엔테로바이러스 검출을 위한 real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), reverse transcription-PCR (RT-PCR) 및 바이러스 배양법의 비교 Comparison of the Real-Time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) Assay, Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) and Virus Isolation for the Detection of Enterovirus RNA.원문보기
본 연구는 무균성수막염 의심환자의 다양한 검체로부터 enterovirus의 진단을 위하여 real-time NASBA, 2 step RT-PCR 시험과 세포배양 시험을 각각 실시하여 각 시험법의 검출율, 특이도, 사용자 편리성, 시험소요 시간, 교차오염의 가능성 등을 비교 검토하였다. 비교시험 결과 전체 292건의 검체로부터 real-time NASBA에서 145건, 세포배양에서 101건, 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 검출율이 높은 시험법임을 알 수 있었다. Enterovirus 외의 무균성수막염 원인바이러스에 대한 특이도 비교 시험결과 2 step RT-PCR 시험에서 rhinovirus 10건 중 1건이 위양성 반응을 나타내어 다른 시험법에 비해 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다. Real-time NASBA는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나 다른 시험과 비교하여 교차오염의 가능성이 낮으며 또한 시험 소요시간이 5시간 정도로 세포배양(5-14일 소요) 및 2 step RT-PCR(9시간소요) 에 비하여 신속하게 진단할 수 있어 일선병원이나 실험실에서 enterovirus를 검출을 위하여 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 무균성수막염 의심환자의 다양한 검체로부터 enterovirus의 진단을 위하여 real-time NASBA, 2 step RT-PCR 시험과 세포배양 시험을 각각 실시하여 각 시험법의 검출율, 특이도, 사용자 편리성, 시험소요 시간, 교차오염의 가능성 등을 비교 검토하였다. 비교시험 결과 전체 292건의 검체로부터 real-time NASBA에서 145건, 세포배양에서 101건, 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 검출율이 높은 시험법임을 알 수 있었다. Enterovirus 외의 무균성수막염 원인바이러스에 대한 특이도 비교 시험결과 2 step RT-PCR 시험에서 rhinovirus 10건 중 1건이 위양성 반응을 나타내어 다른 시험법에 비해 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다. Real-time NASBA는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나 다른 시험과 비교하여 교차오염의 가능성이 낮으며 또한 시험 소요시간이 5시간 정도로 세포배양(5-14일 소요) 및 2 step RT-PCR(9시간소요) 에 비하여 신속하게 진단할 수 있어 일선병원이나 실험실에서 enterovirus를 검출을 위하여 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
Rapid detection of enterovirus (EVs) is important in the management of aseptic meningitis. We examined the relative efficiency and specificity of the real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) comparing with the established reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) an...
Rapid detection of enterovirus (EVs) is important in the management of aseptic meningitis. We examined the relative efficiency and specificity of the real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) comparing with the established reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and viral culture method which were used for the detection of enterovirus RNA in clinical specimens. Of the total 292 samples, 145 were found to be positive to enterovirus RNA by real-time NASBA, 101 were positive by viral culture, and 86 were positive by RT-PCR. 147 samples and 46 samples were determined to be negative and positive by all methods respectively, but 4 samples were positive only by real-time NASBA. To compare the specificity of each method, various clinical samples which were diagnosed for herpes simplex virus (HSV)-1, HSV-2, adenovirus, mumps, and rhinovirus were applied. Except one rhinovirus sample which was false positive to enterovirus RNA by RT-PCR, the other different samples were negative to all three methods. The real-time NASBA procedure can be completed within 5 hours in contrast with 9 hours for the RT-PCR and 3-14 days for the viral culture. From this study, it was suggested that the real-time NASBA assay could be a standardized, rapid, specific, and sensitive procedure for the detection of enterovirus RNA.
Rapid detection of enterovirus (EVs) is important in the management of aseptic meningitis. We examined the relative efficiency and specificity of the real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) comparing with the established reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and viral culture method which were used for the detection of enterovirus RNA in clinical specimens. Of the total 292 samples, 145 were found to be positive to enterovirus RNA by real-time NASBA, 101 were positive by viral culture, and 86 were positive by RT-PCR. 147 samples and 46 samples were determined to be negative and positive by all methods respectively, but 4 samples were positive only by real-time NASBA. To compare the specificity of each method, various clinical samples which were diagnosed for herpes simplex virus (HSV)-1, HSV-2, adenovirus, mumps, and rhinovirus were applied. Except one rhinovirus sample which was false positive to enterovirus RNA by RT-PCR, the other different samples were negative to all three methods. The real-time NASBA procedure can be completed within 5 hours in contrast with 9 hours for the RT-PCR and 3-14 days for the viral culture. From this study, it was suggested that the real-time NASBA assay could be a standardized, rapid, specific, and sensitive procedure for the detection of enterovirus RNA.
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제안 방법
Enterovirus의 유전자 검출을 위하여는 보존성이 높은 것으로 알려 진 5‘-NCR region을 target으로 2 step RT-PCR을 수행하였으며[21], 바이러스 유전자형 확인을 하기 위하여는 바이러스 capsid 중 VP1 region을 target으로 2 step RT-PCR을 수행하였다[1"8丄 각각의 2 step RT-PCR에서 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다. RT 반응은 reverse primer와 MMLV reverse transcriptase (Promegaz USA)를 사용하였다.
Boxtel)를 사용하여 수행하였다(Table 1). 10 u 1 master mix (0.2 uM primer 1, 0.2 uM primer 2, 0.2 uM molec ular beacon probe, 90 mM KC1) 에 5 u 1 template RNA를 첨가한 후 template RNA 의 predenaturation과 master mix 에 pri- mer가 용해되게 하기 위해 65°C 5분, 41°C 5분간 반응하였다, 그리고 이 mixture에 5 ul 의 enzyme mix (T7 RNA polymer ase, AMV reverse transcriptase and RNase H)를 첨가하여 NucleiSens EasyQ analyzer (bioMerieuxz Boxtel, The Netherlands)에서 41°C에서 150분간 반응하면서 증폭 및 검출을 수행하였다. 데이터는 NucleiSens EasyQ analyzer 제조사의 NucleiSens EasyQ director software (version 121.
0)를 이용하여 분석하였다. 20건의 enterovirus 음성검체를 이용하여 4회의 real-time NASBA 실험을 수행하여 나온 결과 값을 제조사의 방법 에 따라 계산하여 threshold fluorescence level을 결정하였다.
, Daejeon, Korea)에 염 기서 열 분석을 의뢰하였다. BigDye™ terminator V3.1 cycle se quencing kit (Perkin Elmer, USA) 을 사용하여 sequencing 반응을 하였고, Millipore-Montage dye removal kit로 sequencing 산물을 정제하였으며 ABI 3730XL capillary DNA ana lyzer (Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염 기서열은 NCBI BLAST search program을 사용하여 기존의 보고된 바이 러스와 sequence homology> 비교하여 기존 혈청형의 염기서열과 75% 이상의 상동성을 보이는 경우를 기준으로 바이러스의 유전자형을 결정하였다.
Reverse tran scription 반응은 2Q°C 1。분, 42°C 90분으로 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 cDNA 1 ul에 2.5 pl 10x buffer, 3 ul dNTP, 0.5 |il forward primer, 0.5 pl reverse primer, 0.5 ul Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 혼합하였고 멸균증류수를 첨가하여 총 25 ul 로 조정하였다. PCR 수행은 95°C 5분간 pre- denaturation^ 후 95°C/30초, 56°C/30초, 그리고 72°C/30초씩 3단계로 35cycles 수행한 후 마지막으로 72°C 3분간 ex- tension을 실시하였다.
5 ul Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 혼합하였고 멸균증류수를 첨가하여 총 25 ul 로 조정하였다. PCR 수행은 95°C 5분간 pre- denaturation^ 후 95°C/30초, 56°C/30초, 그리고 72°C/30초씩 3단계로 35cycles 수행한 후 마지막으로 72°C 3분간 ex- tension을 실시하였다. 증폭산물은 1.
RT 반응은 reverse primer와 MMLV reverse transcriptase (Promegaz USA)를 사용하였다. RT 반응액은 5 ul nucleic acid elute, 3 ul 5× buffer, 3 ul dNTPz 1 ul reverse primer, 0.5 ul MMLV reverse transcriptase를 포함하여 총 15 ul 가 되게 멸균증류수를 첨가하였다. Reverse tran scription 반응은 2Q°C 1。분, 42°C 90분으로 실시하였다.
그에 비해 real-time NASBA 시험은 민감도와 특이도가 높게 나타나 두 시험법을 대체할 가능성이 있다고 사료된다. Real-time NASBA 시험의 특이도검사를 위하여 enterovirus 외에 뇌수막염의 원인이 되는 바이러스 즉, 단순포진바이 러스 1형 3건, 단순포진바이 러스 2형 3건, 아데노바이러스 3건, 유행성이하선염바이러스 2건 그리고 rhinovirus 10건을 대상으로 real-time NASBA, 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험, 세포배양 시험을 각각 수행하였다. 실험에 사용된 모든 바이러스는 세포배양, real-time NASBA 시험에서 모두 음성으로 나타났다.
Real-time NASBA를 이용한 enterovirus RNA 검출을 위하여 190 nucleotides 의 specific primers 와 molecular beacon probe [3]는 Eurogentec (Seraing, Belgium)에 의뢰하여 합성 및 HPLC 정제하였고, NucleiSens Amplification kit (bioMerieux, Boxtel)를 사용하여 수행하였다(Table 1). 10 u 1 master mix (0.
각 시험법의 특이도를 알아보고자 무균성수막염에서 en- terovirus와 감별진단이 필요한 임상검체들과 유전적으로 en- terovirus와 유사한 rhinovirus 검체를 real-time NASBA와 2 step RT-PCR, 그리고 바이러스 배양법으로 실험하였다. 각각의 바이 러스는 특이 적 인 primer를 이용한 TCR로 양성 이 확인된 것들을 사용하였다.
각각의 바이 러스는 특이 적 인 primer를 이용한 TCR로 양성 이 확인된 것들을 사용하였다. 3건의 herpes simplex virus type 1 (HaV-1)과 3건의 HSV-2Z 3건의 adenovirus, 2건의 mumps vi- rus를 실험에 사용하였고 광주보건환경연구원에서 분양받은 10건의 rhinovirus를 각각의 실험에 사용하였다.
검체 200ul와 900 ul의 lysis buffer를 사용하였고 25 ul를 elution 하였다, 이 RNA 추출물을 real-time NASBA와 RT-PCR에 사용하였다.
1 cycle se quencing kit (Perkin Elmer, USA) 을 사용하여 sequencing 반응을 하였고, Millipore-Montage dye removal kit로 sequencing 산물을 정제하였으며 ABI 3730XL capillary DNA ana lyzer (Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염 기서열은 NCBI BLAST search program을 사용하여 기존의 보고된 바이 러스와 sequence homology> 비교하여 기존 혈청형의 염기서열과 75% 이상의 상동성을 보이는 경우를 기준으로 바이러스의 유전자형을 결정하였다.
1). 그리고 NucleiSens Isolation Reagent와 NucleiSens Lysis Buffer를 사용하여 RNA를 분리하여 enter ovirus real-time NASBA를 수행하고, 동시 에 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험하여 436 bp 산물을 확인하였다(Fig. 2). 대변 42건과 뇌척수액 1건, 인후도찰물 3건 등 총 46건에서 3가지 시험법 모두 양성으로 나타났고, 대변 94건, 뇌척수액 45건, 인후도 찰 물 8건 등 총 147건의 검체는 3가지 시험법 모두에서 음성이었다.
대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후도찰물 26건 등 총 292건의 검체를 대상으로 real-time NASBA, 바이러스배양, 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험을 각각 실시하였다. 검체를 RD 세포주에 배양하여 검체에 따라 3-5일에서 늦으면 일주일 후에 장내바이러스에 의한 전형적인 세포변성효과(CPE)인 세포의 원형화, 세포질의 수축, 세포의 파괴 등의 현상이 유발됨을 관찰할수 있었다(Fig.
대변상층액, 뇌 척수액, 인후도찰물의 RNA 추출은 NucleiSens Lysis Buffer와 NucleiSens Isolation Reagent를 사용하여 제조사(bioMerieux, Boxtel)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 검체 200ul와 900 ul의 lysis buffer를 사용하였고 25 ul를 elution 하였다, 이 RNA 추출물을 real-time NASBA와 RT-PCR에 사용하였다.
또한 본 연구는 real-time NASBA와 enterovirus 검출의 표준시험법 (Gold standard)으로 사용되어 왔던 세포배양과 2 step RT-PCR 시험 간의 사용자 편리성과 소요시간을 비교 고찰하였다. 세포배양에서 바이러스가 자라려면 보통 3일에서 5일, 길게는 7일이 걸리며 음성판정에는 14일 이상이 걸린다.
바이 러스 배 양과 5-NCR 2 step RT-PCR 시 험 결과 양성 인검체 141건(바이 러스 배 양과 5'-NCR 2 step RT-PCR 모두 양성 46건, 바이 러스 배 양만 양성 55건, 5'-NCR 2 step RT-PCR만 양성 40건)에 대하여 VP-1 RT-PCR을 수행하여 검체 모두에서 358 bp의 증폭산물이 확인되어(Fig. 1) sequencing 분석을 수행하였다. 그 결과 coxsackievirus CA4형 1건, CB1 형 2건, CB2 형 1건, CB3 24건(17.
바이러스 배양 결과 세포변성효과를 보이는 배양 상층액과 5'-NCR 2 step RT-PCR 결과 양성을 보이는 검체에 대하 여유 전자형 확인을 위 하여 VP1 2 step RT-PCR을 수행하고 그 증폭 산물은 솔젠트사(SolGent Co., Daejeon, Korea)에 염 기서 열 분석을 의뢰하였다. BigDye™ terminator V3.
본 연구는 무균성수막염 의심환자의 다양한 검체로부터 enterovirus의 진단을 위하여 real-time NASBA, 2 step RT-PCR 시험과 세포배양 시험을 각각 실시하여 각 시험법의검출율, 특이도, 사용자 편리성, 시험소요 시간, 교차 오염의 가능성 등을 비교 검토하였다. 비교시험 결과 전체 292건의 검체로부터 real-time NASBA에서 145건, 세포배 양에서 101 건, 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 검출율이 높은 시험법임을 알 수 있었다.
본 연구에서는 무균성수막염이 의심되는 환자의 뇌척수액 외 대변, 인후도찰물 등의 다양한 검체에서 real-time NASBA 시험법을 적용하고 현재 enterovirus 진단에 많이 사용되는 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험 및 세포배양 시험을 비교 실험하여 각 시험의 검출율, 특이도, 실험수행 시 편리성, 시험 소요 시간, 교차오염 가능성 등을 확인하였다. 본 연구에서는 대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후도찰물 26건을 포함하여 총 292건 임상검체를 대상으로 시험하였으며 그 결과 real-time NASBA에서 145건, 세포배양에서 101건, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 민감도가 높은 시험법임을 알 수 있었다.
본연구에서는 무균성수막염으로 의심되는 환자의 뇌척수액, 대변, 인후도찰물 검체를 대상으로 다양한 serotypes의 entervirus를 검줄하기 위 하여 5시'JCR region을 target으로 한 primer와 molecular beacon [3]을 제작, NucleiSens Amplification kit (bioMerieuXz Boxtel, The Netherlands)를 사용하여 real-time NASBA 시험을 실시하고, 현재 enterovirus를 검출하는데 사용되는 2 step RT-PCR과 바이 러스 배양시험을 동시 수행하여 각 실험법의 검출율, 편리성, 신속성을 비교 분석하였다. 아울러 무균성수막염 환자에서 enterovirus와 감별 진단이 필요한 다른 원인바이러스와 enterovirus^ 유전적으로 유사한 rhinovirus를 사용하여 각 실험법 의 정 확성과 특이도를 비교하였다.
본연구에서는 무균성수막염으로 의심되는 환자의 뇌척수액, 대변, 인후도찰물 검체를 대상으로 다양한 serotypes의 entervirus를 검줄하기 위 하여 5시'JCR region을 target으로 한 primer와 molecular beacon [3]을 제작, NucleiSens Amplification kit (bioMerieuXz Boxtel, The Netherlands)를 사용하여 real-time NASBA 시험을 실시하고, 현재 enterovirus를 검출하는데 사용되는 2 step RT-PCR과 바이 러스 배양시험을 동시 수행하여 각 실험법의 검출율, 편리성, 신속성을 비교 분석하였다. 아울러 무균성수막염 환자에서 enterovirus와 감별 진단이 필요한 다른 원인바이러스와 enterovirus^ 유전적으로 유사한 rhinovirus를 사용하여 각 실험법 의 정 확성과 특이도를 비교하였다.
3). 이에 유전자형 확인을 위하여 VP1 re- gion을 target으로 하는 RT-PCR 산물로 염기서열을 분석하였다. 그 결과 세포배양에서는 잘 자라지 않는 특성을 가진 cox sackievirus CA4형 1건과 CB3 2건, CB5 4건, echovirus E9형 3건, E18형 27건, E30형 1건, untypable enterovirus 2건으로 각각 나타났다.
PCR 수행은 95°C 5분간 pre- denaturation^ 후 95°C/30초, 56°C/30초, 그리고 72°C/30초씩 3단계로 35cycles 수행한 후 마지막으로 72°C 3분간 ex- tension을 실시하였다. 증폭산물은 1.5% agarose gel을 사용하여 전기 영동하여 5'-NCR region 436 bp, VP~1 region 358 bp의 band 유무를 확인하였다.
대상 데이터
2005년 4월부터 9월까지 부산지역 4개 병원 소아과 내원 무균성 수막염 의심 환자의 대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후도 찰 물 26건 등 총 292건의 검체를 공시재료로 사용하였다. 검체의 연령별 구분은 10세 미만이 256건, 10세 이상이 36건이며, 성별 구분으로는 남자 154건, 여자 138건이었다.
각각의 바이 러스는 특이 적 인 primer를 이용한 TCR로 양성 이 확인된 것들을 사용하였다. 3건의 herpes simplex virus type 1 (HaV-1)과 3건의 HSV-2Z 3건의 adenovirus, 2건의 mumps vi- rus를 실험에 사용하였고 광주보건환경연구원에서 분양받은 10건의 rhinovirus를 각각의 실험에 사용하였다.
2 uM molec ular beacon probe, 90 mM KC1) 에 5 u 1 template RNA를 첨가한 후 template RNA 의 predenaturation과 master mix 에 pri- mer가 용해되게 하기 위해 65°C 5분, 41°C 5분간 반응하였다, 그리고 이 mixture에 5 ul 의 enzyme mix (T7 RNA polymer ase, AMV reverse transcriptase and RNase H)를 첨가하여 NucleiSens EasyQ analyzer (bioMerieuxz Boxtel, The Netherlands)에서 41°C에서 150분간 반응하면서 증폭 및 검출을 수행하였다. 데이터는 NucleiSens EasyQ analyzer 제조사의 NucleiSens EasyQ director software (version 121.0)를 이용하여 분석하였다. 20건의 enterovirus 음성검체를 이용하여 4회의 real-time NASBA 실험을 수행하여 나온 결과 값을 제조사의 방법 에 따라 계산하여 threshold fluorescence level을 결정하였다.
시험에 사용한 단순포진바이러스 1형(HSV-1), 2형(HSV-2), adenovirus 각 3건과 mumps virus 2건은 real-time NASBA, 바이러스 배양, 5'-NCR 2 아ep RT-PCR 시험 모두에서 음성으로 나타났다. rhinovirus의 경우, 10건 모두에서 바이러스 배양과 real-time NASBA 시험 결과 음성으로 일치하였지만, 2 step RT-PCR 시험에서는 1건의 rhinovirus가 위양성 반응을 나타내었다.
검체의 연령별 구분은 10세 미만이 256건, 10세 이상이 36건이며, 성별 구분으로는 남자 154건, 여자 138건이었다. 인후도 찰 물은 VTM (virus transport medium)을 사용하여 채취하였고 뇌척수액은 별도의 전처리 없이 사용하였다. 대변은 PBS/ chlorform을 사용하여 10% 부유액으로 만든 다음 5분 동안 강하게 진탕하고 4, 000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층 액을 취하여 실험에 사용하였다.
각각의 검체는 4°C에서 운반하였고 -70°C를 유지하여 보관하였다. 일반적으로 enterovirus의 분리에 가장 적절한 세포는 일차배양 원숭이 신장세포(primary monkey kidney cell)이지만 매번 이 세포를 획득하기가 현실적으로 어려우므로 세계보건기구(WHO)가 추천하는 세포 중 RD (human rhabdomyosarcoma) 세포주를 사용하였다.
이론/모형
Table 1에 제시하였다. RT 반응은 reverse primer와 MMLV reverse transcriptase (Promegaz USA)를 사용하였다. RT 반응액은 5 ul nucleic acid elute, 3 ul 5× buffer, 3 ul dNTPz 1 ul reverse primer, 0.
성능/효과
Real-time NASBA는 molecular beacon probe 와 NucleiSens EasyQ를 사용하여 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나므로 복잡한 단계가 필요 없고 소요시 간도 5시 간이 면 충분하다. 2 step RT-PCR은 RT와 PCR의 2단계가 필요하며 증폭 산물을 확인하기 위한 별도의 전기영동과정이 필요하므로 총 9시간이 걸려 결과적으로 하루 만에 실험결과를 확인할 수는 없었다.
46건의 검체에서 3가지 시험법 모두에서 양성 결과를 보였고 이들은 모두 10세 미만 환자의 검체에서 검출되었다. 각각의 시험법 중 하나 또는 그 이상 양성으로 검출된 검체는 모두 145건 이었으며 그 중 10세 미만 환자에서 143건이 검출되었고, 10세 이상에서 2건 검출되었으며 18세 이상에서는 1건도 검출되지 않았다.
비교시험 결과 전체 292건의 검체로부터 real-time NASBA에서 145건, 세포배 양에서 101 건, 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 검출율이 높은 시험법임을 알 수 있었다. Enterovirus 외의 무균성수막염 원인바이러스에 대한 특이도 비교 시험결과 2 step RT-PCR 시험에서 rhinovirus 10건 중 1건이 위양성 반응을 나타내어 다른 시험법에 비해 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다. Real-time NASBA는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나 다른 시험과 비교하여 교차오염의 가능성이 낮으며 또한 시험 소요시간이 5시간 정도로 세포배양(5-14일 소요) 및 2 step RT-PCR(9시간소요) 에비하여 신속하게 진단할 수 있어 일선병원이나 실험실에서 enterovirus를 검출을 위하여 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
RT-PCR 시험을 각각 실시하였다. 검체를 RD 세포주에 배양하여 검체에 따라 3-5일에서 늦으면 일주일 후에 장내바이러스에 의한 전형적인 세포변성효과(CPE)인 세포의 원형화, 세포질의 수축, 세포의 파괴 등의 현상이 유발됨을 관찰할수 있었다(Fig. 1). 그리고 NucleiSens Isolation Reagent와 NucleiSens Lysis Buffer를 사용하여 RNA를 분리하여 enter ovirus real-time NASBA를 수행하고, 동시 에 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험하여 436 bp 산물을 확인하였다(Fig.
1) sequencing 분석을 수행하였다. 그 결과 coxsackievirus CA4형 1건, CB1 형 2건, CB2 형 1건, CB3 24건(17.0%), CB5 53건(37.6%), echovirus E9형 13건(9.2%), E18형 44건(31.2%), E30형 1 건, untypable enter ovirus 2건으로 분석되 었다(Table 4). 그 중 세포배양에서는 음성이고 2 step RT-PCR에서만 양성을 보이는 검체 40건은 coxsackievirus CA4형 1건, CB3 2건, CB5 4건, echovirus E9형 3건, E18 형 27건, E30형 1건, untypable enterovirus 2건으로 나타났다.
이에 유전자형 확인을 위하여 VP1 re- gion을 target으로 하는 RT-PCR 산물로 염기서열을 분석하였다. 그 결과 세포배양에서는 잘 자라지 않는 특성을 가진 cox sackievirus CA4형 1건과 CB3 2건, CB5 4건, echovirus E9형 3건, E18형 27건, E30형 1건, untypable enterovirus 2건으로 각각 나타났다. 이는 검체의 취급과정 중에 바이러스의 vital ity?]- 떨어져 세포배양에서는 자라지 않으나 2 step RT-PCR 시험은 바이러스의 활력과 관계없이 RNA가 증폭되는 특성의 차이로 사료되어진다.
2%), E30형 1 건, untypable enter ovirus 2건으로 분석되 었다(Table 4). 그 중 세포배양에서는 음성이고 2 step RT-PCR에서만 양성을 보이는 검체 40건은 coxsackievirus CA4형 1건, CB3 2건, CB5 4건, echovirus E9형 3건, E18 형 27건, E30형 1건, untypable enterovirus 2건으로 나타났다.
이로써 NucleiSens EasyQ를 이용한 enterovirus re al-time NASBA가 다른 실험에 비해 사용자의 편리성과 수행 시간이 짧음을 확인할 수 있었다. 그리고 단계별로 튜브를 열고 다른 튜브로 산물들을 옮겨 실험하는 2 step RT-PCR이나 여러 검체를 세포에 접종할 시 검체 간의 오염가능성이 있어 신중한 주의를 요하는 세포배 양법 에 비해 real-time NASBA 는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나므로 교차오염을 줄일 수 있다는 장점을 가진다. 또한 real-time NASBA는세포배양이나 2 step RT-PCR에 비해 구역화 된 별도의 실험공간이 필요치 않으며 비교적 간단한 시설과 장비, 시약으로도 충분히 운영가능하다.
2%(18건/26 건) 으로 각각 나타났다. 또 뇌척수액의 경우 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험에서 상대적으로 낮은 양성율 7.2%(5/69)을 보였으며, 인후도찰물은 바이러스 배양에서 양성율이 30.7%(8/26) 으로 낮게 나타났다. 월별로는 6-8월에 분리 된 검체건수가 많았고, 양성 환자의 성별비는 남 70 : 여 기로 유의한 차이점을 나타내지 않았다.
바이 러스 배양과 5'-NCR 2 step RT-PCR의 결과를 비교하여 보면 두 가지 시험 모두에 양성인 검체는 대변 42건, 뇌척수액 1건, 인후도 찰 물 3건 등 총 46건이었고, 바이러스 배양 시험에서만 양성인 경우는 대변 33건, 뇌 척수액 17건, 인후도찰물 5건 등 총 55건이 었으며, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 만 양성 인 경우는 대변 26건, 뇌척수액 4건, 인후도찰물 10건 등 총 40건이었다(Table 3). 모든 5'-NCR 2 step RT-PCR 양성검체와 세포배양 양성검체는 real-time NASBA에서도 양성으로 나타났고 2건의 대변, 2건의 뇌척수액 등 총 4건의 검체에서는 real-time NASBA에서만 양성으로 나타났다.
본 연구에서는 대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후도찰물 26건을 포함하여 총 292건 임상검체를 대상으로 시험하였으며 그 결과 real-time NASBA에서 145건, 세포배양에서 101건, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 민감도가 높은 시험법임을 알 수 있었다. 모든 5'-NCR 2 step RT-PCR 양성검체와 세포배양 양성검체는 real-time NASBA에서도 양성으로 나타났고 46건의 검체에서는 모든 실험에서 양성으로 나타났다.
양성검체는 real-time NASBA 145건 세포배양 101건, 2 step RT-PCR 86건순으로 나타났다(Table 2). 바이 러스 배양과 5'-NCR 2 step RT-PCR의 결과를 비교하여 보면 두 가지 시험 모두에 양성인 검체는 대변 42건, 뇌척수액 1건, 인후도 찰 물 3건 등 총 46건이었고, 바이러스 배양 시험에서만 양성인 경우는 대변 33건, 뇌 척수액 17건, 인후도찰물 5건 등 총 55건이 었으며, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 만 양성 인 경우는 대변 26건, 뇌척수액 4건, 인후도찰물 10건 등 총 40건이었다(Table 3). 모든 5'-NCR 2 step RT-PCR 양성검체와 세포배양 양성검체는 real-time NASBA에서도 양성으로 나타났고 2건의 대변, 2건의 뇌척수액 등 총 4건의 검체에서는 real-time NASBA에서만 양성으로 나타났다.
교차오염 가능성 등을 확인하였다. 본 연구에서는 대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후도찰물 26건을 포함하여 총 292건 임상검체를 대상으로 시험하였으며 그 결과 real-time NASBA에서 145건, 세포배양에서 101건, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 민감도가 높은 시험법임을 알 수 있었다. 모든 5'-NCR 2 step RT-PCR 양성검체와 세포배양 양성검체는 real-time NASBA에서도 양성으로 나타났고 46건의 검체에서는 모든 실험에서 양성으로 나타났다.
등을 비교 검토하였다. 비교시험 결과 전체 292건의 검체로부터 real-time NASBA에서 145건, 세포배 양에서 101 건, 2 step RT-PCR에서 86건이 양성으로 나타나 real-time NASBA가 가장 검출율이 높은 시험법임을 알 수 있었다. Enterovirus 외의 무균성수막염 원인바이러스에 대한 특이도 비교 시험결과 2 step RT-PCR 시험에서 rhinovirus 10건 중 1건이 위양성 반응을 나타내어 다른 시험법에 비해 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다.
Real-time NASBA 시험의 특이도검사를 위하여 enterovirus 외에 뇌수막염의 원인이 되는 바이러스 즉, 단순포진바이 러스 1형 3건, 단순포진바이 러스 2형 3건, 아데노바이러스 3건, 유행성이하선염바이러스 2건 그리고 rhinovirus 10건을 대상으로 real-time NASBA, 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험, 세포배양 시험을 각각 수행하였다. 실험에 사용된 모든 바이러스는 세포배양, real-time NASBA 시험에서 모두 음성으로 나타났다. 흥미로운 결과로 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험에서 10건의 rhinovirus중 1건에서 강한 양성 밴드가 관찰되어 위양성 반응을 보여 다른 두 시험보다 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다.
대변 42건과 뇌척수액 1건, 인후도찰물 3건 등 총 46건에서 3가지 시험법 모두 양성으로 나타났고, 대변 94건, 뇌척수액 45건, 인후도 찰 물 8건 등 총 147건의 검체는 3가지 시험법 모두에서 음성이었다. 양성검체는 real-time NASBA 145건 세포배양 101건, 2 step RT-PCR 86건순으로 나타났다(Table 2). 바이 러스 배양과 5'-NCR 2 step RT-PCR의 결과를 비교하여 보면 두 가지 시험 모두에 양성인 검체는 대변 42건, 뇌척수액 1건, 인후도 찰 물 3건 등 총 46건이었고, 바이러스 배양 시험에서만 양성인 경우는 대변 33건, 뇌 척수액 17건, 인후도찰물 5건 등 총 55건이 었으며, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서 만 양성 인 경우는 대변 26건, 뇌척수액 4건, 인후도찰물 10건 등 총 40건이었다(Table 3).
그러나 real-time NASBA는 molecular beacon probe 와 NucleiSens EasyQ analyzer 제조사의 NucleiSens EasyQ director software를 사용하여 증폭과 검출이 실시간으로 확인됨으로 5시간 정도면 결과를 볼 수 있다. 이로써 NucleiSens EasyQ를 이용한 enterovirus re al-time NASBA가 다른 실험에 비해 사용자의 편리성과 수행 시간이 짧음을 확인할 수 있었다. 그리고 단계별로 튜브를 열고 다른 튜브로 산물들을 옮겨 실험하는 2 step RT-PCR이나 여러 검체를 세포에 접종할 시 검체 간의 오염가능성이 있어 신중한 주의를 요하는 세포배 양법 에 비해 real-time NASBA 는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나므로 교차오염을 줄일 수 있다는 장점을 가진다.
실험에 사용된 모든 바이러스는 세포배양, real-time NASBA 시험에서 모두 음성으로 나타났다. 흥미로운 결과로 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험에서 10건의 rhinovirus중 1건에서 강한 양성 밴드가 관찰되어 위양성 반응을 보여 다른 두 시험보다 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다. 이는 enterovirus는 rhinovirus 와 유전적으로 매우 유사하며 다른 바이러스들 간에 교차반응이 많다는 보괴 12]와 9건의 rhinovirus에 대해 2 step RT-PCR 과 real-time NASBA를 수행한 결과 real-time NASBA에서는모두 음성이었지만 2 step RT-PCR에서 3건의 rhinovirus 가위 양성 반응을 보였다는 보고[1]와 유사한 결과를 보인다.
후속연구
Enterovirus 외의 무균성수막염 원인바이러스에 대한 특이도 비교 시험결과 2 step RT-PCR 시험에서 rhinovirus 10건 중 1건이 위양성 반응을 나타내어 다른 시험법에 비해 특이도가 떨어지는 것으로 나타났다. Real-time NASBA는 하나의 튜브에서 증폭과 검출이 동시에 일어나 다른 시험과 비교하여 교차오염의 가능성이 낮으며 또한 시험 소요시간이 5시간 정도로 세포배양(5-14일 소요) 및 2 step RT-PCR(9시간소요) 에비하여 신속하게 진단할 수 있어 일선병원이나 실험실에서 enterovirus를 검출을 위하여 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
이는 enterovirus는 rhinovirus 와 유전적으로 매우 유사하며 다른 바이러스들 간에 교차반응이 많다는 보괴 12]와 9건의 rhinovirus에 대해 2 step RT-PCR 과 real-time NASBA를 수행한 결과 real-time NASBA에서는모두 음성이었지만 2 step RT-PCR에서 3건의 rhinovirus 가위 양성 반응을 보였다는 보고[1]와 유사한 결과를 보인다. 그러므로 무균성수막염 의심환자의 인후도찰물 검체에서 enter ovirus 검 출을 위한 2 step RT-PCR 시 험 시 rhinovirus와의 감별시험이 필요할 것으로 사료된다.
또한 real-time NASBA는세포배양이나 2 step RT-PCR에 비해 구역화 된 별도의 실험공간이 필요치 않으며 비교적 간단한 시설과 장비, 시약으로도 충분히 운영가능하다. 그러므로 일선 병원과 소규모 실험실에서 무균성수막염을 신속하게 진단하는데 쉽게 적용할 수 있어, 결과적으로 부적절한 항생제의 사용을 막을 수 있고 입원 시간을 단축하는데 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
세포배양에서 바이러스가 자라려면 보통 3일에서 5일, 길게는 7일이 걸리며 음성판정에는 14일 이상이 걸린다. 그리고 실험이 없을 때에도 세포주를 항상 최적의 상태로 유지하기 위한 시간이 별도로 소요되므로 enterovirus를 신속하게 검출하는 데는 한계가 있다. 그리고 세포배양을 위해 BSL (BioSafety Level) 2-3등급으로 별도의 구역화 된 실험실과 세포의 유지 및 CPE (Cytopathic Effect)를 확인을 위 한 숙련된 인력이 필요하여 임상에서 무균성수막염 진단에 적용하기에는 어려움이 있다.
이는 검체 자체에 활력을 가지는 바이러스가 2 step RT-PCR에서는 검출한계를 벗어난 매우 적은 숫자로 존재하거나 검체의 취급, 운반, 보관 중에 RNA가 소실된 것으로 추측된다. 이는 세포배양과 2 step RT-PCR 단독으로는 enterovirus를 검출하는데 한계가 있으며 두 실험을 상호 보완적으로 수행해야 함을 의미하며 아울러 검체 채취 및 보관, 운송 등의 과정에서 최적의 조건을 유지하는 것이 필요할 것으로 사료된다. 그에 비해 real-time NASBA 시험은 민감도와 특이도가 높게 나타나 두 시험법을 대체할 가능성이 있다고 사료된다.
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