[논문]보골지 및 염초보골지의 proteasome 저해 작용

심상희

보골지 및 염초보골지의 proteasome 저해 작용
Protesome Inhibition Activity of Psoraleae Semen and Processed Psoraleae Semen 원문보기

생약학회지, v.39 no.1 = no.152, 2008년, pp.56 - 59

Abstract ▼ AI-Helper

Ubiquitin-proteasome proteolytic system plays an important role in selective protein degradation and regulates cellular events including apoptosis. Cancer cells have been shown to be more sensitive to the proapoptotic effects of proteasome inhibition than normal cells. Thus, proteasome inhibitor can be potential anticancer agent. Since the MeOH extracts of psoraleae semen and processed psoraleae semen showed potent proteasome inhibition activity, the fractions of the extracts were evaluated on the activity to screen the proteasome inhibitors. The $CHCl_3$ fr. of the processed psoraleae semen showed the most potent activity, of which chemical investigation led to two coumarins, psoralen and isopsoralen. Their structures were determined by spectroscopic methods such as $^1H-NMR$ and EIMS spectra.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

한다. 또한 활성 분획에서 분리된 2 종의 화합물의 구조에 대해서도 보고하고자 한다.
이에 본 연구자는 보골지 및 염초보골지의 추출물에서 proteasome 저해 작용이 있는 성분을 규명하는 것을 목표로 activity-guided Gactionation에 따라 보골지 및 염초보골지의메타놀 추출물을 극성에 따라 5개의 분획으로 나누고 각각의 분획물에 대해 proteaseome 저해 효과를 측정하여 이를 보고하고자 한다. 또한 활성 분획에서 분리된 2 종의 화합물의 구조에 대해서도 보고하고자 한다.

제안 방법

가장 활성이 강한 염초보골지의 CHC₁₃ 분획물을 대상으로 column chrmatography를 시행하여 2종의 화합물을 분리하였고 이들의 구조를 1H-NMR 및 ELMS를 측정하여 결정 할 수 있었다.
보골지 및 염초보골지의 추출물, 분획들은 DMSO에 4mg/mL의 용액으로 제조한 후이 용액 10 μL에 assay buffer 70 μL를 가하여 제조되었다, 측정 시 먼저 assay buf에 3% SDS를 가하여 activation 시킨 후 96 well에 sample, enzyme을 가한 후 37℃에서 10 분간 incubation 시켰다. 그 후 기질(Suc-LLVY-AMC)을 가하였고, 이로써 proteasome의 chymotrypsimlike activity는 효소.기질 반응의 결과 유리되는 AMC의 양을 fluorescence plate reader로 excitation 355 nm, emission 460nm에서 측정함으로써 결정되었다.
그 후 다시 메타놀로 냉침하였다(5 Lx4회). 메타놀 추출물을 농축한 후 극성에 따라 n-Hexane, Chlorofbim, Ethyl acetate, n-BuOH 순으로 분획하였다. 이 중 chloroform 층에 대하여 n-Hexane 및 Ethyl acetate의 gradient 용매로 용리시켜 전부 20개의 분획을 얻었다.
메타놀 추출물을 농축한 후 극성에 따라 n-Hexane, Chlorofbim, Ethyl acetate, n-BuOH 순으로 분획하였다. 이 중 chloroform 층에 대하여 n-Hexane 및 Ethyl acetate의 gradient 용매로 용리시켜 전부 20개의 분획을 얻었다. 이 중 13번째 및 15번째 분획을 n-Hexane, Ethyl acetate 및 MeOH 용매로 재결정을 유도하여 화합물 1과 2를 분리하였다.
4 Hz)과 long range coupling 하여 broad singlet으로 나타났음을 확인할 수 있었으며, 또한 H-4가 broad doublete로 나타나 H-8과 long range coupling함을 확인할 수 있었다. 이 화합물의 EIMS spectrum에서는 m/z 186에서 molecular ion peak이, 여기서 CO가 탈리된 signal이 m/z 158에서 나타나 이를 NMR spectrum과 종합하여 이 화합물의 구조를 보골지에서 다량으로 존재한다고 알려진 psoralen으로 결정하였고 이 data는 문헌치와 일치하였다.6)

대상 데이터

- 보골지 및 염초보골지는 대구시내 약전 골목에서 구입하여 전문가의 확인을 거쳐 사용하였다. 표본은 영남대학교 생명공학부의 천연물화학 연구실에 보관 중이다.
TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Merck의 70~230 Mesh의 silica gel을 사용하였다. Proteasome 저해 작용 측정을 위해 효소,기질, buffer 등은 Biomol International LP의 20S Proteasome Assay Kit (AK-740)을 사용하였고 기질로 사용된 Suc-LLWAMC 에서 유리된 AMC의 flourescence를 측정하기 위한 fluorescence plate reader로 FLOUoptima가 사용되었다.
추출 및 column chromatography용 용매는 시 약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Merck의 70~230 Mesh의 silica gel을 사용하였다.

이론/모형

DMSO에 희석하여 사용되었다. Proteasomee 인간 적혈구에서 분리 , 정제된 것이고 기질은 Suc-LLVY-AMC 이며 사용된 assay bufifer# activation 시키기 위하여 SDS (sodium dodecyl sulfate)가 사용되었다. Positive control로는 20S Proteasome의 chymotrypsin-like activity의 비가역적 저해제인 epoximicin이 사용되었다.

성능/효과

4Hz)으로 두 개의 proton signal이 나타나 이 화합물이 furanocoumarin 골격을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. Coumarin의 H-5가 5 7.67에서 singlet으로 나타났고, H-8은 5 7.46에서 H-3' (dd, J=0.9, 2.4 Hz)과 long range coupling 하여 broad singlet으로 나타났음을 확인할 수 있었으며, 또한 H-4가 broad doublete로 나타나 H-8과 long range coupling함을 확인할 수 있었다. 이 화합물의 EIMS spectrum에서는 m/z 186에서 molecular ion peak이, 여기서 CO가 탈리된 signal이 m/z 158에서 나타나 이를 NMR spectrum과 종합하여 이 화합물의 구조를 보골지에서 다량으로 존재한다고 알려진 psoralen으로 결정하였고 이 data는 문헌치와 일치하였다.
그 후 기질(Suc-LLVY-AMC)을 가하였고, 이로써 proteasome의 chymotrypsimlike activity는 효소.기질 반응의 결과 유리되는 AMC의 양을 fluorescence plate reader로 excitation 355 nm, emission 460nm에서 측정함으로써 결정되었다.
6Hz)으로 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 5 6.82 및 7.68에서 각각 doublet (J=2.4Hz) 또는 doublet of doublet (7=0.9, 2.4Hz)으로 두 개의 proton signal이 나타나 이 화합물이 furanocoumarin 골격을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. Coumarin의 H-5가 5 7.
Table 1에서 볼 수 바와 같이 보골지 및 염초보골지의 MeOH 추출물은 각각 91%, 74%로 강한 proteasome 저해 작용을 나타냈다. 분획물들 중 비극성 분획 CHC₁₃ 층이 87%(보골지), 96%(염초보골지)로 가장 강한 proteasome 저해 작용을 나타냈고 그 다음 EtOAc 층도 75%(보골지), 80%(염초보골지) 로 강한 저해 작용을 나타냈다. 그러나 proteasome 저해 작용은 수치에 크게 영향을 받지 않는 것으로 관찰되었다.
또한 H-3 이 multiplet 으로, H-6가 broad doublet 으로 나타나 이 두 proton들이 서로 long range coupling 함을 확인할 수 있었다. 이들 NMR data와 EIMS data를 이용하여 이 화합물이 보골지에서 다량으로 존재하는 것으로 알려진 isopsoralen임을 확인할 수 있었고 문헌의 기기분석 data와 잘 일치하였다.6)
화합물 1의 1H-NMR spectnmm에서 coumarin의 특징적인 a-pyrone ring에서 기인한 H-3 및 H-4가 각각 5 6.36 및 7.78에서 doublet (J=9.6Hz)으로 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 5 6.

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