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문제 정의
- )은 오래전부터 자연 감염된 PSV의 월동기주로서 보고 되었으나(Mink 등, 1969), 이 계통의 구체적인 성상에 대한 연구가 없으며, 또한 국내에서는 아직까지 토끼풀로부터 PSV의 보고가 없는 상황이다. 2007년 여름, 강원도 춘천시 소재 농업과학기술원 의 포장 주변에서 선명한 모자이크 병징의 토끼풀을 채집하여 바이러스를 분리한 결과, PSV로 동정되어 이 바이러스의 몇몇 성질을 여기에 보고한다.
가설 설정
- Ouchterlony double-diffusion test of crude sap of Nicotiana benthamiana infected with Tr-PSV (Tr), ER-PSV (ER) and Fny- CMV (Fny) against to antiserum of ER-PSV. H: crude sap from healthy leaves of N. benthamiana.
제안 방법
- amaranticolor, Vigna unguiculatacv. Kurotanesanzaku를 공시하여 기주범위와 병징 특성을 조사하였다. 접종은 0.
- 5. RFLP analysis of the product for the half region of RNA3 covering full-length coat protein gene of Fny-CMV (lane 1), LS-CMV (lane 2), ER-PSV (lane 3) and Tr-PSV (lane 4), respectively. Electrophoresis was carried out on 1.
- DsRNA 분석. Tr-PSV에 감염된 N. benthamiana 잎으로부터 dsRNA를 추출하여 전기영동으로 패턴을 비교 분 석하였다. DsRNA의 추출은 Morris와 Dodds(1979)의 방법을 이용하였으며, 주출한 dsRNA는 6% polyacrylamide gel 에서 1XTAE 완충액 (40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 2mM EDTA, pH 7.
- RT-PCR 및 제한효소지도. Tr-PSV에 감염된 N. benthamiana의 잎을 채취하여 total RNA를 주줄하고, 이를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. Total RNA의 추출은 Choi 등(1998>의 방법을 이용하였으며, RT-PCRe Cucumoviruse- 이적 프라이머 (CPTALL-5: 5' T/CAG/CT/CTTTG/TAA/ GGGTTCAATTCC3', CPTALL-3: 3'GCCGATTTTACCA GTCAG5)를 이용하여 실시하였다(Choi 등, 1999).
- 1)를 채집하여 total RNA를 추출하고, Cucumovirus 특이적 프라이머(Choi 등, 1999)를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 예상된 약 950bp 크기의 cDNA가 검출되었다. 따라서 클로버의 모자이크 증상을 일으킨 병원을 Cucumovius의한 종으로 예측하고, 바이러스의 분리 동정실험을 실시하였다. 즉 채취한 토끼풀의 이병엽을 0.
- 01M 인산완충액과 카보런덤을 이용한 즙액접종법으로 실시하였다. 바이러스를 접종한 지표식물은 25-3CTC의 온실에 3주 이상 관리하면서 접종엽 및 상엽에 발현되는 병징을 관찰하였다. 이때 무병징으로 감염된 경우를 검정하기 위하여 병징이 발현되지 않은 식물에 대해서는 RT-PCR검정을 통하여 감염유무를 판정하였다.
- 전형적인 모자이크 증상을 나타낸 토끼풀로부터 Peanut stunt vMs(PSV)를 분리하여 Tr-PSV로 명명하였다. 이 연구에서는 Tr-PSV의 특성을 기주반응, 혈청학적 성질, dsRNA 분석, RT-PCR 및 RFLP 분석 등을 통하여 지금까지 잘 알려진 ER-PSV Fny-CMV 및 LS-CMV와 비교하였다. Tr- PSV는 접종한 Nicotiana속 식물에서는 모두 전신감염되 었으며, C.
- benthamiana의 이병엽 즙액을 Chenopodium amaranticolore\ 전개엽에 접종한 결과 접종 3일 후에 선명한 퇴록병반이 형성되었다. 이들 병반으로부터 단일병반을 분리하여 N. benthamiana6^ 접종하는 방법을 2회 실시한 다음, 전신 감염된 N. benthamiana를 공시 바이러스 원으로 사용하였다. 한편 N.
- 한편 Tr-PSV의 서브그룹을 동정하기 위하여, 이들 PCR산물을 제한효소 EcoRI, MspI, Sall 및 Xhol으로 처리한 후, agarose gel에서 전기영동하여 제한 효소 절단 패턴을 분석하였다(Singh 등, 1995; Choi 등, 1999). 이때 Tr-PSV RNA3의 3' 영역에 대한 염기서열의특성을 비교하기 위하여, 앞에서 공시한 ER-PSV와 Fny- CMV의 RT-PCR산물 이외에 CMV의 서브그룹 Ⅱ에 속하는 LS-CMV의 cDNA에 대한 RFLP패턴도 함께 비교하였다. 그 결과 Tr-PSV로부터 대조바이러스로 이용한 PSV 나 CMV계통들과 유사한 분자 크기의 cDNA가 증폭되었 다(데이터는 제시하지 않음).
- 바이러스를 접종한 지표식물은 25-3CTC의 온실에 3주 이상 관리하면서 접종엽 및 상엽에 발현되는 병징을 관찰하였다. 이때 무병징으로 감염된 경우를 검정하기 위하여 병징이 발현되지 않은 식물에 대해서는 RT-PCR검정을 통하여 감염유무를 판정하였다.
- unguiculata)에 전신감염 되는데 반해서 CMV는 접종엽에 국부병반을, 그리고 TAV는 감염되지 않기 때문에 Cucumoviruse-^} 3종 바이러스를 구별할 수 있는 기주로 활용할 수 있다는 보고(Kaper와 Waterworth, 1981)와도 일치하였다. 이상의 결과로부터 토끼풀에서 분리한 바이러스를 Tr-PSV로 명명하고 이하의 실험을 실시하였다.
- Kurotanesanzaku를 공시하여 기주범위와 병징 특성을 조사하였다. 접종은 0.01M 인산완충액과 카보런덤을 이용한 즙액접종법으로 실시하였다. 바이러스를 접종한 지표식물은 25-3CTC의 온실에 3주 이상 관리하면서 접종엽 및 상엽에 발현되는 병징을 관찰하였다.
- benthamianae 잎을 PBS에서 마쇄한 즙액을 마이크로튜브에 넣고 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상청액을 항원으로 사용하였다. 침강반응은 실온에서 14시간 정치 후 나타난 침강대를 관찰하였다. 그 결과 Tr-PSV의 항원은 ER-PSV 항혈청에 대해서 한 종의 침강대를 형성하였으며, 대조로 이용한 ER- PSV의 항원에 의해서 형성된 침강선과 융합하였다(Fig.
- 2% agarose gel에서 1XTBE 완충액으로 전기영 동하여 검출하였다. 한편 Tr-PSV의 서브그룹을 동정하기 위하여, 이들 PCR산물을 제한효소 EcoRI, MspI, Sall 및 Xhol으로 처리한 후, agarose gel에서 전기영동하여 제한 효소 절단 패턴을 분석하였다(Singh 등, 1995; Choi 등, 1999). 이때 Tr-PSV RNA3의 3' 영역에 대한 염기서열의특성을 비교하기 위하여, 앞에서 공시한 ER-PSV와 Fny- CMV의 RT-PCR산물 이외에 CMV의 서브그룹 Ⅱ에 속하는 LS-CMV의 cDNA에 대한 RFLP패턴도 함께 비교하였다.
대상 데이터
- ER-PSV의 항혈청을 이용하여 Ouchterlony 법으로 Tr-PSV의 혈청학적 성질을 조사하였다. 한천겔은 1%의 agarose를 0.15M NaCl을 포함하는 0.01M 인산완충액 (PBS)에 녹여 제조하였으며, Tr-PSV, ER-PSV 및 Fny- CMV에 감염된 N. benthamianae 잎을 PBS에서 마쇄한 즙액을 마이크로튜브에 넣고 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상청액을 항원으로 사용하였다. 침강반응은 실온에서 14시간 정치 후 나타난 침강대를 관찰하였다.
- benthamiana를 공시 바이러스 원으로 사용하였다. 한편 N. benthamiana에 증식시킨 ER- PSV와 Fny-CMV(Cucumber mosaic uZrws)를 이 실험의 대조바이러스로 이용하였다. Cucumovirus 중 Tomato aspermy virus (TAV)는 콩과식물에서 보고된 예가 없기 때문에 대조 바이러스로 공시하지 않았다.
이론/모형
- benthamiana 잎으로부터 dsRNA를 추출하여 전기영동으로 패턴을 비교 분 석하였다. DsRNA의 추출은 Morris와 Dodds(1979)의 방법을 이용하였으며, 주출한 dsRNA는 6% polyacrylamide gel 에서 1XTAE 완충액 (40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 2mM EDTA, pH 7.8)으로 전기영동한 후, ethidium bromide로 염색하여 UV illuminator로 밴드를 관찰하였다. 그 결과 Tr-PSV에 감염된 N.
- 혈청학적 성질. ER-PSV의 항혈청을 이용하여 Ouchterlony 법으로 Tr-PSV의 혈청학적 성질을 조사하였다. 한천겔은 1%의 agarose를 0.
- benthamiana의 잎을 채취하여 total RNA를 주줄하고, 이를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. Total RNA의 추출은 Choi 등(1998>의 방법을 이용하였으며, RT-PCRe Cucumoviruse- 이적 프라이머 (CPTALL-5: 5' T/CAG/CT/CTTTG/TAA/ GGGTTCAATTCC3', CPTALL-3: 3'GCCGATTTTACCA GTCAG5)를 이용하여 실시하였다(Choi 등, 1999). PCR 산물은 1.
성능/효과
- Tr-PSV에 감염된 N benthamiana 잎으로부터 추출한 dsRNA는 대조의 PSV나 CMW와 유사한 분자 크기의 4종의 dsRNA가 확인되었고, satellite RNA의 존재는 인정되지 않았다. Cucumovirus 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시킨 PCR산물은 약 950 bp 의 cDNA가 얻어졌고, 이를 이용하여 조사한 RFLP패턴 은 ER-PSV와 같았다. 이와 같은 RFLP 분석과 Er-PSV의 항혈청을 이용한 혈청학적 성질의 결과로부터 Tr-PSV는 ER-PSV와 같은 서브그룹 I에 속하는 PSV의한 계통으로 판단되었다.
- 그러나 동부에서는 대조로 이용한 ER-PSV와 마찬가지로 전신감염되어 , 접종엽에 국부병반을 형성하는 대조의 CMV계통과는 구분되었다. Tr-PSV에 감염된 N benthamiana 잎으로부터 추출한 dsRNA는 대조의 PSV나 CMW와 유사한 분자 크기의 4종의 dsRNA가 확인되었고, satellite RNA의 존재는 인정되지 않았다. Cucumovirus 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시킨 PCR산물은 약 950 bp 의 cDNA가 얻어졌고, 이를 이용하여 조사한 RFLP패턴 은 ER-PSV와 같았다.
- 이때 Tr-PSV RNA3의 3' 영역에 대한 염기서열의특성을 비교하기 위하여, 앞에서 공시한 ER-PSV와 Fny- CMV의 RT-PCR산물 이외에 CMV의 서브그룹 Ⅱ에 속하는 LS-CMV의 cDNA에 대한 RFLP패턴도 함께 비교하였다. 그 결과 Tr-PSV로부터 대조바이러스로 이용한 PSV 나 CMV계통들과 유사한 분자 크기의 cDNA가 증폭되었 다(데이터는 제시하지 않음). 한편 Tr-PSV의 cDNA를 이용하여 4종의 제한효소처리에 따른 RFLP패턴을 조사한 결과, 모두 ER-PSV의 절단패턴과 같게 나타났으며, 대조로 이용한 CMV의 계통들과는 차이를 보였다(Fig.
- 8)으로 전기영동한 후, ethidium bromide로 염색하여 UV illuminator로 밴드를 관찰하였다. 그 결과 Tr-PSV에 감염된 N. gWzRosa로부터 추출한 4종 의 dsRNA가 확인되었으며, 분자의 크기 및 종수에 있어서 대조로 이용한 ER-PSV나 Fny-CMV와 차이를 나타내지 않았다(Fig. 3). 일반적으로 분절 게놈을 갖는 RNA바 이러스의 경우, dsRNA검출법은 바이러스의 특성을 파악 하는데 매우 효과적 이다(Dodds, 1993).
- 침강반응은 실온에서 14시간 정치 후 나타난 침강대를 관찰하였다. 그 결과 Tr-PSV의 항원은 ER-PSV 항혈청에 대해서 한 종의 침강대를 형성하였으며, 대조로 이용한 ER- PSV의 항원에 의해서 형성된 침강선과 융합하였다(Fig.4). 그러나 대조로 이용한 Fny-CMW의 항원은 PSV항체 에 대해서 침강선을 형성하지 않았다.
- 이들 혈청형 간 반응의 특징은 Ouchterlony test에서 각각의 항체에 대해서 서로 분지선을 갖는 침강대가 형성된다. 따라서 이 실험에서 분리한 Tr-PSV의 혈청형은 대조로 공시한 ER-PSV(serotype I)와 융합하는 침강대를 형성한 것으로 보아 serotype I에 속하는 PSV의 계통이라는 것을 시사하였다.
- 그러나 Nicotiana속의 식물에서는 모자이크 증상이 전반적으로 약하게 발현되는 성질을 나타냈으나, 대조로 이용한 ER-PSV나 Fny-CMV의 감염과 마찬가지로 전신 감염되었다. 따라서 이와 같은 기주반응의 결과를 검토해 보았을 때, 토끼풀에서 분리한 바이러스는 PSV의한 계통인 것으로 판단되었다. 특히 PSV는 동부(V.
- 2). 또한 C. amaranticolor의 접종엽에 형성된 병반도 퇴록반점으로 발현되어 괴사반점을 형성하는 CMV와 확실하게 구별되었다. 그러나 Nicotiana속의 식물에서는 모자이크 증상이 전반적으로 약하게 발현되는 성질을 나타냈으나, 대조로 이용한 ER-PSV나 Fny-CMV의 감염과 마찬가지로 전신 감염되었다.
- 바이러스의 분리. 모자이크 증상의 토끼풀 이병주(Fig.1)를 채집하여 total RNA를 추출하고, Cucumovirus 특이적 프라이머(Choi 등, 1999)를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 예상된 약 950bp 크기의 cDNA가 검출되었다. 따라서 클로버의 모자이크 증상을 일으킨 병원을 Cucumovius의한 종으로 예측하고, 바이러스의 분리 동정실험을 실시하였다.
- 토끼풀에서 분리한 Cucumoviruse] 기주반응 특성을 Table1에 정리하였다. 이 결과로부터 토끼풀에서 분리한 바이러스의 기주반응은, 대조로 이용한 Fny-CMV 보다는 ER- PSV에 의해서 발현된 병징과 매우 유사하게 나타났다. 특징적인 것은 동부에서 접종엽에 전형적인 괴사반점을 형성하는 CMV와 다르게, 접종엽에서는 퇴록반점이 나타나면서 상엽에 모자이크 증상을 발현하는 특성을 보였다(Fig.
- Cucumovirus 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시킨 PCR산물은 약 950 bp 의 cDNA가 얻어졌고, 이를 이용하여 조사한 RFLP패턴 은 ER-PSV와 같았다. 이와 같은 RFLP 분석과 Er-PSV의 항혈청을 이용한 혈청학적 성질의 결과로부터 Tr-PSV는 ER-PSV와 같은 서브그룹 I에 속하는 PSV의한 계통으로 판단되었다. 국내에서 토끼풀로부터 PSV가 분리 동정된 것은 이 논문이 처음이다.
- 0)으로 마쇄한 후 5-6엽기의 Nicotians benthamiana에 접종하여 증식시켰다. 접종 10일 후 전신 감염된 N. benthamiana의 이병엽 즙액을 Chenopodium amaranticolore\ 전개엽에 접종한 결과 접종 3일 후에 선명한 퇴록병반이 형성되었다. 이들 병반으로부터 단일병반을 분리하여 N.
- 이 결과로부터 토끼풀에서 분리한 바이러스의 기주반응은, 대조로 이용한 Fny-CMV 보다는 ER- PSV에 의해서 발현된 병징과 매우 유사하게 나타났다. 특징적인 것은 동부에서 접종엽에 전형적인 괴사반점을 형성하는 CMV와 다르게, 접종엽에서는 퇴록반점이 나타나면서 상엽에 모자이크 증상을 발현하는 특성을 보였다(Fig. 2). 또한 C.
- 그 결과 Tr-PSV로부터 대조바이러스로 이용한 PSV 나 CMV계통들과 유사한 분자 크기의 cDNA가 증폭되었 다(데이터는 제시하지 않음). 한편 Tr-PSV의 cDNA를 이용하여 4종의 제한효소처리에 따른 RFLP패턴을 조사한 결과, 모두 ER-PSV의 절단패턴과 같게 나타났으며, 대조로 이용한 CMV의 계통들과는 차이를 보였다(Fig. 5). 이와 같은 Tr-PSV의 RFLP패턴으로부터 Tr-PSV는 서브그룹 I에 속하는 PSV의 계통으로 판단되었다.
후속연구
- 한편 국내에서는 황색모자이크 병징의 토끼풀로부터 Bean yellow mosaic v, s(BYMV)가 분리 동정되었을 뿐(류 등, 1986), 아직까지 PSV의 자연 감염에 관한 연구는 없는 상황이다. 따라서 이 논문은 토끼풀에서 분리한 PSV에 관한 국내의 첫 보고이며, 금후 PSV의 자연 감염기주로서 토끼풀의 역할 등에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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