PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인된 국화 형질전환체는 저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BN115가 삽입된 A. tumefacience MP90을 국화잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다. 또한 저온에서의 상해정도 관찰에서도 수침상정도가 비형질전환체보다 경미하였다. 저온의 외부환경에 따른 국화잎의 기공모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, $25^{\circ}C$에서는 비형질전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, $15^{\circ}C$에서는 최대 +5.7 (평균+3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다 또한 Ion leakage test결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부환경에 안정적으로 적응하여 세포내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의 EC 농도 (ds/m)가 비형질전환체에 비해 $1.29{\sim}1.97$배 낮은 수치를 보였다.
PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인된 국화 형질전환체는 저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BN115가 삽입된 A. tumefacience MP90을 국화잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다. 또한 저온에서의 상해정도 관찰에서도 수침상정도가 비형질전환체보다 경미하였다. 저온의 외부환경에 따른 국화잎의 기공모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, $25^{\circ}C$에서는 비형질전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, $15^{\circ}C$에서는 최대 +5.7 (평균+3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다 또한 Ion leakage test결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부환경에 안정적으로 적응하여 세포내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의 EC 농도 (ds/m)가 비형질전환체에 비해 $1.29{\sim}1.97$배 낮은 수치를 보였다.
Previous studies on genetic transformation of chrysanthemum using cold regulated gene (BN115) have been conducted and the PCR and Real-Time PCR based method to determine the presence of the transferred cold regulated gene in the chrysanthemum was established. To check whether over-expression of BN11...
Previous studies on genetic transformation of chrysanthemum using cold regulated gene (BN115) have been conducted and the PCR and Real-Time PCR based method to determine the presence of the transferred cold regulated gene in the chrysanthemum was established. To check whether over-expression of BN115 gene in transgenic chrysanthemum will enhance their tolerance to cold stress, the transgenic chrysanthemum were grown under low temperature condition and several cold signalling including growth characteristics, stoma size and shape, SPAD value and ion leakage test were investigated. The transgenic chrysanthemum in the low temperature growth chamber grow much faster in term of the height, number and size of the leaves than those of wild-type plants and damage of transgenic plant caused by the low temperature was much less than that of wild-type plants. The stoma type and size of transgenic plant leaves grown at $5^{\circ}C$ were much similar to of wild-type plant cultured on $25^{\circ}C$ It has been found that SPAD value of transgenic plants was much higher than those of wild-type, but the EC density being lower under low temperature condition.
Previous studies on genetic transformation of chrysanthemum using cold regulated gene (BN115) have been conducted and the PCR and Real-Time PCR based method to determine the presence of the transferred cold regulated gene in the chrysanthemum was established. To check whether over-expression of BN115 gene in transgenic chrysanthemum will enhance their tolerance to cold stress, the transgenic chrysanthemum were grown under low temperature condition and several cold signalling including growth characteristics, stoma size and shape, SPAD value and ion leakage test were investigated. The transgenic chrysanthemum in the low temperature growth chamber grow much faster in term of the height, number and size of the leaves than those of wild-type plants and damage of transgenic plant caused by the low temperature was much less than that of wild-type plants. The stoma type and size of transgenic plant leaves grown at $5^{\circ}C$ were much similar to of wild-type plant cultured on $25^{\circ}C$ It has been found that SPAD value of transgenic plants was much higher than those of wild-type, but the EC density being lower under low temperature condition.
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문제 정의
2006). 따라서 본 연구는 저온 저항성 유전자가 도입된 국화형질전환체의 생육 특성을 조사하고자 처리온도별 생육상황 및 저온조건하에서의 기공형태, 엽록체 함량, 전기전도도 등을 조사하였다.
제안 방법
나누어 2, 000 lux, 광16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber 에서 30일 동안 생육하여 조사하였다. 이때 growth chamber 내의 각 처리별 식물체는 MS+3% sucrose 기본배지의 유리 배양 병에서 생육 중인 형질전환체를 사용하였다.
형질전환용 식물체 양성은 sucrose가 3%(w/v)첨가된 MS기본 배지에서 배양하였다. Callus 형성 및 공동배양은 3% sucrose가 첨가된 MS기본배지에 1.0 mg/L BA와 0.3 mg/L 2, 4-D 생장조정제를 첨가하여 재조합한 후 0.8 ~ 1.0 cm2 잎 절편을 핀으로 상처 접종하였다. 공동배양을 위한 Agrobacterium 은 LB와 MM(Minimal Media)에서 각각 12시간, IM(Induction Media)+As(Acetosyringone) 에서 6시간 배양하여 국화잎 에접종하였다.
1차 선발 배지에서 재분화된 형질전환체는 PCR 및 Real-Time PCR을 이용하여 최종 형질전환체(T2, T56, T63, T96, Till)로 선발하였다. nptH gene의 증폭을 위한 PCR primer 는 700 bp 의 산물을 증폭하는 forward primer ATGGGGAGC GGCGATACCGTA와 reverse primer GAGGCTATTCGGCTA TGACTG# 사용하였다 또한 Real-Time PCRe Real-Time PCR 7500 system(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, PCR 반응을 위한 TaqMan BN115 probe는 Applied Biosystems 에서 합성하였다 (Han et al. 2006).
0 cm2 잎 절편을 핀으로 상처 접종하였다. 공동배양을 위한 Agrobacterium 은 LB와 MM(Minimal Media)에서 각각 12시간, IM(Induction Media)+As(Acetosyringone) 에서 6시간 배양하여 국화잎 에접종하였다. 형질 전환에 사용된 저온 관련 유전자 BN115는 Brassica 야ms에서 분리된 것으로 binary vector°1] 도입하여 pBinl9::BN115로 재조합한 다음 disarmed Ti-plasmid를 함유하고 있는 4 tumefaciens MP90에 도입한 것을 경희대학교로부터 분양받아 사용하였다 (Choi et 기 1996, Fu et 기 1999; Jeong et al.
국화 형질전환체가 저온 처리 조건에서 외부환경요인에적응하기 위하여 어떻게 반응하는 지 식물체 잎기공의 형태를SEM (scanning electron microscopy)으로 관찰하였다. SEM 관찰을 위해서는 형질전환체와 비형질전환체를 5 ℃, .
국화의 형질전환체가 저온의 외부환경 요인에 적응하여 어떻게 반응하는지를 조사하기 위하여 저온에서 배양된 형질전환체와 비형질전환체의 잎의 기공구조를 주사 전자현미경 (SEM)으로 관찰하였다 (Table 2, Figure 3), 5℃ 에서 30일 동안 저온 처리한 후 관찰된 기공의 크기는 형질전환체의 외부가 43.2 ~ 64.4 um X 40.3-54.8 um, 내부가 28.8-52.8 , um X 19.2-24.0 um 이었다. 비형질 전환체의 기공 크기는 30.
Ion leakage test를 위한저온처리 방법은 형질전환체를 5℃에서 7일, 0℃에서 3일간배양한 후 25℃ 에서 12시간 다시 배양하였다. 또한 0.5 cm 크기의 잎절편 1,000 mg을 만들어 50 ml 시료병에 넣고 20 ml 의 멸균 증류수를 첨가하여 200 rpm에서 3시간 동안 흔든 후전기전도도 (EC)를 측정하였다.
엽록체 함량 측정은 형질전환체를 각각 온도별로 30일 동안 배양한 후 잎의상, 중하를 각각 3반복씩 조사하였다. 또한 저온처리에서의 세포 내 상해 정도를 조사하고자 Ion leakage test를 수행하였다. Ion leakage test를 위한저온처리 방법은 형질전환체를 5℃에서 7일, 0℃에서 3일간배양한 후 25℃ 에서 12시간 다시 배양하였다.
한편 형질전환체의 생리적 특성을 조사하고자 식물체 내의 엽록소 함량 변화를 SPAD (soil plant analysis development, Minolta, spad-502) meter를 사용하여 측정하였다. 엽록체 함량 측정은 형질전환체를 각각 온도별로 30일 동안 배양한 후 잎의상, 중하를 각각 3반복씩 조사하였다. 또한 저온처리에서의 세포 내 상해 정도를 조사하고자 Ion leakage test를 수행하였다.
온도별 생육관찰은 5, 10, 15, 25℃ 등으로 나누어 2, 000 lux, 광16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber 에서 30일 동안 생육하여 조사하였다. 이때 growth chamber 내의 각 처리별 식물체는 MS+3% sucrose 기본배지의 유리 배양 병에서 생육 중인 형질전환체를 사용하였다.
저온처리 조건에서 형질전환체의 생리적 특성을 조사하고자 엽록소 함량 및 전기전도도를 측정하였다. 형질전환체의 엽록소 함량은 5, 25℃에서 비형질 전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이를 보이지 않고 형질전환 체간 ±1.
이때 growth chamber 내의 각 처리별 식물체는 MS+3% sucrose 기본배지의 유리 배양 병에서 생육 중인 형질전환체를 사용하였다. 저온처리에서의 상해 정도는 위에서 각기 다른 온도별로 30일 동안 생육 된 형질전환체를 또다시 2℃ 에서 4일간 처리하여 관찰하였다. 이때 상해 정도 관찰은 배지가 제거된 식물체를 멸균 수가 절반 정도 채워진 음료수형 종이컵에 고정하여 유지하였다.
최종 선발된 형질전환체(T2, T56, T63, T96, Till)의 온도별 생육관찰은 5, 10, 15, 25℃에 2,000 lux, 광 16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber에서 30일 동안 생육하여 비형질전환체의 생육과 비교하였다. 형질전환체의 처리온도별 생육은 비형질 전환체의 생육보다 우수한 경향을 보였다.
최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육과 저온에서의 상해 정도를 관찰하여 유전자 발현에 따른 저항성 정도를 검토하였다. 온도별 생육관찰은 5, 10, 15, 25℃ 등으로 나누어 2, 000 lux, 광16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber 에서 30일 동안 생육하여 조사하였다.
2000 lux, 광 16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber에서 30일 동안 생육하였다. 한편 형질전환체의 생리적 특성을 조사하고자 식물체 내의 엽록소 함량 변화를 SPAD (soil plant analysis development, Minolta, spad-502) meter를 사용하여 측정하였다. 엽록체 함량 측정은 형질전환체를 각각 온도별로 30일 동안 배양한 후 잎의상, 중하를 각각 3반복씩 조사하였다.
대상 데이터
국화 (DeMraMhema grandiflorum) 는 Puma품종을 Agrobacyerim 으로 형질전환시킨 뒤 5 mg/L kanamycin 이 함유된 MS 기본배지에서 4~6주 동안 배양하여 1차 선발하였다 (Figure 1). 형질전환용 식물체 양성은 sucrose가 3%(w/v)첨가된 MS기본 배지에서 배양하였다.
성능/효과
PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인된 국화 형질전환체는 저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로 kanamycin에저항성 있는 nptU gene을 가지고 있는 식물발 현용 binary vector pBinl9/BN115가 삽입된 A. tumefacience MP90을 국화 잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비 형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다.
0 ㎛이었다. 따라서 기공형태의 크기는 형질 전환체의 기공의 크기가 비형질전환체의 기공크기에 비해 더 큰 모양이었으며, 특히 외부보다 기공 내부의 크기에서 더욱 큰 것으로 측정되었다. 또한 형태는 저온에서닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 開口된 모양을 유지하고 있었다.
7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다. 또한 Ion leakage test 결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부 환경에 안정적으로 적응하여 세포 내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의EC농도 (ds/m)가 비형질 전환체에 비해 1.29~ 1.97배 낮은 수치를 보였다.
또한 저온에서의 상해 정도 관찰에서도 수침상 정도가 비 형질전환체보다 경미하였다. 저온의 외부 환경에 따른 국화잎의 기공 모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환 체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, 25℃에서는 비형질 전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, 15℃에서는 최대 +5.
저온의 외부 환경에 따른 국화잎의 기공 모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환 체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, 25℃에서는 비형질 전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, 15℃에서는 최대 +5.7 (평균 +3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다. 또한 Ion leakage test 결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부 환경에 안정적으로 적응하여 세포 내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의EC농도 (ds/m)가 비형질 전환체에 비해 1.
tumefacience MP90을 국화 잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비 형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다. 또한 저온에서의 상해 정도 관찰에서도 수침상 정도가 비 형질전환체보다 경미하였다.
형질전환체의 처리온도별 생육은 비형질 전환체의 생육보다 우수한 경향을 보였다. 특히 선발된 형질전환체의 초장, 생체중, 엽수 등의 평균을 비형질전환체의 평균과 비교할 때 선발된 형질전환체의 생육이 5℃를 비롯하여 10℃, 15℃, 25℃에서 모두 우수한 생육을 나타냈다. 그러나 형질전환체와 비 형질전환체의 평균치 간의 차이를 비교할 때 예상했던 저온에서의 생육이 고온에서의 생육보다 더 큰 차이를 보이지는 않았다 (Table 1).
형질전환체의 엽록소 함량은 5, 25℃에서 비형질 전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이를 보이지 않고 형질전환 체간 ±1.9 (평균 +0.1), -3.2 (평균-1.1)이내 이었으나 10, 15℃에서는 최대 +5.7 (평균 +3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적인 높은 수치를 나타냈다. 그러나 온도별 형질전환체의 개체간의 차이는 일정한 경향을 보이지 않았다 (Table 3).
비형질전환체의 생육과 비교하였다. 형질전환체의 처리온도별 생육은 비형질 전환체의 생육보다 우수한 경향을 보였다. 특히 선발된 형질전환체의 초장, 생체중, 엽수 등의 평균을 비형질전환체의 평균과 비교할 때 선발된 형질전환체의 생육이 5℃를 비롯하여 10℃, 15℃, 25℃에서 모두 우수한 생육을 나타냈다.
후속연구
그러나 온도별 형질전환체의 개체간의 차이는 일정한 경향을 보이지 않았다 (Table 3).이와 같은 결과는 처리온 도 중 가장 낮은 5℃ 에서는 저온저항성 유전자가국화잎의 엽록소 함량 변화에 큰 영향을 미치지 못한 것으로생각되지만 저온 처리 별로 저온저항성 유전자가 국화잎의엽록소 함량 변화에 어떤 영향을 미치는지에 관한 연구는 앞으로 더욱 필요하다고 생각된다. 한편, 25℃에서의 형질전환체내의 저온저항성 유전자가 잎의 엽록소 함량 변화에 큰영향을 미치지 못한 것은 본 실험에 사용된 BN115 gene이겨울유채 품종인 Jetneuf 식물체를 2℃조건에서 저온처리한후 발현되는 유전자를 cloning한 것이기 때문이다.
참고문헌 (21)
Anchordoguy TJ, Rudolph AS, Carpenter JF, Crowe JH (1987) Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing. Cryobiology 24: 324-331
Choi KH, Yang DC, Jeon JH, Kim HS, Joung YH, Joung H (1996) Expression of cold-regulated gene in transgenic Solanum tuberosum L. Korean J Plant Tissue Culture 23: 311-315
Fu P, Singh J, Keller W, McGregor I (1999) Sucrose content and freezing tolerance of Brassica napus canola (rapeseed) seedlings over expressing an Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. 10th international rapeseed congress, Australia
Han SG, Choi IY, Kang CH, Ko BR, Lee WH (2006) Genetic transformation of chrysanthemum with cold regulated gene (BN115). Korean J Plant Biotechnol 33: 19-25
Holmstrom KO, Somersalo S, Mandal A, Palva ET, Welin B (2000) Improved tolerance to salinity and low temperature in transgenic tobacco producing glycine betaine. Journal of Experimental Botany 51: 177-185
Hwang CH (1994) Cold-induced genes of plants with emphasis on their function. Molecular Biology News 6: 57-59
Jeong JH, Yang DC, Jang HG, Paek KY (2000) Transformation of Lettuce (Lactuca sativa L.) using cold regulated gene (BN115). Korean J Plant Tissue Culture 27: 7-12
Lee BJ, Won MK, Lee DH, Shin DG (2001) Changes in SPAD chlorophyll value of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora Tzvelev) by photoperiod and light intensity. Kor J Hort Sci ＆ Technol 19: 555-559
Levitt, J (1980) Responses of Plants to Environmental Stresses, Vol. 1 (2nd ed). New York NY: Academic Press
Livingston DP III, Henson CA (1998) Apoplastic sugars, fructans, fructan exohydrolase, and invertase in winter oat: responses to second-phase cold hardening. Plant Physiol 116: 403-408
Rudolph AS, Crowe JH (1985) Membrane stabilization during freezing: the role of two natural cryoprotectants, trehalose and proline. Cryobiology 22: 367-377
Steponkus PL, Uemura M, Webb MS (1993a) A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat-two species that widely differ in their freezing tolerance and plasma membrane lipid composition. In Advances in Low-Temperature Biology, Edited by Steponkus, P.L. 2: 211-312
Steponkus PL, Uemura M, Webb MS (1993b) Membrane destabilization during freeze-induced dehydration. Curr Top Plant Physiol 10: 37-47
Strauss G, Hauser H (1986) Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing. Proc Natl Acad Sci USA 83: 2422-2426
Weretilnyk E, Orr W, White TC, Lu B, Singh J (1993) Characterization of three related low-temperature-regulated cDNAs from winter Brassica napus. Plant Physiol 101: 171-177
Yoon YH, Isoda A, Nojima H (1997) Changes in SPAD value and phothosynthetic rate during grain filling of Oryza glaberrima strains and Oryza sativa cultivars. Korean Journal of Crop Science 42: 759-765
Yun, DJ (2005) Molecular mechanism of plant adaption to high salinity. Korean J Plant Biotechnol 32: 1-14
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