급판정체계에서 산출된 도체형질에 어느 정도 영향을 미치는지를 확인하기 위해 수행하였다.
제안 방법
- 돼지 MYL2와 ADCYAP1R1 유전자의 증폭을 위해 Xu 등(2007)과 Kollers 등(2006) 등이 보고 한 primer를 각각 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응은 10 × 반응완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.5 units Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)와 50-60 ng genomic DNA 용액 에 멸균한 탈이온수를 첨가하고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하였으며, MYL2 유전자 증폭은 94 에서 5분간 초기변성, 94 40초-6 4 40초-72 90초로 구성된 cycle을 35회, ADCYAP1R1은 94 30초-65 30초-72 30초 로 구성된 cycle을 30회 반복수 수행하였다. PCR 증폭 산물은 agarose gel 상에서 전기영동 법으로 확인한 후, 각각 Msp (MYL2)과 Hae (ADCYAP1R1) 제한효소로 제한절단하였다.
- 5 units Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)와 50-60 ng genomic DNA 용액 에 멸균한 탈이온수를 첨가하고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하였으며, MYL2 유전자 증폭은 94 에서 5분간 초기변성, 94 40초-6 4 40초-72 90초로 구성된 cycle을 35회, ADCYAP1R1은 94 30초-65 30초-72 30초 로 구성된 cycle을 30회 반복수 수행하였다. PCR 증폭 산물은 agarose gel 상에서 전기영동 법으로 확인한 후, 각각 Msp (MYL2)과 Hae (ADCYAP1R1) 제한효소로 제한절단하였다. 제 한효소 처리의 반응액 조성과 시간은 공급자의 실험방법을 따랐으며, 37 에서 overnight 반응 한 후 2% agarose gel상에서 전기영동 확인하였다.
- 분석하였다. 냉도체 판정 후 등심의 일부를 채취하여 DNA 분리에 이용하였다. DNA 분리는 Birren 등(1997)의 방법을 변형하여 수행하였다.
- 비육 출하돈 집단에서 MYL2 intron 5 A345G 와 ADCYAP1R1 intron 2 A337G에 대한 유전자형의 분포와 도체형질과의 연관관계를 분석하였다. 조사에 이용된 두 유전자 모두 3가지 유전자형이 모두 출현하였으며, 빈도는 각각 MYL2에서 AA 10.
- 비육돈에서 발견된 돼지 MYL2 유전자의 세 가지 유전자형을 기준으로 개체군을 다시 구분하여 도체형질간 비교를 수행하였다(Table 2). 조사된 도체형질들 중에서 도체중과 등 지방 두께에서 MYL2 intron 5 A345G 유전자형별 형질 성적이 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.
- 제 한효소 처리의 반응액 조성과 시간은 공급자의 실험방법을 따랐으며, 37 에서 overnight 반응 한 후 2% agarose gel상에서 전기영동 확인하였다. 유전자형의 결정은 기존의 보고를 따랐으 며, 서열의 다형성을 재확인하기 위해 동형접 합자로 확인된 시료들을 무작위로 3 시료씩 선 발하여 DNA sequencing에 이용하였다.
- 전체 비육돈에서 ADCYAP1R1 intron 2 A337G 의 유전자형은 AA, AG, GG 세 가지 모두 검출되었고, 발견된 세 가지 유전자형에 대한 도체 형질과의 연관분석을 수행하였다(Table 3). 도체 형질 중에서 ADCYAP1R1 유전자형에 따른 도체 성적의 평균 차를 나타낸 항목은 조직감과 수분 삼출 도로 확인되었다(p<0.
- 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer 를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000(Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, GenBank database 에 등록하였다(GenBank accession no. EU644082- EU644085).
- PCR 증폭 산물은 agarose gel 상에서 전기영동 법으로 확인한 후, 각각 Msp (MYL2)과 Hae (ADCYAP1R1) 제한효소로 제한절단하였다. 제 한효소 처리의 반응액 조성과 시간은 공급자의 실험방법을 따랐으며, 37 에서 overnight 반응 한 후 2% agarose gel상에서 전기영동 확인하였다. 유전자형의 결정은 기존의 보고를 따랐으 며, 서열의 다형성을 재확인하기 위해 동형접 합자로 확인된 시료들을 무작위로 3 시료씩 선 발하여 DNA sequencing에 이용하였다.
- 조사에 이용한 DNA 시료들 중에서 기존에 보고된 MYL2 intron 5 A345G와 ADCYAP1R1 intron 2 A337G의 유전자 서열을 최종 확인을 위해 각각의 유전자 PCR 산물에 대한 PCR- RFLP 시료 판독 후 동형접합자의 PCR 산물 3 시료씩을 선발하여 DNA sequencing을 수행하였다. 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer 를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000(Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, GenBank database 에 등록하였다(GenBank accession no.
- 추출액에 RNase를 처리한 후, phenol- chloroform을 이용하여 정제하고, ethanol 침전법으로 DNA를 회수하여 TE buffer에 용해하였다. 준비한 DNA 용액은 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer로 흡광도를 측정한 후 A260/ A280 1.8 이상인 DNA 용액들을 50-60 ng/ 로 희석하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 시료는 2006년 12월부터 2007년 7월까지 각기 다른 양돈농가에서 출하된 비육돈 중 제주도축산물등급판정소에서 냉 도체 등급판정 개체를 대상으로 20회에 걸쳐 수집하여 분석하였다. 냉도체 판정 후 등심의 일부를 채취하여 DNA 분리에 이용하였다.
- html), 각각의 QTL 영역에 대한 주요인 유전변이(causative genetic element)의 탐색을 위해 다양한 노력이 진행되고 있다. 본 연구에서 이용한 MYL2 유전자의 경우 근섬유의 구성요소로서 Ca2+/calmodulin-mediated 신호전달경로에 관여하며, 인간과 mouse에서 유전자의 돌연변이는 familial hypertrophic cardiomyopathy 등 심장과 골격근의 이상을 초래하기도 한다. (Sanbe 등, 1999; Szczesna 등, 2001; Roopnarine 2003; Szczesna-Cordary 등, 2005).
- 출하된 비육돈의 도체형질은 축산물등급판정소 제주지역본부에서 수집하였다. 도 체형질의 항목은 Table 2에 제시하였고, 도체형질 측정은 전문 등급판정사 2인이 각각 측정하였고, 동일 개체에서 다른 결과치를 나타낸 시료는 분석에서 제외하였다.
데이터처리
- 조사항목과 측정치는 비육돈 출하 당시 등급판정기준에 준하였으며, 육 량 등급은 통계분석에서 제외하였다. 조사된 도체 형질 측정치에 대한 MYL2, ADCYAP1R1 유전자형의 효과를 추정하기 위한 통계분석은 SAS ver 8.01 program package/PC(1999)의 GLM procedure 를 이용하였고, 통계모델은 성별, 유전자형을 포함하였다. 평균값의 차이는 Duncan’s multiple range test로 유전자형별 유의차 검정을 실시하였다.
- 01 program package/PC(1999)의 GLM procedure 를 이용하였고, 통계모델은 성별, 유전자형을 포함하였다. 평균값의 차이는 Duncan’s multiple range test로 유전자형별 유의차 검정을 실시하였다.
성능/효과
- 05). ADCYAP1R1 의 유전자형 중 GG 동형접합자형인 도체에서는 조직감이 다소 떨어지는 경향을 보였으며, AA 동형접합자의 수분삼출도가 다소 높은 수준을 나타내었으나(p<0.05), 도체중, 등 지방 두께, 근내지방, 육색, 근육분리도에는 유의차를 보이지 않았다(p>0.05).
- 2%로 확인되었다. MYL2 유전자형 중 G 대립인자를 보유한 돼지(-G)의 도체중과 등 지방 두께는 AA 동형접합자형을 보유한 도체보다 2.4kg 이상 더 무겁고, 1.3mm 이상 등 지방 두께가 더 두꺼운 경향을 보이고(p<0.05), 근내지방도, 육색, 조직감, 수분삼출도, 근육 분리도에서는 유의차를 보이지 않았다(p>0.05).
- 도체 형질 중에서 ADCYAP1R1 유전자형에 따른 도체 성적의 평균 차를 나타낸 항목은 조직감과 수분 삼출 도로 확인되었다(p<0.05). 반면, 도체 중, 등지방두께, 근내지방, 육색, 근육분리도 등은 유의 수준의 차이를 보이지 않았다(p>0.
- 05). 도체중의 경우 AA 동형접합자형인 경우가 AG 이형접합자형이나 GG 동형접합자형인 돼지에 비해 2.4kg 정도 가벼운 것으로 나타났으며, 등지방두께의 경우 AA 동형접합자형인 돼지들이 AG 이형접합자형이나 GG 동형접합 자형에 비해 등지방두께가 약 1.3mm 정도 얇은 것으로 확인되었다. 이는 결국 대립인자형 G의 존재가 돼지의 등지방 발달을 증가시켜 결과적으로 전체적인 도체중의 증가를 유도한 것으로 추정된다.
- SSC18에 위치한 ADCYAP1R1은 Berkshire× Yorkshire의 교배 집단에서 24시간 사후 등심의 육색과 관련된 QTL의 후보영역 내부에 해당되며(Ma lek 등, 2001), 근내지방의 축적에 의해 광 반사율이 높아지게 되는 요인일 것으로 추정되고 있다(Kollers 등, 2006). 본 연구 결과만을 놓고 보면 유전자형의 분포에 따라 GG 유전자형을 보유한 돼지의 등심의 육색이 더 밝게 나타나지만, AG 이형접합자형을 보유한 돼지들이 AA나 GG 동형접합자형들보다 더 진한 육색을 나타내고 있고, 육색의 성적간 유의차가 없는 것으로 조사되었다(p>0.05).
- 제주도 내 양돈농가에서 출하된 비육돈을 시료로 하여 MYL2, ADCYAP1R1 유전자의 다형성을 검출한 결과, 두 유전자 모두 다형현상을 나타내었다. MYL2(Fig.
- 이는 결국 대립인자형 G의 존재가 돼지의 등지방 발달을 증가시켜 결과적으로 전체적인 도체중의 증가를 유도한 것으로 추정된다. 조사된 도체형질 중 marbling score, 육색, 조직감, 수분삼출도, 근육분리도와는 유의적인 차이를 보이지 않았다(p>0.05). Xu 등 (2007)은 Large White×Meishan의 교배에서 생산된 F2 집단에서 본 연구에서 이용한 SNP와 동일한 MYL2 유전자형이 등심을 포함한 골격근의 24시간 사후 pH, 육색 등에 유전자형에 따른 유의적 차이를 나타내고(p<0.
- 2). 조사된 도체형질들 중에서 도체중과 등 지방 두께에서 MYL2 intron 5 A345G 유전자형별 형질 성적이 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05). 도체중의 경우 AA 동형접합자형인 경우가 AG 이형접합자형이나 GG 동형접합자형인 돼지에 비해 2.
- 조사에 이용된 두 유전자 모두 3가지 유전자형이 모두 출현하였으며, 빈도는 각각 MYL2에서 AA 10.6%, AG 45.6%, GG 43.8%, ADCYAP1R1에서 AA 60.5%, AG 34.6%, GG 22.2%로 확인되었다. MYL2 유전자형 중 G 대립인자를 보유한 돼지(-G)의 도체중과 등 지방 두께는 AA 동형접합자형을 보유한 도체보다 2.
후속연구
- 05). 돼지에서 MYL2 A345G 와 ADCYAP1R1 A337G의 유전자형이 비육 출하 돈의 도체형질에 어느 정도 영향을 주고 있으나, 유전자의 기능에 직접적인 영향을 줄 수 있는 염기변이의 탐색 등 다양한 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
- 돼지에서는 MYL2를 경위하는 신호전달경로는 잡종강세에 대한 분자경로의 후보로 간주되고 있다(Xu 등, 2005). 이러한 부분들에 대한 검증과 본 연구 결과에서 확인된 근내지방과 무관한 등지방과 도체 중에 대한 유전자형 분포의 유의적 차이는 돼지 MYL2 유전자의 기능에 대한 세밀한 연구의 필요성을 제시하고 있다.
- 이상의 결과들을 종합해 볼 때, MYL2 intron 5 A345G와 ADCYAP1R1 intron 2 A337G의 유전적 다형성이 돼지의 도체형질과 어느 정도의 연관이 있으나, 유전자의 기능에 해당하는 영역과의 연관이 낮고 유전자의 기능과는 다른 도체 형질과의 연관을 보여주고 있어, 향후 유전자의 분자 수준의 기능을 세포 내, 조직, 기관 사이의 상호작용에 대한 연구와 더불어 돼지의 다양한 품종에서 도체형질 중 유전자의 생물학적 기능과 관련해 단백질의 기능 또는 발현에 영향을 미칠 수 있는 exon이나 promoter 상의 유전변이 확인이 수반되어야 할 것으로 사료된다.
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