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문제 정의
- 따라서 본 연구는 인삼 고년생 결주의 주원인인 잿빛곰팡이병의 경종적 방제법 및 살균제 잔류 문제 최소화를 위한방제약제 선발의 기초자료로서 병원균의 균학적 특성을 구명하고자 실시하였다.
- 인삼 고년생 결주의 주원인으로 작용하는 잿빛 곰팡이병 방제을 위한 기초연구로 병원균을 분리, 동정하고 이들의 균 학적 특성을 구명하였다. 잿빛 곰팡이병반으로부터 균을 분리하여 분생 포자의 형태적 특징을 관찰하고 RPB2 유전자의 염기서열 분석을 실시한 결과 분리균은 Botrytis cinerea로 동정 되었다.
제안 방법
- 최근 식물병원 균류의 분류, 동정에는 형태적 분류의 어려움을 보완하기 위해서 여러 가지 유전자의 염기서열 분석을 이용한 분자생물학적 기법을 사용하고 있는데13, 14, 15) Botrytis속 균의 경우 RPB2, G3PDH, HSP60 3개 유전자의 염기서열 분석을 이용하여 종간 유연관계 분석을 실시한 바 있다.10)따라서 본 연구에서는 공시균주의 종동정을 위하여 Staats 등10)이 실험에 사용한 RPB2, G3PDH, HSP60 유전자의 염기 서열 분석을 실시하였다. RPB2 유전자의 염기서열분석 결과 3개 균주는 GenBank에 등록된 B.
- HSP60과 RPB2 유전자의 증폭은 initial denaturation을 94oC에서 5분간 실시한 후 denaturation 94oC 30초, annealing 55oC 30초, extension 72oC 90초로 35 cycles을 실시하고 final extension을 72oC 10분 실시하였다. G3PDH 유전자의 증폭은 annealing 94oC 30초를 제외하고 HSP60과 RPB2 유전자의 증폭 조건과 동일하였다.
- PCR 증폭산물은 PCR prep kit(iNtRon Biotechnology) 으로 정제하고, BigDye teminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Forster City; CA, U.S.A)를 이용, template 40 ng, primer 3.2 pmol, teminator ready reaction mixture 8 也에 물을 첨가하여 20 也 volume으로 조절한 뒤 96oC 10초, 50oC 5초, 60oC 4분으로 25cycle의 PCR 반응을수행한 후 ABI prism™ 3700 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)를 이용하여 sequencing을 실시하였다. 염기서열은 PHYDIT program version 3.
- RPB2 유전자의 증폭을 위해서는 RPB2for(5'-GATGATC- GTGATCATTTCGG-3')와 RPB2rev(5'-CCCATAGCTTGCT- TACCCAT-3'), G3PDH 유전자의 증폭에는 G3PDHfor(5'- ATTGACATCGTCGCTGTCAACGA-3') 와 G3PDHrev(5'-A- CCCCACTCGTTGTCGTACCA-3') primer 그리고 HSP60 유전자를 증폭하기 위해서 HSP60for(5'-CAACAATTGA- GATTTGCCCACAAG-3') 와 HSP60rev(5'-GATGGATCCA- GTGGTACCGAGCAT-3')를 이용하였다.10)
- 각 유전자의 증폭을 위하여 15 ng의 genomic DNA, 각 0.5 pm이의 primer, 200 |jM dNTP's, 2.5 unit의 Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 에 H2O를 첨가하여 최종 volume을 50 B로 하였다.
- 5%, 1% 첨가한 PDA 배지를 제조하였다. 각각의 배지에 전배양한 3개 공시균주(BC0407, BC0544, BC0555)를 접종하여 20oC 에서 25일간 배양한 후배지별 균핵수를 조사하였다.
- 공시균주(BC0407, BC0544, BC0555)는 PDA 배지에 접종하여 25oC에서 5일간 배양한 후 균사소량을 PD broth에 접종, 25oC에서 5일간 진탕배양하여 균사체를 얻었다. 균사체는 동결건조 후 50~100mg을 1.
- 공시균주(BC0407, BC0544, BC0555)를 PDA배지에 접종하여 25oC에서 14일 동안 배양한 후 형성된 직경 3~4mm 균핵을 접종원으로 사용하였다. 포지시험은 지상부 출아 직전인 2006년 4월 18일 5년생 지하 부 뇌두와 줄기가 접한 부위에 각 균주별 균핵을 1개씩, 12개체에 접종하였으며, 병 발생율은 발병 초기부터 접종 후 43일까지 조사하였다.
- 균핵 형성에 미치는 광의 영향을 조사하기 위하여 전배양한 29개 공시 균주를 PDA 배지에 접종하여 20oC, 24시간암 상태와 1일 12시간 광암교호조건(광량 28 μmole/secm2) 에서 각각 30일간 배양한 후각 조건별 균핵수를 조사하였다. 또한 균핵형성에 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여지역, 연생 및 인삼식물체기관별로 분리된 6개 균주 (BC0407, BC0544, BC0555, BC0557, BC0573, BC0578) 를 대표균주로 선발하여 PDA 배지에 접종하고 25oC 항온기에서 6일간 전 배양한 후 5 mm cork borer로 균사 선단을채취하여 PDA 배지에 접종하였다.
- 배양 온도를 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC로 각각 조절한 항온기에서 암 상태로 25일간 배양한 후 온도별 균핵수를 조사하였다. 균핵 형성에 미치는 배지의 영향을 알아보기 위하여 4년생인삼 포지의 전년도 고죽을 2월 15일 경 채취하여 고죽미세절편, 고죽 열수추출물(121oC, 10분) 및 인삼분말을 0.25%, 0.5%, 1% 첨가한 PDA 배지를 제조하였다. 각각의 배지에 전배양한 3개 공시균주(BC0407, BC0544, BC0555)를 접종하여 20oC 에서 25일간 배양한 후배지별 균핵수를 조사하였다.
- 또한 균핵형성에 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여지역, 연생 및 인삼식물체기관별로 분리된 6개 균주 (BC0407, BC0544, BC0555, BC0557, BC0573, BC0578) 를 대표균주로 선발하여 PDA 배지에 접종하고 25oC 항온기에서 6일간 전 배양한 후 5 mm cork borer로 균사 선단을채취하여 PDA 배지에 접종하였다. 배양 온도를 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC로 각각 조절한 항온기에서 암 상태로 25일간 배양한 후 온도별 균핵수를 조사하였다.
- 또한 균핵형성에 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여지역, 연생 및 인삼식물체기관별로 분리된 6개 균주 (BC0407, BC0544, BC0555, BC0557, BC0573, BC0578) 를 대표균주로 선발하여 PDA 배지에 접종하고 25oC 항온기에서 6일간 전 배양한 후 5 mm cork borer로 균사 선단을채취하여 PDA 배지에 접종하였다. 배양 온도를 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC로 각각 조절한 항온기에서 암 상태로 25일간 배양한 후 온도별 균핵수를 조사하였다. 균핵 형성에 미치는 배지의 영향을 알아보기 위하여 4년생인삼 포지의 전년도 고죽을 2월 15일 경 채취하여 고죽미세절편, 고죽 열수추출물(121oC, 10분) 및 인삼분말을 0.
- 분리균주 중 포자 및 균핵 형성이 양호한 3개 공시균주 (BC0407, BC0544, BC0555)를 PDA 배지에 접종하여 20oC 에서 10일간 배양한 후 포자의 크기, 모양, 색깔 등 형태적특징을 광학현미경으로 관찰하였으며, 균주 간의 포자 및 균핵의 표면 구조차이를 확인하기 위하여 다음과 같이 주사전자현미경 (SEM)으로 관찰하였다. 조직절편을 0.
- 수집한 병반은 1%차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 1 분간 침지하여 표면 소독한 후 Streptomycin 300 ppm이 첨가된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 치상하여 20oC 항온기에서 3~4일 동안 배양하였다. 병반부에 형성된 균사와 포자를 멸균수에 현탁하여 PDA 배지에도말한 후 단일 균총을 분리하였다.
- 포지시험은 지상부 출아 직전인 2006년 4월 18일 5년생 지하 부 뇌두와 줄기가 접한 부위에 각 균주별 균핵을 1개씩, 12개체에 접종하였으며, 병 발생율은 발병 초기부터 접종 후 43일까지 조사하였다. 실내시험은 묘삼을 6개씩 3반복으로 포트에 이식하고 뇌두부위에 균핵을 1개씩 접종한 후 1일 12시간 광조건(광량 28 emole/secm2), 15oC 항온기에서 재배하면서 접종 47일 후 발병율을 조사하였다.
- 5% SDS] 에 현탁하고 proteinase K 50㎍을 첨가, 37oC에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 400 ㎕의 2xCTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) solution[2% CTAB(w/v), 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 200 mM EDTA(pH 8.0), 1.4M NaCl, 1% PVP(polyvinyl- pyrrolidone) Mr 40, 000]을 첨가하여 섞어준 뒤 chloroform : isoamylalcohol(24:1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7 volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 얻었다. TE buffer[Tis-HCl(pH 8.
- 2)로 20분 간격으로 4~5회 세척한 후 마지막 phosphate buffer에서 하룻밤 처리하였다. 이어서 탈수는 ethanol 희석 단계별 (40%, 60%, 80%, 90%, 95% ethanol)로 각각 20분씩 그리고 100% ethan이로 45분간 2회 탈수하였다. 탈수 후에는 iso-amylacetate로 40분간 2회 치환하여 CPD (Critical Point Dryer)로 건조시켜 시료대에 고정, Ion-Sputter로 도금한 후 SEM (Hitachi 2460, Japan)으로 검경하였다.
- 이어서 탈수는 ethanol 희석 단계별 (40%, 60%, 80%, 90%, 95% ethanol)로 각각 20분씩 그리고 100% ethan이로 45분간 2회 탈수하였다. 탈수 후에는 iso-amylacetate로 40분간 2회 치환하여 CPD (Critical Point Dryer)로 건조시켜 시료대에 고정, Ion-Sputter로 도금한 후 SEM (Hitachi 2460, Japan)으로 검경하였다.
- 접종원으로 사용하였다. 포지시험은 지상부 출아 직전인 2006년 4월 18일 5년생 지하 부 뇌두와 줄기가 접한 부위에 각 균주별 균핵을 1개씩, 12개체에 접종하였으며, 병 발생율은 발병 초기부터 접종 후 43일까지 조사하였다. 실내시험은 묘삼을 6개씩 3반복으로 포트에 이식하고 뇌두부위에 균핵을 1개씩 접종한 후 1일 12시간 광조건(광량 28 emole/secm2), 15oC 항온기에서 재배하면서 접종 47일 후 발병율을 조사하였다.
대상 데이터
- 2004년과 2005년 6월부터 7월까지 경기, 충남, 강원지역 8 개 포장의 인삼 줄기, 잎 및 고죽의 잿빛 곰팡이병반을 수집하였다. 수집한 병반은 1%차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 1 분간 침지하여 표면 소독한 후 Streptomycin 300 ppm이 첨가된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 치상하여 20oC 항온기에서 3~4일 동안 배양하였다.
- The old stem fragment were detached on 4 year-old ginseng garden at February, 15, 2007. The dried ginseng powder were made with 4 year-old ginseng.
- 111)을 이용하여 정렬하였고, phylogenetic dendrograme Kimura's 2-parameter distance model을 이용하여 Neighbor-joining method에 의해 작성되었다. 또한 종동정을 위하여 GenBank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)에 공개된 Botrytis database를 이용하였다.
- 병반부에 형성된 균사와 포자를 멸균수에 현탁하여 PDA 배지에도말한 후 단일 균총을 분리하였다. 분리된 29개 균주(Table 1)는 PDA 사면배지에 옮겨 배양한 후 4oC 냉장고에 보관하면서 공시 균주로 사용하였다.
이론/모형
- 2 pmol, teminator ready reaction mixture 8 也에 물을 첨가하여 20 也 volume으로 조절한 뒤 96oC 10초, 50oC 5초, 60oC 4분으로 25cycle의 PCR 반응을수행한 후 ABI prism™ 3700 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)를 이용하여 sequencing을 실시하였다. 염기서열은 PHYDIT program version 3.111)을 이용하여 정렬하였고, phylogenetic dendrograme Kimura's 2-parameter distance model을 이용하여 Neighbor-joining method에 의해 작성되었다. 또한 종동정을 위하여 GenBank (http://www.
성능/효과
- 구분할 수 있었다. Fig. 5과 같이 24시간 연속 암상태에서는 29개 공시 균주 중 23개 균주가 균핵형에 포함되었으며 균사형 4균주, 포자형이 1균주였다. 그러나 광을 12시간 간격으로 조사했을 경우 단 6개 균주만 균핵형에 포함되었으며 균사형 및 포자형의 균주 수가 증가되는 것을 알 수 있었다.
- 10)따라서 본 연구에서는 공시균주의 종동정을 위하여 Staats 등10)이 실험에 사용한 RPB2, G3PDH, HSP60 유전자의 염기 서열 분석을 실시하였다. RPB2 유전자의 염기서열분석 결과 3개 균주는 GenBank에 등록된 B. cinerea와 100%의 상 동성으로 염기서열이 일치하여 정확한 종 동정이 가능하였다(Fig. 2-A). 그러나 G3PDH와 HSP60 유전자의 염기서열 분석에서는 (Fig.
- 공시균주의 병원성 검정을 실시하였던 바, Fig. 3에서와 같이 묘삼을 이용한 실내시험과 5년생 포지시험에서 동일하게 3개 공시 균주 중 1개 균주만병원성을 나타내었으며 2개 균주는 비병원성을 나타내어 균주 간에 병원성의 차이를 확일할 수 있었다. 묘삼에서는 접종 17일 후부터 뇌두 썩음으로인한 미출아현상이 나타나기 시작하여 31일 후에는 지제부줄기가 완전히 쓰러지는 것을 관찰할 수 있었으며, 5년생의 경우 균핵접종 24일 후부터 병징을 보이기 시작하여 38일후 줄기가 쓰러지면서 자연 발병한 병징과 동일한 현상을 관찰할 수 있었다.
- 광이 균핵 형성에 미치는 영향을 조사한 결과 29개 공시균주는 Paul7이 보고한 3가지 생장 형태, 즉 균핵형, 균사형, 포자형으로 구분할 수 있었다. Fig.
- 10oC 이하의 저온에서도 균핵형성이 잘 되는 것으로 보아 인삼 재배시 저온인 월동기에도 전염원인 균핵이 토양 중에 존재하면서 이듬해 다시 전염원으로 작용할 것으로 생각되어진다. 균핵 형성에 미치는 고죽의 영향을 알아보기 위해 PDA 배지에 고죽미세 절편, 고죽 물 추출물 및 인삼분말을 농도별로 첨가한 결과 Fig. 7과같이 첨가물의 농도가 높아질수록 균핵 형성량이 많아지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 고죽미세 절편을 0.5% 첨가하였을 경우 대조구에 비해 약 10배 정도 균핵 형성량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 추후 고죽의 성분 분석을 통하여 균핵 형성 촉진 물질을 규명할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- cine/ea의 균핵 형성에는 암상태가 필수적임을 알 수 있으며, 이것은 실제 포장 조건하에서 광이 있는지상부에는 포자가 많이 형성되고 광이 없는지하부 토양에는 균핵 형성량이 많은 것과 일치한다. 균핵 형성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과 5~20oC의 온도 범위에서 균핵 형성이 양호하였으며 25oC 이상의 고온에서는 균핵 형성이 억제되었다 (Fig. 6). 10oC 이하의 저온에서도 균핵형성이 잘 되는 것으로 보아 인삼 재배시 저온인 월동기에도 전염원인 균핵이 토양 중에 존재하면서 이듬해 다시 전염원으로 작용할 것으로 생각되어진다.
- 잿빛 곰팡이병반으로부터 균을 분리하여 분생 포자의 형태적 특징을 관찰하고 RPB2 유전자의 염기서열 분석을 실시한 결과 분리균은 Botrytis cinerea로 동정 되었다. 균핵을 이용한 병원성 검정 결과 공시한 3균주 중 1 균주는 병원성, 2균주는 비병원성을 나타내었다. 주사전자현미경으로 균핵을 관찰한 결과 병원성 균주는 표면이 주름지고 거친 반면 비병원성균주는 매끈하였다.
- 5과 같이 24시간 연속 암상태에서는 29개 공시 균주 중 23개 균주가 균핵형에 포함되었으며 균사형 4균주, 포자형이 1균주였다. 그러나 광을 12시간 간격으로 조사했을 경우 단 6개 균주만 균핵형에 포함되었으며 균사형 및 포자형의 균주 수가 증가되는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 실험 결과 B.
- 그러나 광을 12시간 간격으로 조사했을 경우 단 6개 균주만 균핵형에 포함되었으며 균사형 및 포자형의 균주 수가 증가되는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 실험 결과 B. cine/ea의 균핵 형성에는 암상태가 필수적임을 알 수 있으며, 이것은 실제 포장 조건하에서 광이 있는지상부에는 포자가 많이 형성되고 광이 없는지하부 토양에는 균핵 형성량이 많은 것과 일치한다. 균핵 형성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과 5~20oC의 온도 범위에서 균핵 형성이 양호하였으며 25oC 이상의 고온에서는 균핵 형성이 억제되었다 (Fig.
- pelargonii 같은 그룹을 형성하여 종동정이 불확실하였다. 따라서 본 실험 결과 Botrytis 속의 종동정에는 RPB2 유전자의 염기서열 분석이 가장 유용한 것으로 판단된다.
- 3에서와 같이 묘삼을 이용한 실내시험과 5년생 포지시험에서 동일하게 3개 공시 균주 중 1개 균주만병원성을 나타내었으며 2개 균주는 비병원성을 나타내어 균주 간에 병원성의 차이를 확일할 수 있었다. 묘삼에서는 접종 17일 후부터 뇌두 썩음으로인한 미출아현상이 나타나기 시작하여 31일 후에는 지제부줄기가 완전히 쓰러지는 것을 관찰할 수 있었으며, 5년생의 경우 균핵접종 24일 후부터 병징을 보이기 시작하여 38일후 줄기가 쓰러지면서 자연 발병한 병징과 동일한 현상을 관찰할 수 있었다.
- 병원성에 차이를 보인 3개 균주의 접종 원인 균핵을 주사전자현미경 (SEM)으로 관찰한 결과 병원성 균주의 균핵은 표면이 거칠고 주름이 많은 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 4-B) 비병원성 균주의 경우 표면이 아주 매끈한 것을 알 수 있었다(Fig. 4-C, D). 따라서 추후 균주 수를 추가하여 이러한 접종 원의 형태적인 특징이 병원성, 비병원성균주의 차이를 나타내는 것인지 세부적으로 검토할 필요가 있을 것으로 판단된다.
- 특성을 구명하였다. 잿빛 곰팡이병반으로부터 균을 분리하여 분생 포자의 형태적 특징을 관찰하고 RPB2 유전자의 염기서열 분석을 실시한 결과 분리균은 Botrytis cinerea로 동정 되었다. 균핵을 이용한 병원성 검정 결과 공시한 3균주 중 1 균주는 병원성, 2균주는 비병원성을 나타내었다.
- 균핵을 이용한 병원성 검정 결과 공시한 3균주 중 1 균주는 병원성, 2균주는 비병원성을 나타내었다. 주사전자현미경으로 균핵을 관찰한 결과 병원성 균주는 표면이 주름지고 거친 반면 비병원성균주는 매끈하였다. 균핵 형성은 5~20oC, 암 상태에서 양호하였으며, 0.
후속연구
- 5% 첨가하였을 경우 대조구에 비해 약 10배 정도 균핵 형성량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 추후 고죽의 성분 분석을 통하여 균핵 형성 촉진 물질을 규명할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 4-C, D). 따라서 추후 균주 수를 추가하여 이러한 접종 원의 형태적인 특징이 병원성, 비병원성균주의 차이를 나타내는 것인지 세부적으로 검토할 필요가 있을 것으로 판단된다.
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